Summary
Her presenterer vi en protokoll for generering av indusert pluripotent stamceller (iPSCs) fra Li-Fraumeni syndrom (AKU) pasienten avledede fibroblaster, differensiering av iPSCs via stamceller (MSCs) osteoblasts og modellering i vivo tumorigenesis bruker AKU pasient-avledede osteoblasts.
Abstract
Li-Fraumeni syndrom (AKU) er en autosomal dominant arvelig kreft lidelse. Pasienter med AKU er disponert for ulike typen svulster, herunder osteosarcoma - en av de mest primære ikke-hematologic malignitet i barndom og oppvekst. AKU gir derfor en ideell modell for å studere denne kreft. Utnytter iPSC metoder, AKU-assosiert osteosarcoma kan modelleres vellykket ved å skille AKU pasienten iPSCs til stamceller (MSCs), og deretter til osteoblasts - cellene i opprinnelse for osteosarcomas. Disse AKU osteoblasts recapitulate kreftfremkallende egenskaper osteosarcoma, gir en attraktiv modellsystem for skildre patogenesen av osteosarcoma. Dette manuskriptet viser en protokoll for generering av iPSCs fra AKU pasienten fibroblaster, differensiering av iPSCs til MSCs, differensiering av MSCs osteoblasts, og i vivo tumorigenesis bruker AKU osteoblasts. Denne iPSC sykdom modell kan utvides for å identifisere potensielle biomarkers eller terapeutisk mål for AKU-assosiert osteosarcoma.
Introduction
Mellom 2006 og 2007 førte flere gjennombrudd funn fra laboratoriene Dr. Shinya Yamanaka og James A. Thomson til utvikling av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs)1,2,3. Omprogrammere somatiske celler med definerte transcriptional faktorer til skjemaet iPSCs, forskerne kunne generere celler med viktige egenskaper nemlig, pluripotency og selvtillit fornyelse, som var tidligere antatt å bare finnes i menneskelige embryonale stamceller (hESCs). iPSCs kan genereres fra individ eller pasienten og måtte ikke være avledet fra embryo, vesentlig utvide repertoaret tilgjengelig sykdommer og bakgrunner for studier. Siden da har pasient-avledede iPSCs blitt brukt til recapitulate fenotypen av ulike menneskelige sykdommer, Alzheimers sykdom4 og amyotrofisk lateral sklerose5 lang QT syndrom6,7, 8.
Disse fremskrittene i iPSC forskning har også åpnet nye muligheter for kreftforskning. Flere grupper har nylig brukt pasienten iPSCs modell kreft utvikling under en utsatt genetisk bakgrunn9,10,11med vellykket program vist hittil i osteosarcoma9, leukemi10,11,12og endetarmskreft13. Selv om iPSC-avledet kreft modeller er fortsatt i sin barndom, har de vist stort potensial i phenocopying sykdomsassosierte malignitet, Klargjørende patologisk mekanismer, og identifisere terapeutiske forbindelser14.
Li-Fraumeni syndrom (AKU) er en autosomal dominant arvelig kreft lidelse forårsaket av TP53 germline mutasjon15. Pasienter med AKU er disponert for ulike typen malignitet inkludert osteosarcoma, gjør AKU iPSCs og deres avledet celler spesielt godt egnet til å studere denne malignitet16. En iPSC-baserte osteosarcoma modell først ble etablert i 2015 bruker AKU pasient-avledede iPSCs9 senere differensiert til stamceller (MSCs) og deretter til osteoblasts, de stammer cellene av osteosarcoma. Disse AKU osteoblasts recapitulate osteosarcoma-assosiert osteogenic differensiering defekter og kreftfremkallende egenskaper, demonstrere modellen potensielle som "bein svulst i en rett" plattform. Interessant, genomet hele transcriptome analyser åpenbare aspekter av en osteosarcoma genet signatur i AKU osteoblasts og som kjennetegner denne AKU gene expression profilen er korrelert med dårlig prognose i osteosarcoma9, som angir den potensialet i AKU iPSCs sykdom modeller å avsløre funksjoner kliniske relevans.
Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av hvordan du bruker AKU pasient-avledede iPSCs til modell osteosarcoma. Det detaljer generering av AKU iPSCs, differensiering av iPSCs MSCs og deretter til osteoblasts, og bruk av en i vivo xenograft modellen med AKU osteoblasts. AKU sykdom modellen består av flere fordeler, blant annet muligheten til å generere ubegrenset celler i alle stadier av osteosarcoma utvikling for mekanistisk studier, biomarkør identifikasjon og narkotikarelaterte screening9,14, 16.
Oppsummert tilbyr AKU iPSC-baserte osteosarcoma modellen en attraktiv komplementære system for fremme osteosarcoma forskning. Denne plattformen gir også en proof-of-concept for kreft modellering bruker pasient-avledede iPSCs. Denne strategien beskrevet nedenfor kan lett utvides til modell malignitet forbundet med andre genetiske lidelser med kreft predisposisjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette arbeidet ble godkjent av University of Texas Health Science Center i Houston (UTHealth) dyr velferd komiteen. Eksperimenter utføres i henhold med standardene etablert av UTHealth sentrum laboratoriet dyr medisin & Care (CLAMC) som er akkreditert av American Association for laboratoriet Animal Care (AAALAC International). Menneskelig fag i denne studien faller under scenariet en ("ingen menneskelig fag forskning") som definert ved NIH SF424 dokumentasjon. Derfor trenger det ikke noen godkjenning av UTHealth menneskelige forskning etikk.
1. generasjon AKU iPSCs (figur 1A)
- På dag -2, plate 2 x 104 AKU pasienten fibroblaster i en brønn av en 6-vel plate og kultur cellene med fibroblast medium (tabell 1) på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 inkubator. Kontroller at fibroblaster nå 50-60% samløpet ved signaltransduksjon (dag 0).
- Utføre Sendai virus signaltransduksjon dag 0. Dette Erstatt brukt mediet med forvarmes fibroblast medium. Tine den kommersielle Sendai virus omprogrammering kit (se Tabell for materiale) på is. Infisere AKU fibroblaster med blandet Sendai virus i henhold til produsentens instruksjoner.
- Vedlikehold av transduced cellene i fibroblast medium (dag 1-6):
- På dag 1, 24 timer etter transduction, fjerne fibroblast mediet som inneholder gjenværende Sendai virus og erstatte den med 2 mL frisk fibroblast medium. Kultur i transduced fibroblaster på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 inkubator.
- Endre mediet med fibroblast mediet annenhver dag fra dagen 2-6.
- Vedlikehold av transduced cellene i materen kultur tilstand (dag 7-28):
- Tilberede bestrålt CF1 mus embryonale fibroblast (MEF) kultur retter på dag 6. For å gjøre denne kåpen seks 100 mm vev kultur retter ved å legge til 5 mL av 0,1% hver plate ved romtemperatur for 30 min. Sug opp 0,1% gelatin etter belegg.
- Fjern MEFs fra flytende nitrogen beholder. Tine MEFs bruke kommersielt tilgjengelige tiner systemet etter produsentens instruksjoner. Plate cellene i gelatin-belagt plater med MEF/MSC kultur medium (tabell 1) på en seeding tetthet av rundt 6,7 x 105 celler per 100 mm vev kultur parabol.
- Vaksinere de transduced cellene i MEF plater (dag 7): Trypsinize transduced cellene med 1 mL av 0,25% Trypsin-EDTA per 100 mm parabolen for 2-4 min ved romtemperatur. Nøytralisere trypsin med 9 mL av fibroblast medium. Overføre cellene til konisk rør og sentrifuger 230 x g ved 37 ° C i 4 min. Plate transduced fibroblaster på seks MEF rettene tilberedt på dag 6 og kultur dem i 8 mL av fibroblast medium per fat.
Merk: Confluency av MEFs er rundt 20% før såing transduced celle MEF plater. - Dag 8, forkaste fibroblast mediet og erstatte med hESC medium (tabell 1).
- Vent til fremveksten av iPS kloner fra dager 9-28 (figur 1C). Endre brukt hESC mediet annenhver dag og overvåke fremveksten av iPS kloner under mikroskopet. Vent iPSCs kloner stor nok å bli observert av det blotte øye, og så fortsette å utvide iPS kloner i mater-fri kultur tilstand.
- Utvidelse av fremkom iPS kloner i mater-fri kultur tilstand (dag 29-79 ~ 99):
- For å klargjøre platen matrix-belagt, coat en 48-vel plate med 120 µL av kjelleren membran matrix belegg løsningen (tabell 1) per brønn. Kontroller at kjelleren membran matrix belegg løsningen dekker brønnen og strøk kultur parabol overflaten. La det ved romtemperatur for 1 h. leveringstanken belegg løsningen umiddelbart før bruk og legge 250 µL av hESC medium per godt med 2 µM ROCK hemmer Thiazovivin.
- På dag 28, Sug opp den brukte hESC mediet og vask iPS kloner med 1 x DPBS. Hente synlige iPS kloner med 1 mL pipette tips og overføring til et godt av en behandlet 48-vel plate (trinn 1.4.1). Frø one koloni per brønn av 48-vel plate.
- Sentrifuge platen 230 x g for 4 min å lette celle vedlegget. Kultur iPS kloner på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 inkubator.
- Neste dag (dag 29), fjerne brukte hESC mediet og legge 250 µL av kommersielt tilgjengelig iPSC medium i hver brønn.
- Opprettholde iPS kloner på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 inkubator, og endre iPSC mediet annenhver dag.
- Når iPS kloner nå 85% samløpet, subkultur celler på en 1:10 forholdet av kultur. Legg til 60 µL av kommersielle passaging løsningen koble cellene og ruge ved 37 ° C i 3 minutter.
- Frø halvparten av den frittstående iPSCs på en kjeller membran matrix-belagt 12-vel plate i 1 mL av hESC medium med 2 µM ROCK hemmer Thiazovivin. Kultur iPS kloner i en 12-vel plate med 1 mL av kommersielt tilgjengelig iPSC mediet per godt og subkultur iPSCs på en 1:10 forholdet til de når passasje 10.
Merk: iPSCs er sub kultivert hver 5-7 dager på en 1:10 forholdet. Det tar opptil 10 uker for iPS kloner nå passasje 10. iPSC karakteristikkene inkludert celle morfologi, alkalisk fosfatase (AP) aktivitet og uttrykk for pluripotency faktorer og hESC markører, blir gransket etter bekrefter fjerning av Sendai virus i iPSCs (vanligvis-viste etter rundt 10 passasjer) (figur 1B-E). Antistoff og primer om iPSC karakterisering finnes i tabell 2 og 4.
2. differensiering av AKU iPSCs til Mesenchymal stamceller (MSCs) (figur 2A)
- Kultur iPSC kloner på MEF plater i minst 2 uker (dag ~-14-0): lage MEF retter (100 mm vev kultur retter) som beskrevet tidligere (1.3.1 - 1.3.2). Opprettholde iPSCs hESC medium og endre medium annenhver dag. Når iPSCs nå 90% samløpet, subkultur iPSCs av 1:10 fortynning.
- Fjerning av MEFs fra iPSCs (dag 0):
- Etter å opprettholde iPSCs på MEFs i 2 uker, kultur iPSCs 100 mm vev kultur retter til cellene nå 80-90% samløpet. Fjerne brukte hESC mediet og vask iPSCs med 5 mL 1 x DPBS. Legg 1 mL av cellen avdeling løsningen koble cellene og ruge ved romtemperatur for 3 min.
- Legge til 9 mL MEF/MSC kultur medium til platen nøytralisere celle avdeling løsning aktiviteten og overføre frittstående cellene til en ny 100 mm vev kultur rett uten noen belegg.
- Inkuber cellene ved romtemperatur for 30 min å tillate MEFs å legge til platen.
- Nøye samle nedbryting som inneholder iPSCs og sentrifuge 230 x g på 4 ° C for 4 min.
Merk: Uforsiktig rødme plate nederst fører til avdeling av MEFs.
- Differensiering av iPSCs mot MSCs (dag 0 - 28):
- Coat tre brønner i en 6-vel-plate med 1 mL av 0,1% per brønn ved romtemperatur for 30 min.
- Fjern nedbryting av den samlede iPSCs fra 2.2.4.
- Resuspend iPSCs i 6 mL av MSC differensiering medium (tabell 1) og frø celler i tre belagt brønnene med 2 mL per brønn (dag 0).
- Endre MSC differensiering mediet annenhver dag for å fjerne fristilt og/eller døde celler (dag 1 - 28).
- Modning av iPSC-avledet MSCs (dag 28-45):
- Fjerne brukte MSC differensiering mediet og vask celler med 1 mL 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs med 0,5 mL 0,25% Trypsin-EDTA per brønn ved romtemperatur for 3 min.
- Nøytralisere trypsin av 1,5 mL MEF/MSC kultur medium og samle MSCs fra tre brønner i en 15 mL konisk tube. Sentrifuge 230 x g på 4 ° C for 4 min.
- Fjern nedbryting og resuspend MSCs i 3 mL MEF/MSC kultur medium og plate på én 60 mm 0,1% gelatin-belagt plate (dag 28).
- Kultur MSCs i MEF/MSC kultur medium og endre medium annenhver dag. Når cellene nå 100% samløpet, subkultur MSCs i 1:3 forholdet med 0,25% Trypsin-EDTA.
Merk: MSCs vise en fibroblast-lignende morfologi (figur 2B). Når MSCs vokser i en kompakt, kan langstrakt MSCs danne en virvel-liknende mønster (figur 2B). - Utføre den immunofluorescent flekker for å evaluere iPSC-avledet MSCs ved å undersøke MSC overflate markører CD44, CD73, CD105 og CD166 (figur 2C).
Merk: Fortynning av antistoffer er vist i tabell 2. Immunofluorescent farging av levende celler utføres i henhold til produsentens instruksjoner. - Etter bekreftelse, utvide MSCs i 1:3 forholdet 100 mm vev kultur retter. Fryse ned ampuller (3 flasker per 100 mm vev kultur parabol) bruker frysing mediet som inneholder 10% DMSO og 90% FBS.
Merk: For å berike befolkningen MSC, MSCs kan sorteres bruker CD105+, CD24-kriterier av flyt cytometri9,17. iPSC-avledet MSCs differensiert med metoden PDGF-AB-baserte vanligvis kan vedlikeholdes for 2-3 måneder i kultur uten tap av MSC identitet9. Fryse MSCs fra en tidlig passering nummer etter bekrefter MSC egenskaper.
3. differensiering av AKU MSCs til Osteoblasts (figur 3A)
- Utarbeidelse av MSCs for osteogenic differensiering (dag -1)
- For å sikre en tilstrekkelig mengde celler for å fullføre osteogenic differensiering protokollen, begynn med MSCs kultivert 100 mm vev kultur retter til 95% samløpet. Fjerne brukte kultur medium og vask MSCs med 5 mL 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs med 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA per 100 mm rett ved romtemperatur for 3 min. For å sikre cellene ikke er over trypsinized, stopper du trypsinization når 50% av cellen brøkdel er observert under mikroskopet.
- Nøytralisere trypsin av 9 mL MEF/MSC kultur medium og samle MSCs fra 3 brønner i en 15 mL konisk tube. Sentrifuge 230 x g på 4 ° C for 4 min.
- Sug opp nedbryting, resuspend MSCs i 5 mL av MSC medium og telle antall celler ved en hemocytometer.
- Plate riktig antall MSCs på en kultur plate.
Merk: Detalj av cellen tallene 12-vel plate, 6 vel-plate og 100 mm vev kultur retter oppsummeres i tabell 3.
- Induksjon av osteogenic differensiering av osteoblast differensiering medium (ODM) (tabell 1) (dag 0 - 24):
- Sug opp MEF/MSC kultur medium og Erstatt med riktig volumet av ODM (1 mL, 2 mL og 8 mL for hver brønn av 12-vel plate, hver brønn 6-vel plate og 100 mm vev kultur parabol, henholdsvis) å skille MSCs til osteoblasts (dag 0).
- Sug opp brukt ODM og Erstatt med riktig volumet av ODM annenhver dag under osteogenic differensiering prosessen.
- Utføre isoenzymer (AP) og Alizarin rød S (ARS) flekker for å oppdage bein-assosiert alkalisk fosfatase produsert av preosteoblasts og mineral avsetning produsert av eldre osteoblasts, henholdsvis dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 og 24 ( Finne 3B).
Merk: AP flekker og ARS flekker er utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelig kit etter produsent protokoll. - Undersøke uttrykk nivåene av preosteoblast og moden osteoblast markører (ALPL og COL1A1 for preosteoblasts; PTH1R og BGLAP for eldre osteoblasts) av qRT PCR (Figur 3 c).
Merk: Positiv AP flekker er forventet etter dag 9 av osteogenic differensiering og positiv ARS flekker kan forventes etter dag 21 av osteogenic differensiering. MSCs vokser i MEF/MSC kultur medium kan serveres som en negativ kontroll av AP flekker og ARS flekker.
4. Xenograft-modellen for å studere i Vivo Tumorigenesis av LFS MSC-avledet Osteoblasts (figur 4A)
- Differensiering av AKU MSCs til osteoblasts:
- Ætt 3-4.5 x 105 MSCs i 100 mm vev kultur parabol. Forberede fem retter en injeksjon.
- Kultur MSCs i ODM å skille MSCs til osteoblasts som beskrevet i 3.2 dag 14.
- Utarbeidelse av ulike osteoblasts for injeksjon:
- For å forberede osteoblast avdeling løsning (tabell 1), løses 1 g type II collagenase i 1000 mL av αMEM medium for å gjøre collagenase II løsningen (1 mg/mL). Holde collagenase II løsningen på 20 ° C. Bland 0,25% Trypsin-EDTA og collagenase II løsningen på en 1:1 ratio for å gjøre osteoblasts avdeling løsning.
- Fjerne brukte ODM og vask differensiert osteoblasts med 5 mL 1 x DPBS per 100 mm parabolen.
- Legge til 1,5 mL osteoblast avdeling løsning per 100 mm rett og ruge retter på 37 ° C for 30 min. undersøke og sikre osteoblast brøkdel av mikroskopi.
- Nøytralisere osteoblasts avdeling løsningen av ODM og samle de frittstående osteoblasts i et 50 mL konisk rør. Sentrifuger 230 x g på 4 ° C i 5 min.
- Fjern nedbryting og resuspend celler i 25 mL av ODM medium. Cellene passere en 70 µm celle sil for å fjerne oppsamlet celler. Telle celle tall ved hjelp av en hemocytometer.
- Forberede 1 x 107 osteoblasts per injeksjon og sentrifuger celler 230 x g på 4 ° C 4 min.
- Resuspend 1 x 107 osteoblasts i 50 µL iskald 1 x DPBS. Mix differensiert osteoblasts med 50 µL av fenol-rød gratis kjelleren membran matrix (osteoblasts suspensjon og kjelleren membran matrise ble blandet på en 1:1 ratio) og vedlikehold osteoblasts på is før injeksjon.
-
I vivo xenograft svulst modell av LFS MSC-avledet osteoblasts:
- Bedøve 8-uke-gamle kvinnelige immunsupprimerte NU NU mus i et kammer leverer 5% (v/v) inhaleres isoflurane i 1 L/min oksygen (fra CLAMC). Etter dyret blir liggende, bytte bedøvende levering systemet til nesen kjegle, leverer 2% (v/v) inhaleres isoflurane i 200mL/min oksygen (fra CLAMC). Overvåke dybden av anestesi ved å kontrollere hornhinnen og pedalbåter reflekser gjøre mus er tilstrekkelig anesthetized og ikke lider av ubehag under prosedyren.
- Desinfiser området skal injiseres med vekslende vattpinner av chlorhexidine og 70% isopropanol. Bruk 26 G p for å utføre subkutan injeksjon av kjelleren membran matrix-blandet AKU osteoblasts i ene bakbena 8-uke-gamle immunsupprimerte NU NU mus (figur 4A).
- Overvåke mus ved å utføre ukentlige palpasjon på injeksjon nettsteder for veksten av subkutan nodulær tettheter. Tumor formasjon kan observeres rundt 6-10 uker etter injeksjon (figur 4B).
- Euthanize musene av karbondioksid kvelning metoden etterfulgt av cervical forvridning. Dissekere den utviklede svulst. Bestemme svulst karakteren og differensiering indeks, preosteoblasts og moden osteoblasts ved ulike flekker metoder (f.eks Hematoxylin og Eosin (H & E) flekker, Picro Sirius røde flekker og von Kossa flekker henholdsvis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen presenterer prosedyrer inkludert AKU iPSC generasjon MSC differensiering, osteoblast differensiering og i vivo tumorigenesis analysen bruker AKU MSC-avledet osteoblasts.
Ordningen for generering av AKU iPSCs fra fibroblaster ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig Sendai virus omprogrammering kit er vist i figur 1A. Sendai virus-basert levering Yamanaka fire faktorer er ikke integrert reprogramming metode. Derfor bør stabil AKU iPSC kloner være gratis Sendai virus genomet og tap av ytre OCT4, SOX2, KLF4 og c-MYC effekter av transgener, som kan bli undersøkt av RT PCR bruker bestemte primere (figur 1B). Som det er antydet i produsentens instruksjoner, avhenger generasjon av Sendai virusfri iPSCs både kultur og passasje. Under beskrives kultur betingelser i denne protokollen, kan fjerning av Sendai virus i iPSCs vanligvis bli oppdaget etter 10 passasjer (figur 1B). De etablerte AKU iPSC Klonene bør exhibit typisk hESC morfologi og Vis positiv AP aktiviteten (figur 1 c). AKU iPSCs svært express pluripotency faktor mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4og REX1), sammenlignes med hESC H1 linje og mye høyere enn foreldre fibroblaster (figur 1 d). Uttrykk for pluripotency faktorer (NANOG, OCT4) og hESC markører (SSEA4 og TRA-1-81) kan også undersøkes ved immunofluorescent flekker (figur 1E).
iPSCs vedlikeholdes på MEFs i minst 14 dager før den starter MSC differensiering (figur 2A). Selv om mange celledød skje under MSC differensiering, masser av differensierte celler er synlige på celle kultur plate og fibroblast-lignende MSCs ved kanten av cellen massene kan observeres på dag 28. (Figur 2B). Etter sub dyrking differensierte celler i MEF/MSC kultur medium, differensiert MSCs spre seg raskt og Vis fibroblast-lignende morfologi rundt dag 35, gradvis representerer en avlang form og danne en virvel-liknende mønster på dag 40 (figur 2B ). Differensiert AKU MSCs uttrykke MSC markører, inkludert CD44, CD73, CD105 og CD166 ved immunofluorescence flekker (figur 2C).
Figur 3A skisserer osteoblastic differensiering. Når MSCs er utsatt for osteogenic differensiering signaler, starter de differensierte cellene viser positive alkalisk fosfatase aktivitet på dag 9 (figur 3B). ARS flekker kan brukes til å oppdage mineral deponering produsert av eldre osteoblasts. Den lyse røde fargen flekker i stedet for brun farge flekker angir et positivt resultat av ARS flekker, som kan observeres etter dag 21 (figur 3B). De unike osteoblasts Vis økende uttrykket preosteoblast gener (ALPL og COL1A1) og moden osteoblast gener (BGLAP og PTH1R) under osteogenic differensiering.
I vivo xenograft modell kan etableres ved å injisere subcutaneously AKU MSC-avledet osteoblasts i NU NU mus (figur 4A). Svulster kan observeres 6-10 uker etter injeksjon (figur 4B). AKU osteoblast-avledet svulstene vist umodne osteoblast egenskaper, positive AP aktiviteten (AP flekker), positiv kollagen matrix avsetning (picrosirius røde flekker) men negative mineralisering (von Kossa flekker) (figur 4C) .
Figur 1 : iPSC generasjon fra AKU pasienten fibroblaster. (A) skjematisk diagram iPSC generasjon. (B) RT PCR påvisning av Sendai virus genomet og effekter av transgener (KOS (KLF4, OCT4, og SOX2), KLF4, og c-MYC) i omprogrammeres iPSC klone etter 10 passasjer (venstre) og fibroblast etter infeksjon dag 11 (høyre, positiv kontroll). AKU iPSC clone er Sendai virusfrie etter 10 passasjer. GAPDH vises som internkontroll. (C) celle morfologi av AKU iPSCs og AP flekker. Skala bar, 50 µm (D) qRT-PCR NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4og REX1 mRNA uttrykk i AKU iPSCs. hESC H1 linje og foreldrenes AKU fibroblaster brukes som en positiv og en negativ kontroll, henholdsvis. MRNA uttrykket er normalisert GAPDH uttrykk. Relativ mRNA uttrykket er tilpasset hESC H1 linje som 1. (E) Immunostaining hESC pluripotent transkripsjonsfaktorer (NANOG og OCT4) og hESC overflate markører (SSEA4 og TRA-1-81) i AKU iPSCs. Skala bar, 50 µm. Fortynning av antistoffer som er brukt i denne studien er vist i tabell 2. Primer sekvensene er vist i Tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Differensiering av AKU iPSCs til MSCs. (A) skjematisk diagram av PDGF-AB-indusert MSC differensiering. (B) celle morfologi av AKU iPSC-avledet MSCs på differensiering dag 28, dag 36 og dag 40 +. Skala bar, 100 µm. (C) Immunofluorescence flekker viser at differensiert AKU MSCs ha CD44+, CD73+, CD105+, CD166+, og CD24- signatur. Skala for, 30 µm. Fortynning av antistoffer som er brukt i denne studien er vist i tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Differensiering av AKU MSCs til osteoblasts. (A) skjematisk diagram av osteogenic differensiering. (B) AP og ARS flekker er utført på forskjellige tidspunkt (dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 og 24). Osteoblastic differensiering av LFS MSC-avledet osteoblasts forventes å føre til positive AP flekker rundt dag 9 og positiv ARS flekker på dag 21. (C) den qRT PCR analyse viser økt uttrykk for pre osteoblast (ALPL og COL1A1) og moden osteoblast (PTH1R og BGLAP) gener under osteogenic differensiering. MRNA uttrykket er normalisert GAPDH uttrykk. Uttrykket nivåene var i forhold til celler på differensiering dag 0. Primer sekvensene er vist i Tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : I vivo tumorigenesis av LFS MSC-avledet osteoblasts. (A) skjematisk diagram av svulst xenograft av AKU osteoblasts. (B) NU NU mus bære AKU osteoblast-avledet tumorer etter 10 uker injeksjon. (C) AKU osteoblast-avledet svulster ble undersøkt av H & E, AP, picrosirius rød og von Kossa flekker for morfologi, bein-tilknyttede AP og kollagen mineralforekomster, henholdsvis. AKU-avledet svulstene representerer umodne osteoblast egenskaper viser positive AP aktiviteten, positiv kollagen og negative mineral mineralisering. Skala bar, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Fibroblast Medium (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| Inaktivert FBS | 50 mL |
| Antibiotics(pen/strep) (100 x) | 5 mL |
| Unødvendige aminosyre (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol | 3,5 ΜL |
| MEF/MSC kultur Medium (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| Inaktivert FBS | 50 mL |
| Antibiotics(pen/strep) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamin (100 x) | 5 mL |
| hESC medium (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384.5 mL |
| KnockOut Serum erstatning | 100 mL (total: 20%) |
| Unødvendige aminosyre (100 x) | 5 mL |
| Antibiotika (penn/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamin (100 x) | 5 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 ΜL |
| 2-Mercaptoethanol | 3,5 ΜL |
| MSC differensiering Medium (500 mL) | |
| KnockOut DMEM/F-12 eller DMEM/F-12 | 445 mL |
| KnockOut Serum erstatning | 50 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 µL (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 µg/mL) | 200 µL (10 ng/mL) |
| Unødvendige aminosyre (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol | 3,5 ΜL |
| Osteoblast differensiering Medium (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| Inaktivert FBS | 50 mL |
| 10 mM β-Glycerophosphate | 50 mL (1,08 g i 50 mL αMEM) |
| 0,1 µM deksametason (lysfølsom) | 10 µL av 5 mM deksametason |
| 200 µM askorbinsyre (lysfølsom) | 100 µL av 1 mM askorbinsyre |
| Antibiotika (penn/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Matrigel belegg løsning (50 mL) | |
| Kjelleren membran matrise | 2 mL |
| DMEM/F-12 (pre kaldt 4 ° C) | 48 mL |
| Osteoblast avdeling løsning (50 mL) | |
| 0.25% trypsin-EDTA | 25 mL |
| Collagenase II løsning (1 mg/mL) | 25 mL |
| Merk: Forberede osteoblast avdeling løsning frisk rett før bruk. Collagenase II løsning lagres på 20 ° C for inntil 6 måneder. | |
Tabell 1: Komposisjoner av fibroblast medium, MEF/MSC kultur medium, hESC medium, MSC differensiering medium, ODM og osteoblast avdeling løsning.
| Antistoff navn | Fortynning |
| NANOG | 1:500 |
| OCT4 | 1:300 |
| SSEA-4 PE-konjugerte | 1:600 |
| TRI-1-81 | 1:600 |
| Esel anti-geit IgG | 1:500 |
| Goat anti-kanin IgG | 1:500 |
| CD105 | 1:500 |
| CD44 | 1:500 |
| CD73 | 1:500 |
| CD166 | 1:500 |
| CD24 | 1:500 |
Tabell 2: Antistoffer fortynning.
| Kultur Plate | Såing tetthet | Analysen |
| 12-vel Plate | 0.67x104 celler per brønn | Alkalisk fosfatase flekker (AP farging) |
| Alizarin rød S flekker (ARS farging) | ||
| 6-vel Plate | 2 x 104 celler per brønn | RT PCR gjenkjenning |
| Preosteoblast markører: ALPL, COL1A1 | ||
| Eldre osteoblast markører: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm rett | 3 - 4.5x105 celler per plate | I vivo tumorigenesis |
Tabell 3: Seeding tettheten av MSCs for osteoblastic differensiering.
| Sendai Virus primere | |
| Mål | Primer sett |
| SeV | Frem: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Omvendt: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Frem: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Omvendt: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Frem: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Omvendt: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Frem: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Omvendt: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT PCR primere | |
| Mål | Primer sett |
| NANOG | Frem: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Omvendt: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Frem: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Omvendt: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Frem: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Omvendt: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Frem: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Omvendt: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Frem: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Omvendt: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Frem: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Omvendt: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Frem: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Omvendt: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Frem: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Omvendt: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Frem: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Omvendt: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tabell 4: Primer informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å oppnå høyere MSC differensiering effektivitet, er flere aspekter avgjørende. En er kultur tilstand iPSCs før du starter MSC differensiering. Protokollen presentert i manuskriptet er basert på tidligere studier 9,17. iPSCs må være kultivert på MEFs i minst 2 uker. Opprettholde iPSCs i god er forholdene på MEFs avgjørende for cellene til fest på den gelatin-belagt platen for MSC differensiering. En annen viktig aspekt er tettheten av iPSCs på MEFs før differensiering. 80 - 90% confluency av iPSCs er foretrukket å starte MSC differensiering. Overvekst av iPSCs vil svekke celle overlevelse under av differensiering. Det siste kritiske punktet er seeding tetthet når du starter MSC differensiering. I våre hender fremmer høyt tetthet iPSC vedlegg til gelatin-belagt plate. En 100 mm rett iPSCs kan bli sådd i tre brønner av 6-vel plate. Initiering av MSC differensiering av direkte resuspending og plating iPSCs i MSC differensiering medium produserer store påkjenninger på iPSCs, derfor noen ganger resulterer i alvorlige celledød etter seeding. Høy tetthet av iPSCs øker suksessrate på MSC differensiering.
I motsetning til MSC differensiering er osteoblastic differensiering prosessen enkel. For å oppnå reproduserbar differensiering resultater, sikre initiering MSC tallene er konsekvent. Resultatene av osteoblastic differensiering fra samme celle linje kan variere fra parti til parti, derfor definere differensiering for forskjellige linjer på samme tid vil gi mer komparative resultater blant grupper. Økningen av MSC tall forkorte differensiering prosessen angitt av positiv AP og ARS flekker på et tidligere tidspunkt. Også sørge for endring av ODM medium håndteres på en skånsom måte og kraftig vakuum sug system anbefales ikke sent differensiering Stadium (dag 18 - 24) på grunn av potensielle brøkdel av aggregert osteoblasts under kultur prosessen.
Differensierte osteoblasts brukes i vivo xenograft eksperimentet er osteoblasts på dag 14 differensiering tidspunktet. Osteoblasts senere enn dag 14 kan samle og være vanskelig å distansere på grunn av de store ansamlinger av collagens og andre bein matrix materialer produsert av osteoblasts. For å unngå problemer med osteoblast dissosiasjon, AKU MSCs kan bli sådd i 2 - 3 ganger høyere tetthet i innledes trinn av osteoblastic differensiering å lette osteoblast differensiering. AKU MSC-avledet osteoblasts kan avstand og samlet på dag 6-10 differensiering tidspunktet for i vivo tumorigenesis analysen på dag 6 - 7 differensiering tidspunkt. AKU xenograft svulst modellen viser AKU MSC-avledet osteoblasts recapitulate i vivo tumorigenic evne, noe som gir en alternativ plattform for å studere AKU-assosiert osteosarcoma.
Oppsummert gir en AKU iPSC-baserte osteosarcoma modellen en nyttig berette for osteosarcoma forskning. I tillegg til osteosarcoma lider AKU pasienter av ulike andre typer kreftformer som bløtvev sarkomspesialitet, brystkreft og hjernesvulst. Derfor AKU iPSC-baserte sykdom modeller kan utvides til å modellere andre AKU relatert malignitet. Kombinere AKU pasient-avledede iPSCs og konstruert mutant p53 (mutp53) hESCs18, AKU sykdom modell har også stor verdi i skildre patogenesen ved mutp53 tilknyttet malignitet og utvikle nye strategier målretting kreftfremkallende p5316.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
R. Z. støttes av UTHealth innovasjon for kreft forebygging forskning Training Program Pre-Doctoral fellesskap (kreftforebygging og Research Institute of Texas gi RP160015). JT støttes av Ke Lin programmet for første tilknyttet sykehus for Sun Yat-sen-universitetet. D.-F.L. er CPRIT forskeren i kreftforskning og støttes av NIH vei til uavhengighet Award R00 CA181496 og CPRIT prisen RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
- Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
- Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
- Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
- Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
- Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
- Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).
