Здесь мы представляем протокол, с помощью дрозофилы сенсорного нейрона - дендритных арборизация (da) нейронных травмы модель, которая сочетает в себе в естественных условиях живут изображений, два фотона лазерного axotomy/dendriotomy и мощный летать генетических элементов, как Платформа для отбора потенциальных промоутеров и ингибиторов neuroregeneration.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Дрозофилы In Vivo травмы модель для изучения Neuroregeneration в периферической и центральной нервной системы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Количество поврежденных нейронов отрастания управляет neuroregeneration и функциональное восстановление после травмы нервной системы. За последние несколько десятилетий были определены различные внутренние и внешние ингибирующих факторов в ограничение регенерации аксона. Однако просто удалив эти ингибирующих сигналов недостаточно для успешной регенерации, указывающие на дополнительные механизма регулирования. Drosophila melanogaster, плодовая муха, разделяет эволюционно сохранены генов и сигнальных путей с позвоночных животных, включая человека. Сочетание мощного генетических элементов мух с двух фотона лазерного axotomy/dendriotomy, мы опишем здесь дрозофилы сенсорные нейрон – дендритных арборизация (da) модель нейрона травмы как платформы для систематического досмотра для Роман Регенерация регуляторы. Вкратце эта парадигма включает в себя) подготовку личинки, индукция b) поражением dendrite(s) или axon(s) с использованием двух фотона лазерного, c) живой конфокальный изображений после травмы и d) анализа данных. Наша модель позволяет высокую воспроизводимость травмы одного помечены нейронов, аксонов и дендритов четко определенных нейронов подтипы, в периферической и центральной нервной системы.
Введение
Неспособность аксоны восстанавливаться после травмы центральной нервной системы (ЦНС), может привести к постоянной инвалидности в больных, а также играет роль в необратимое неврологического дефицита в нейродегенеративных заболеваний1,2 ,3,4,5. CNS окружающей среды, а также способность внутреннего роста нейронов, определяет ли аксоны способны восстанавливаться после травмы. Было показано, что внеклеточных факторов от олигодендроциты, астроглиальных и фибробластический источников препятствуют нейрональных ро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка культуры пластин и бутылки
- Подготовка плиты агара виноградного сока
- Добавьте 10 g агар порошок, 200 мл виноградного сока и 192 мл ddH2O в стакан и СВЧ для около 4-5 мин, помешивая периодически до тех пор, пока полностью не растворится агар.
- В Зонта охладьте вниз решение около 60 ° C. Добавление 4.2 мл этанола 95% и 4,0 мл уксусной кислоты кристаллизированной. Отрегулируйте общий объем раствора до 400 мл с ddH2O. Mix хорошо.
- Для каждой пластины 35-мм добавьте около 2-3 мл раствора. Сделайте около 120-150 пластины для в общей сложности 400 мл раствора агар виноградный сок.
- Ждать 10 ми....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Да нейронов шоу дифференциального регенерации потенциал между периферической и центральной нервной системы, а также специфики класса. Это обеспечивает уникальные возможности для новых факторов, которые требуются для регенерации аксона (с помощью класса IV PNS травмы), а также те, которые ингибирующее для регенерации (с травмы ЦНС IV класса и класса III PNS травмы).
Регенерации аксона в ПНС
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При настройке покупать кресты, количество самок и самцов используемые может варьироваться в зависимости от генотипов и количество личинок, необходимые для конкретных экспериментов. Для WT мух типичный кросс использует 10 женщин и 5 мужчин. Окно коллекции может быть сокращен, в зависимости от точности требуемого возраста личинок. Например 2-h коллекции период даст личинок более однородной популяции. В этом случае использование 20 или более девственница самок настроить кресты поможет принести достаточно яйца. Доходность от.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим Джессика Гольдштейн для технической поддержки. Работа в лаборатории песня финансируется NIH Грант R00NS088211 и интеллектуальный и отклонениями в исследовательский центр (IDDRC) новой программы развития премии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Диэтиловый эфир, реагент ACS, безводный | Acros Organics | AC615080010 | |
| галокарбон 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS), 20x Концентрат, pH 7,5, поставщик # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Порошок агара, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Виноградный сок | Welch' s | ||
| Этанол 95% (Реагент Спирт 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Уксусная кислота | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Пропионовая кислота | J.T.Baker | U33007 | |
| Обложки Очки: прямоугольники | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 мм x 22 мм |
| Zeiss LSM 880 лазерный сканирующий микроскоп | Zeiss | ||
| Программное обеспечение Zen | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
Ссылки
- Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewic....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
