Summary
Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.
Abstract
Para a avaliação de um novo agente terapêutico para imunoterapia ou vacinação, análise de ativação de células imunes nos tecidos linfáticos é essencial. Aqui, nós investigamos os efeitos imunológicos de um imunoestimulante romance lipídios-DNA em forma de nanopartículas de rotas diferentes de administração no mouse: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa. Essas injeções influenciará diretamente a resposta imune e colheita de tecidos linfáticos e análise de ativação de células dendríticas (DC) nos tecidos são partes cruciais dessas avaliações. A extração dos linfonodos mediastinais (mLNs) é importante mas bastante complexo devido ao tamanho e localização deste órgão. É descrito um procedimento gradual para colheita do baço, mLN e linfonodo inguinal (iLN) e análise de ativação de DC por citometria de fluxo.
Introduction
Avanços em imunologia e nanomateriais têm levado a uma abundância de potenciais novas estratégias terapêuticas para aplicações em biomedicina, incluindo imunoestimulação e entrega da droga. Otimização da rota de administração é um aspecto vital que afectam a eficácia dos agentes immunostimulatory. Uma nanopartícula immunostimulatory (INP) que consiste de DNA é um adjuvante de nano-imune recém-desenvolvido Self montado por microfases separação devido à estrutura anfifílica de lipídios-DNA1. Portanto, os protocolos para INP envolvendo a administração do material1 no vivo através de diferentes rotas e três procedimentos para colheita de tecidos apropriados como o linfonodo inguinal (iLN), mediastinal LN (mLN) e baço, são descrito. Finalmente, estes tecidos foram analisados para a ativação de células dendríticas (DC), as células apresentadoras mais poderosas no sistema imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a avaliação de antígenos, anticorpos ou outro adjuvantes imunes2.
Nós testamos a formulação do INP, porque é um agente que tem mostrado grande promessa. INP é um receptor Toll-like 9 (TLR9) material adjuvante que contém ácidos nucleicos, para qual avaliação de imunoestimulação eficácia é necessária para teste de injeção diferentes métodos3. Neste contexto, a estimulação de DCs é um ponto de extremidade potente para avaliação na vivo . Depois de moléculas do antígeno ou immunostimulatory são fagocitadas por DCs no sangue ou tecidos periféricos, essas células migram para órgãos linfoides como o baço e o LNs4,5. Assim, ativação de DC foi analisada no baço, mLN dos animais injetados e iLN. Corretamente colheita desses tecidos, portanto, é também crucial para avaliar a resposta imune para um romance de adjuvante ou patógenos5. Essa colheita de tecido também é importante para o desenvolvimento de uma metodologia imunológica romance como uma terapia de câncer. Além disso, este protocolo pode ser usado para verificar a eficiência de outras drogas, tais como vírus de imunodeficiência humana terapêutica6.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais, incluindo o isolamento de manipulação, sacrifício e órgãos animal foram realizados em estrita conformidade com as regras do Comité de uso no centro clínico de saúde pública de Shanghai e Asan Medical Center e cuidado do Animal Internacional. O protocolo de estudo foi aprovado pelas respectivas comissões sobre a ética de experimentos Animal no centro clínico de saúde pública de Shanghai (Mouse protocolo número: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).
1. preparação do Material
Nota: Um nano-adjuvante, INP, composto por uma transportadora de lipídios-DNA Self montado, ou seja U4T, e contendo oligonucleotide de CpG-motivo, eCpG, foi empregado no atual estudo para testar a rota de injeção apropriado para vacinação e imunoterapia em camundongos2 . Importante, outras moléculas terapêuticas potenciais como antígenos, anticorpos e agentes adjuvante podem ser substituídas pelo INP e testaram utilizando a mesma metodologia descrita abaixo.
- INP formulação2,4,7
- Recoze a U4T (160 µM, transportadora) com eCpG (80 µM, contendo uma sequência de agonista TLR9) na presença de 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e MgCl2 (2 mM). O volume padrão para recozimento é entre 50 e 110 µ l em um tubo PCR. Aquecer a mistura a 95 ° C por 10 min e em seguida, refresque lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C, usando um thermocycler. O protocolo de recozimento requer aproximadamente 2 h.
Cuidado: O líquido contendo U4T é muito espumoso e deve ser manuseado com cuidado. - Fazer 50 alíquotas µ l da preparação INP; Use 50 µ l do material para cada injeção.
Nota: No caso de 100 µ l por injecção, repita a etapa 1.1 com cálculo adequado dos ingredientes.
- Recoze a U4T (160 µM, transportadora) com eCpG (80 µM, contendo uma sequência de agonista TLR9) na presença de 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e MgCl2 (2 mM). O volume padrão para recozimento é entre 50 e 110 µ l em um tubo PCR. Aquecer a mistura a 95 ° C por 10 min e em seguida, refresque lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C, usando um thermocycler. O protocolo de recozimento requer aproximadamente 2 h.
2. general Animal procedimentos
Nota: Os métodos alternativos para lidar com os ratos podem ser usados dependendo dos requisitos de laboratório e protocolos aprovados animal8. O tipo de ratos usado é camundongos C57BL/6 e fêmeas de 6 semanas de idade.
- Lista de materiais
- Preparar o líquido anestésico (isoflurano), máquina anestésica, câmara de inalação de dióxido de carbono (CO2), gaze esterilizada, fórceps, retenção de rato, luvas, enganchado fórceps, tesoura de dissecação de 1 polegada, tesoura dissecação de 2 polegadas, álcool para esterilização e seringa de insulina.
- Anestesia inalantes
Nota: A anestesia é obrigatória para intranasal, subcutânea, Whitney e injeções intravenosas de ratos9. Uma câmara de indução com um tanque de máquina e oxigênio vaporizador ligado é usada para este procedimento.- Colocar o animal na câmara de indução e certifique-se de fechar bem a tampa.
- O oxigênio a 1 L/min de fluxo e definir a configuração de vaporizador com um nível de indução de 4% de isoflurano.
- Variar o tempo de exposição de animais na câmara, dependendo do peso do animal; no entanto, mais de 10 s de exposição e de acompanhamento a cada 5 min é necessário para anestesia10.
Nota: Sem pedal reflexo indica sucesso anestesia. - Desligue o indutor de isoflurano e fluxo de 1 L/min de oxigênio para evitar a exposição pessoal ao gás de isoflurano.
- Sacrifício
- Preparar uma câmara para CO2 inalação de sacrifício em conformidade com o NIH "orientações para a eutanásia de roedores usando dióxido de carbono"11.
- Resposta de mordaça de teste para confirmar que o animal é totalmente sacrificado.
- Verifique se que o mouse é sacrificado beliscando a ponta do seu pé e confirmando sem resposta de mordaça. Se houver uma resposta, repita o passo 2.2.
- Desinfecção
- Desinfecte todas as áreas de superfície usadas para injeções ou dissecções com spray de álcool e gaze esterilizada.
- Armazenamento de órgão
- Use a pinça para remover toda a gordura e sangue que rodeiam os órgãos. Guarde estes tecidos colhidos individualmente em uma placa de Petri preenchida com 3 mL de PBS. O recipiente e a mídia pode ser diferentes dependendo dos requisitos do procedimento subsequente.
3. injeção rotas
- Use os métodos de injeção de seis para investigar respostas imunes de injeção-dependente: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa8,12,13.
4. isolamento de linfonodos e baço
Nota: Usar ratos magros jovens e saudáveis (6 semanas de idade) para esses procedimentos, porque as gorduras que se acumulam tipicamente em torno de gânglios linfáticos em ratos mais velhos são difíceis de remover e pode impedir a visualização adequada do órgão.
- Etapas pré-colheita
Nota: Esta seção descreve a pós-injeção de colheita do iLN, baço e mLN de ratos para a análise de estimulação imune. Consulte os passos de 2.3-2.5 para sacrifício, amordaçar a resposta e métodos de desinfecção.- PIN dos membros do rato para a placa de espuma cirúrgica e esterilizar o lado ventral do mouse com etanol a 70%.
- Escolha um local 2 cm acima da área genital e uso viciado fórceps para puxar para cima a tampa exterior da pele, como uma tenda. Fazer um corte de aproximadamente 1 cm neste local e deslize a tesoura (2 polegadas) debaixo da pele, tornando ainda mais cortes de dissecação.
- Para o tegumento, corte verticalmente através da pele exterior com ambos os braços da tesoura (2 polegadas). Expor os órgãos internos cobertos com peritônio.
- Pino, a camada exterior da pele.
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Isolamento do linfonodo inguinal (iLN)
- Localize a iLN no lado esquerdo da perna seguindo a conjunção da embarcação de sangue descendo a perna esquerda, que aparece como uma letra inclinada 'Y'.
Nota: Para os ratos injetados por via subcutânea, escolha uma iLN do mesmo lado do local da injeção. - Descobri a camada com duas pinças para arrancar a camada lipídica coberto e colher a iLN amarela pálida (forma de feijão, 2 mm). Para posterior tratamento e armazenamento do tecido, consulte Etapa 2.6.
- Localize a iLN no lado esquerdo da perna seguindo a conjunção da embarcação de sangue descendo a perna esquerda, que aparece como uma letra inclinada 'Y'.
-
Isolamento do baço 14
- Faça uma tenda no centro do peritônio, usando viciado fórceps em uma mão e usar pequenas fina tesoura (1 polegada) na outra mão para cortar o peritônio.
- Pinça de uso viciado na mão esquerda para agarrar o intestino e vire-a para localizar o baço como feijão vermelho (comprimento de cerca de 14 mm) anexado ao lado superior esquerdo do abdômen do mouse.
- Puxe delicadamente o baço com outro conjunto de pinça na mão direita enquanto desanexando outros órgãos com a pinça de viciado. Siga o passo 2.6 para armazenar o baço.
Nota: Cuidado é necessário ao colher o baço, como é um órgão macio facilmente danificado.
-
Isolamento do linfonodo mediastinal (mLN)
Nota: O mLN está localizado a aproximadamente 1 cm abaixo das costelas e é coberto por outros órgãos como o coração e os pulmões. Devido à sua localização e tamanho pequeno, é importante expor cuidadosamente a área circundante, usando pinças e tesouras (1 polegada).- Corte o diafragma e destacá-lo partir as costelas. Segure o corpo das costelas com fórceps e em seguida, corte o lado esquerdo e direito das costelas com tesouras (1 polegada). Coloque as costelas corte por cima do ombro do rato o direito de expor o coração e os pulmões.
Nota: tenha cuidado para não cortar qualquer um dos vasos sanguíneos ao redor do coração e pulmões, como vazando sangue torna difícil localizar o minúsculo mLN translúcido. Se qualquer os vasos sanguíneos são cortados, suavemente, absorva o sangue na área com gaze. - Usando fórceps viciado na mão direita, vire o coração e os pulmões suavemente para a direita até a espinha dorsal é exposta. Use um par de pinças regulares na mão esquerda para remover a iLN com a pinça viciada na mão direita para ajudar com esta colheita.
- Pegue os pulmões e lançá-los até a espinha dorsal é amplamente exposta. O mLN (uma translúcido em forma de feijão estrutura de aproximadamente 2 mm em tamanho) está localizado entre os pulmões e a coluna vertebral.
- Utilize o fórceps enganchadas para expor a área em torno do mLN e a outra pinça para extrair o tecido.
Nota: O mLN está rodeado por inúmeros outros tecidos que devem ser cuidadosamente removidos com pinça antes da colheita. - Consulte a etapa 2.7 para instruções em armazenar o mLN colhido.
- Corte o diafragma e destacá-lo partir as costelas. Segure o corpo das costelas com fórceps e em seguida, corte o lado esquerdo e direito das costelas com tesouras (1 polegada). Coloque as costelas corte por cima do ombro do rato o direito de expor o coração e os pulmões.
5. preparação das amostras para citometria de fluxo
Nota: Para ensaiar a ativação das DCs no iLN colhida e baço, mLN, suspensões de célula única desses tecidos estão manchadas com anticorpos conjugados a fluorescência como DC específicos marcadores moléculas coestimulatórias e histocompatibilidade complexas moléculas e analisadas por citometria de fluxo.
-
Preparação de suspensões de célula única: baço
- Adicionar 5 mL de meio de cultura fresco (CM) num prato de 6mm cultura e colocar as amostras no gelo.
- Remover os tecidos circundantes, sangue e gordura e coloque o tecido na tampa do prato a cultura.
- Corte os tecidos em pequenos fragmentos (< 1 mm) com uma tesoura curva. Suspender os fragmentos em PBS, seguido por girando para baixo o tecido usando uma centrífuga a 646 × g por 5 min e retirar o sobrenadante.
- Suspender as amostras novamente em 3 mL de CM e digerir os fragmentos com 200 µ l de solução de 2% fetal de soro bovino (FBS) suplementado com colagenase IV por 20 min.
- Homogeneizar e incubar a amostra a 37 ° C por 1 h. filtrar os tecidos digeridos através de malha de nylon (100 nm) e girá-los para baixo. Lavar as células únicas em 5 mL de PBS e remover o sobrenadante por centrifugação.
- Ressuspender as células em 5 mL de solução de isolamento de célula. Carrega novamente outra camada de 5 mL da solução de isolamento de células claras para formar uma pilha de camada por camada aquosa.
- Centrifugue a preparação da célula em 2012 × g por 10 min. obter o sobrenadante, que é a fração de densidade mais leve (< 1,077 g/cm3), para análise de citometria de fluxo subsequente.
- Conte o número de células com um hemocytometer.
-
Preparação de suspensões de célula única: linfonodo
- Siga o passo 5.1.1-5.1.2.
- Adicione 5 mL de CM, usando uma pipeta de 10 mL para suspender as células pipetando 3 - 4 vezes. Após a suspensão completamente as células, usar o engranzamento de nylon estéril para filtrar as células para coleção em um tubo cônico de 15 mL.
- Girar as células para baixo a 646 ×g por 7 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
- Adicione um adicional 5 mL de CM em pipeta de 10 mL para melhor suspender as células pipetando.
- Lave com PBS e contar o número de células.
-
Análise de citometria de fluxo
- Alíquota de 0.5-1 × 106 células para cada célula de fluorescência-ativado classificação tubo (FACS).
- Centrifugar a 646 × g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Adicione 5 µ l de cada diluição fluorescência-conjugado anticorpo preparação para as células para re-suspender o centrifugado e vortex.
Nota: É importante proteger o centrifugado de exposição à luz, tanto quanto possível, porque os anticorpos fluorescente etiquetados são sensíveis à luz. Gerar uma mistura de mestre do anticorpo e sempre adicionar bloco Fc. - Prepare o buffer de FACS usando 100 µ l de PBS, 1% de FBS regular inactivadas pelo calor e 0,1% de azida de sódio.
- Coloque a amostra no tubo a 4 ° C por 30 min. enxaguar as células com 2-4 mL de FACS buffer e centrifugar a amostra a 1700 rpm para 7 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 500 µ l de tampão de FACS no escuro. Analise as células por citometria de fluxo.
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Representative Results
Para avaliar rotas de injeção apropriado do INP para ativação de tecido linfático DC, a população de DC como linhagem foi definida como –CD11c+ células no baço, iLN e mLN e analisados os níveis de expressão de moléculas coestimulatórias. Tratamento de INP por subcutânea (s.c.) e injeção intravenosa (i.v.) promoveu um aumento substancial na expressão CD40, CD80 e CD86 no baço e iLN DCs (Figura 2B e 2C). Whitney e injeção intraperitoneal (i.p.) de INP também consideravelmente acima-regulada que os níveis de expressão de CD40, CD80 e CD86 no baço e iLN DCs em comparação com a PBS-tratamento controle (Figura 2B e 2C). Em estimulada mLN DCs, intranasal (óssea) injeção de INP promoveu a maior regulação das moléculas coestimulatórias comparado no PBS-tratamento controle (Figura 2D). injeção i.p. e i.v. de INP também induzido marcado aumento da expressão da molécula co-estimulatória no mLN, enquanto oral, s.c., e injeção de Whitney de INP não induz a ativação do mLN DCs (Figura 2D).
Figura 1 : Localização do ponto de injeção intraperitoneal de Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Localização exata de injeção intravenosa Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Ativação de DC em linfáticas órgãos analisados por citometria de fluxo. Camundongos C57Bl/6 foram injetados com INP por seis rotas diferentes de injeção e 24h após a injeção, o baço, iLN e mLN foram colhidas. (A) a população de DC em células do tecido linfático foi definida como linhagem –CD11c+ células em leucócitos ao vivo. (B-D) Os níveis de expressão de CD40, CD80 e CD86 foram analisados por citometria de fluxo no baço (B), iLN (C) e mLN (D). Os dados são médias das análises de seis amostras independentes. Os resultados são expressos como meios ± erro padrão da média (SEM). A significância estatística das diferenças entre grupos experimentais foi calculada usando a análise de variância com Student não pareado t-teste. p-valores < 0.05 foram considerados significativos. * < 0.05, * * < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Muitos avanços em nanotecnologia e Imunologia foram obtidos através de pesquisas terapêuticas de entrega da droga e imunoestimulação. A seleção cuidadosa do método de injeção é conhecida por ser importante para imunoestimulação, que foi o foco do presente estudo.
Rotas de injeção diferentes foram avaliadas para um naturalmente atóxico e biodegradável baseado em DNA material, INP (immunostimulatory nanopartículas), para determinar qual rota rendeu o melhor resultado. Essa abordagem também é relevante para a entrega de outros agentes terapêuticos, incluindo anticorpos, antígenos ou outros adjuvantes.
Para analisar a resposta imune a tais injeções, colheita de tecidos linfáticos (baço, iLN e mLN) é necessária. Isolamento dos tecidos linfáticos é o aspecto mais crucial do presente protocolo e necessário o uso de uma técnica que não tem sido descrita anteriormente em detalhe. Além disso, a preparação da suspensão de célula única para analisar outras células do sistema imunológico não foi bem descrita. Este estudo centrou-se a extração dos tecidos linfáticos, particularmente o iLN mLN e baço, para a análise de ativação de DC. Ativação sistêmica da resposta imune ocorreu principalmente através de células do sistema imunológico no baço. Além disso, as respostas imunes no tecido específico eram controladas pelos linfonodos vizinhos. Avaliação de moléculas moduladora imunológica recentemente desenvolvidas deve ser conduzida para determinar se as moléculas podem induzir a estimulação imune nos tecidos. Portanto, o método de isolamento do tecido linfático e análise de ativação DC nos tecidos pode ser usado para moléculas estimulatórios imunes recentemente desenvolvidas.
Para avaliar o efeito estimulatório imune do INP, o baço, mLN e iLN foram colhidas e INP foi mostrado para promover a ativação de DC linfática. Conforme determinado anteriormente, INP metas efetivamente TLR9 estimulação em DCs em ratos2. Os macrófagos também expressam citosólica TLR9 em camundongos. Portanto, injeção INP pode induzir a ativação tanto DC e macrófagos. No entanto, os macrófagos residem no tecido periférico que contribuem para a fagocitose de bactérias no tecido. Além disso, a capacidade de apresentação de antigénios e migratório efeito para o tecido linfático de macrófagos são comparativamente mais fracos do que aqueles em DCs. Portanto, avaliando a rota de injeção do INPs para o efeito estimulatório imune foi adequado para examinar DCs no tecido linfático.
Portanto, o modo de administração adjuvante imunológico deve ser cuidadosamente considerado para alcançar sucesso imunoterapia e vacinação usando materiais macios.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de descoberta de materiais criativo através da nacional pesquisa Fundação da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e futuro planejamento (NRF-2017M3D1A1039421) e pelo programa de biotecnologia Marinha financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, República da Coreia e uma concessão (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
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