Dit protocol beschrijft de chirurgische labyrinthectomy van een rat, die een handige methode is voor het bestuderen van het vestibulair systeem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chirurgische Labyrinthectomy van de Rat te bestuderen van het vestibulair systeem
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om te studeren het vestibulair systeem of het vestibulair compensatie-proces, zijn een aantal methoden ontwikkeld om te vestibulaire schade veroorzaken, met inbegrip van chirurgische of chemische labyrinthectomy en vestibulaire neurectomy. Chirurgische labyrinthectomy is een relatief eenvoudige, betrouwbare en snelle methode. Hier beschrijven we de chirurgische techniek voor labyrinthectomy van de rat. Een postauricular snede is gemaakt onder narcose bloot het externe auditieve kanaal en het tympanic-membraan, waarna het tympanic-membraan en de gehoorbeentjes worden verwijderd zonder de stijgbeugel. De slagader van de stijgbeugel, die gelegen tussen de stijgbeugel en het ovale venster is, een kwetsbare structuur is en moet worden bewaard met het oog op een duidelijke chirurgische veld. Een gat te fenestrate de vestibule is gemaakt met een 2.1-mm boor bur superieur aan de stijgbeugel. Vervolgens is 100% ethanol geïnjecteerd door dit gat en aanzuiging van meerdere malen. Zorgvuldige dissectie onder een microscoop en zorgvuldige bloeden controle zijn essentieel om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Symptomen van vestibulaire verlies, zoals nystagmus, hoofd kantelen en een afrollen, worden gezien onmiddellijk na de operatie. Detest stoel rotarod of rotatie kan worden gebruikt om het objectief en kwantitatief de vestibulaire functie wordt geëvalueerd.
Inleiding
Het vestibulair orgaan is essentieel voor evenwicht en oog controle. Een normale vestibulaire functie is afhankelijk van symmetrische afferent signalen van vestibulaire organen in de twee inner oren. Vestibulaire hypofunction of verlies induceert duizeligheid, nystagmus en posturale onevenwichtigheid. Na de acute schade herstelt de vestibulaire functie spontaan binnen enkele dagen, een proces dat bekend staat als vestibulaire compensatie1,2. De vestibulaire compensatie van statische tekorten is een proces van herstel aan het gebrek aan evenwicht van spontane rust activiteit tussen de ipsilaterale en contralaterale vestibulaire kernen gerelateerde. De vestibulaire compensatie van dynamische tekorten gebeurt hoofdzakelijk via sensorische en gedragsmatige vervangingen (met behulp van visuele of somatosensorische ingangen)3. Deze processen zijn aantrekkelijk voor neuronale plasticiteit studies4,5.
Een aantal methoden zijn ontwikkeld om te studeren het vestibulaire systeem en de mechanismen voor neuronale plasticiteit tijdens vestibulaire compensatie, zoals de chirurgische en chemische labyrinthectomy en vestibulaire neurectomy5,6 ,7,8. Vestibulaire neurectomy is een bepaalde manier voor het opwekken van volledige vestibulaire verlies, maar het is een moeilijker en invasieve procedure en veroorzaken schade aan de hersenen8,9. Deze methode vereist meer chirurgische vaardigheid en kost meer tijd dan het labyrinthectomy. Chemische labyrinthectomy, met inbegrip van gentamycine, arsanilate en tetracaïne, is makkelijker en betrouwbare resultaten10,11,12kan opleveren. Echter het slakkenhuis kan ook beschadigd en vestibulaire verlies kan ontwikkelen over tijd11. Bovendien zijn de effecten van de chemische stoffen op de hersenen, die moeten worden bewaard voor nauwkeurige evaluatie, onduidelijk. Chirurgische labyrinthectomy werd voor het eerst geïntroduceerd in dierproeven in 184215 en werd voor het eerst gemeld in de rat in 193616. Deze techniek wordt sindsdien gebruikt in veel dierlijke studies5,17,18,19. Chirurgische labyrinthectomy is een specifieke, betrouwbaar, en relatief eenvoudige methode. 13 , 14 bovendien de symptomen van vestibulaire schade worden gezien onmiddellijk na de operatie. Hier beschrijven we onze chirurgische techniek voor labyrinthectomy van de rat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie is uitgevoerd overeenkomstig de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), die is geaccrediteerd door de vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care International.
Opmerking: De experimenten werden uitgevoerd op de mannelijke ratten Sprague-Dawley (SD) van 7-8 weken oud (200/250 g). Elk dier was geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden voor 1 week vóór de aanvang van het experiment. De dieren waren ondergebracht in een temperatuur en vochtigheid-gestuurde kamer met een constante 12-h:12-h licht: donker cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.
1. Labyrinthectomy
- Dekking van de gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische instrumenten met een steriele zeem. Desinfecteer het operationele gebied met 70% ethanol. Gebruik een steriele draperen en handhaven van de steriele omstandigheden tijdens de operatie.
- Dragen van een jurk, maskeren (naar dekking neus en mond), cap (ter dekking van hoofd), en een paar van steriele handschoenen. De chirurgische instrumenten moeten alleen komen in contact met de steriele oppervlakken.
- Injecteren van tiletamine-zolazepam verdoving (40 mg/kg lichaamsgewicht) intramuscularly in de mediale dij of intraperitoneally, en xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) intramuscularly of intraperitoneally.
Opmerking: Andere vormen van narcose, met inbegrip van Isofluraan inademing, kunnen ook worden gebruikt. - Plaats de rat op een opwarming pad (aanvankelijk vastgesteld op 42 ° C). Glijmiddel oog zalf toepassen op beide ogen van de rat om te voorkomen dat oog droogheid terwijl onder verdoving.
- Plaats de rat aan de rechterkant. Het scheren van de vacht in het chirurgische gebied met tondeuses. Desinfecteer de site met 70% ethanol.
- 1% lidocaïne hydrochloride subcutaan injecteren in het linker retroauricular-gebied.
- Met behulp van een scalpel blad #15, maken een incisie van ~5.0 cm retroauricular. De spieren en fascia bloot het externe auditieve kanaal met Iris schaar (figuur 1A) te scheiden. Iets open het externe auditieve kanaal met behulp van het mes #15 of de Iris schaar (figuur 1B). Algemeen bloot de tympanic membraan (figuur 2A).
- Onder een microscoop (7,5 X of 12,5 X), door het tympanic membraan en de gehoorbeentjes met uitzondering van de stijgbeugel, met behulp van de verlostang te verwijderen. Losmaken van de spieren op de lambdoidal bergkam met het mes #15 of de Iris schaar (figuur 2B).
- Met behulp van een boor met lage snelheid (< 3000 rpm) met een diamant bur (2.1 of 1.4 mm), boor het tympanic bulla bot rond de plaats van grensoverschrijding van de nervus facialis (figuur 3A). Identificeer de stapedial slagader. Wees voorzichtig niet te beschadigen de stapedial slagader tijdens het boren.
- Blijven de vestibule superieur aan de stapedial slagader boren en blootstellen het ronde venster en het benige laterale semicircular kanaal. Open het laterale kanaal van de semicircular in de buurt van de Papil. Blijven boren in het vlak van de laterale semicircular-kanaal en boor de Papil van het superieure semicircular-kanaal.
- De inhoud van de vestibule met behulp van een 18-G of 22-G naald gecombineerd. Injecteren en gecombineerd 1 cm3 100% ethanol 3 x.
- Sluit de spieren en de huid in twee lagen met eenvoudige onderbroken hechtingen.
- Laat niet een dier zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Houd de rat warm, totdat het wakens met behulp van een verwarming pad of een warmte lamp. Na ontwaken, de rat te verplaatsen naar een afzonderlijke kooi in een ruimte met de gebruikelijke milieuomstandigheden.
- Beheren van antibiotica (b.v.Cefazoline 20 mg/kg, trimethoprim-sulfonamide 100 µL subcutaan, of penicilline 300.000 IU) zo nodig op dag 1; pijnstiller (niet een opioïde; bijvoorbeeld, Metacam 2 mg/kg, Carprofen 5 mg/kg subcutaan) kan ook worden gegeven.
2. sham chirurgie
- Uitvoeren dezelfde chirurgische en na chirurgische procedures (per sectie 1), voor de sham-operatie als een besturingselement, met inbegrip van de blootstelling van de externe auditieve canal en de tympanic membraan (stap 1.7), de verwijdering van het membraan van de tympanic en de gehoorbeentjes, en de detachement van de spieren aan de lambdoidal ridge (stap 1.8), maar niet het semicircular-kanaal openen of injecteren van ethanol.
3. Controleer het verlies van vestibulaire functie
Opmerking: Het verlies van vestibulaire functie kan worden geëvalueerd met behulp van beide tests gedrags- of vestibulaire functie. 13 , 17 , 18 behavioral tests omvatten de evaluatie van posturale asymmetrie en nystagmus.
- Identificeren van posturale asymmetrie waarin spontane of evoked vat-rollen, vallen aan de linkerkant, of bewegen terwijl leunend naar de lesioned kant18. Zie Video 1.
- Nystagmus identificeren door een visueel onderzoek van vrijwillige oog beweging. Wanneer de spontane nystagmus is afwezig in de rusttoestand, bladerdeeg lucht zachtjes over het hoofd van de dierlijke18. Zie Video 2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het succes van de operatie werd gevalideerd door gedrags tests. Alle dieren tentoongesteld het typische gedrag van een eenzijdige verlies van vestibulaire functie. Spontane vat-rolling bleek onmiddellijk na de operatie, die over het hoofd of een lichte aanraking aan het lichaam in de vroege herstelfase (Video 1) door een lucht-bladerdeeg wordt opgeroepen. 3 d na de operatie, de dieren verplaatst leunend naar de lesioned kant met af en toe valt aan de linkerkant. Spontane ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze techniek is een handige methode voor het maken van de plotselinge, permanente en volledig vestibulaire functie verlies. Dit kan worden gebruikt om te studeren vestibulaire pathologieën, zoals vestibulaire neuritis, een akoestische tumor en ziekte van Meniere. Talrijke studies hebben deze techniek gebruikt om te studeren de neuronale plasticiteit van vestibulaire kernen of de bijbehorende centrale proces5,17,18,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van gezondheid & welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI15C2651).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medische aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Bladen voor #7 scalpelhandgrepen, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | schachtdiameter: 2,3 mm, lengte: 44 mm, pakket van 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Chirurgische microscoop |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standaard punt 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Gerand 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: recht | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris schaar, het beste geschikt voor microdissectie onder hoge vergroting |
| Fine Iris Scissors: recht | Fine Science Tools | #14094-11 | Gemaakt van martensitisch roestvrij staal, gecombineerd met molybdeen en vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Biedt stabiliteit en controle voor onderzoekers die het nummersysteem gebruiken |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tipbreedte: 1 cm, gekarteld, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 kort, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Vervangende punt, recht mes, minimaliseert bloeding en biedt daarom een chirurgisch veld vrij van klemmen en hemostatieklemmen |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Krachtig koppel bij lage snelheid, beschikbaar met snelheids- of aan/uit voetschakelaar |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetische absorbeerbare steriele chirurgische hechting |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximale spreiding: 4,5 cm, 2 x 3 stompe tanden, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, Frankrijk | Tiletamine-zolazépam | |
| Rompun | Bayer | Xylazin | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
Referenties
- Curthoys, I. S., Halmagyi, G. M. Vestibular compensation: a review of the oculomotor, neural, and clinical consequences of unilateral vestibular loss. Journal of Vestibular Research. 5 (2), 67-107 (1995).
- Smith, P. F., Curthoys, I. S. Mechanisms of recovery following unilateral labyrinthectomy: a review. Brain Research. Brain Research Reviews. 14 (2), 155-180 (1989).
- Lacour, M., Helmchen, C., Vidal, P. P. Vestibular compensation: the neuro-otologist's best friend. Journal of Neurology. 263, Suppl 1. S54-S64 (2016).
- Darlington, C. L., Smith, P. F. Molecular mechanisms of recovery from vestibular damage in mammals: recent advances. Progress in Neurobiology. 62 (3), 313-325 (2000).
- Shinder, M. E., Ramanathan, M., Kaufman, G. D. Asymmetric gene expression in the brain during acute compensation to unilateral vestibular labyrinthectomy in the Mongolian gerbil. Journal of Vestibular Research. 16 (4-5), 147-169 (2006).
- Dutheil, S., Brezun, J. M., Leonard, J., Lacour, M., Tighilet, B. Neurogenesis and astrogenesis contribution to recovery of vestibular functions in the adult cat following unilateral vestibular neurectomy: cellular and behavioral evidence. Neuroscience. 164 (4), 1444-1456 (2009).
- Gunther, L., et al. N-acetyl-L-leucine accelerates vestibular compensation after unilateral labyrinthectomy by action in the cerebellum and thalamus. PLoS One. 10 (3), e0122015(2015).
- Pericat, D., Farina, A., Agavnian-Couquiaud, E., Chabbert, C., Tighilet, B. Complete and irreversible unilateral vestibular loss: a novel rat model of vestibular pathology. Journal of Neuroscience Methods. 283, 83-91 (2017).
- Cass, S. P., Goshgarian, H. G. Vestibular compensation after labyrinthectomy and vestibular neurectomy in cats. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 104 (1), 14-19 (1991).
- Vignaux, G., et al. Evaluation of the chemical model of vestibular lesions induced by arsanilate in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 258 (1), 61-71 (2012).
- Berryhill, W. E., Graham, M. D. Chemical and physical labyrinthectomy for Meniere's disease. Otolaryngologic Clinics of North America. 35 (3), 675-682 (2002).
- Morgenstern, C., Mori, N., Arnold, W. Experimental studies on the effect of labyrinth anesthesia. Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 237 (3), 255-261 (1983).
- Nadasy, G. L., Raffai, G., Feher, E., Schaming, G., Monos, E. A simple standard technique for labyrinthectomy in the rat: a methodical communication with a detailed description of the surgical process. Physiology International. 103 (3), 354-360 (2016).
- Hitier, M., Besnard, S., Vignaux, G., Denise, P., Moreau, S. The ventrolateral surgical approach to labyrinthectomy in rats: anatomical description and clinical consequences. Surgical and Radiologic Anatomy. 32 (9), 835-842 (2010).
- Flourens, M. J. Recherches experimentales sur les propriétés et les fonctions du système nerveux dans les animaux vertébrés. , Crevot. Paris. (1824).
- T'Ang, Y., Wu, C. F. The effects of unilateral labyrinthectomy in the albino rat. Chinese Journal of Physiology. 10, 571-598 (1936).
- Chang, M. Y., et al. MicroRNAs 218a-5p, 219a-5p, and 221-3p regulate vestibular compensation. Scientific Reports. 7 (1), 8701(2017).
- Bergquist, F., Ludwig, M., Dutia, M. B. Role of the commissural inhibitory system in vestibular compensation in the rat. The Journal of Physiology. 586 (18), 4441-4452 (2008).
- Cameron, S. A., Dutia, M. B. Cellular basis of vestibular compensation: changes in intrinsic excitability of MVN neurones. NeuroReport. 8 (11), 2595-2599 (1997).
- Park, M. K., Lee, B. D., Lee, J. D., Jung, H. H., Chae, S. W. Gene profiles during vestibular compensation in rats after unilateral labyrinthectomy. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 121 (11), 761-769 (2012).
- Yamamoto, H., Tominaga, M., Sone, M., Nakashima, T. Contribution of stapedial artery to blood flow in the cochlea and its surrounding bone. Hearing Research. 186 (1-2), 69-74 (2003).
- Potegal, M., Abraham, L., Gilman, S., Copack, P. Technique for vestibular neurotomy in the rat. Physiology & Behavior. 14 (2), 217-221 (1975).
- Tung, V. W., Burton, T. J., Dababneh, E., Quail, S. L., Camp, A. J. Behavioral assessment of the aging mouse vestibular system. Journal of Visualized Experiments. (89), e51605(2014).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I. Video-oculography in mice. Journal of Visualized Experiments. 65 (65), e3971(2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
