Summary
Этот протокол описывает хирургического labyrinthectomy крысу, которая является полезным методом для изучения вестибулярной системы.
Abstract
Для изучения вестибулярной системы или процесса вестибулярного компенсации, были разработаны ряд методов повредить вестибулярного аппарата, включая хирургические или химических labyrinthectomy и вестибулярные neurectomy. Хирургические labyrinthectomy представляет собой относительно простой, надежный и быстрый метод. Здесь мы описываем хирургической техники для labyrinthectomy крыса. Заушной разрез под общим наркозом для предоставления внешнего слухового канала и барабанной перепонки, после чего барабанной перепонки и косточек, удаляются без стремени. Стремя артерии, который расположен между стремени и овальное окно, является структурой уязвимых и должны быть сохранены для получения четких операционного поля. Отверстие для fenestrate прихожая производится с 2.1-мм сверло-Бур превосходит стремени. Затем 100% этанол вводится через это отверстие и наддува несколько раз. Дотошный диссекция под микроскопом и тщательный контроль свертываемости крови необходимы для получения надежных результатов. Симптомы вестибулярного потери, такие как нистагм, наклоняя голову и подвижного движения, видны сразу же после операции. Rotarod или ротации Председателя тест может использоваться для объективно и количественно оценить вестибулярной функции.
Introduction
Вестибулярные орган имеет важное значение для контроля баланса и глаз. Нормальной вестибулярные функции зависит от симметричной афферентные сигналы от вестибулярных органов в двух внутренний уши. Вестибулярные гипофункция или потери вызывает головокружение, нистагм и постурального дисбаланса. После острого повреждения вестибулярные функции восстанавливаются спонтанно в течение нескольких дней, процесс, известный как вестибулярная компенсации1,2. Вестибулярные компенсации статического дефицита является процесс восстановления, относящиеся к несбалансированности спонтанной активности отдыха между ипсилатерального и контралатерального вестибулярных ядер. Вестибулярные компенсации динамических дефицита достигается главным образом через сенсорные и поведенческих замен (с помощью визуального или соматосенсорная входов)3. Эти процессы являются привлекательными для пластичности нейрональных исследования4,5.
Ряд методов были разработаны для изучения вестибулярной системы и механизмы, лежащие в основе пластичность нейронов при вестибулярной компенсации, таких как хирургические и химических labyrinthectomy и вестибулярные neurectomy5,6 ,,78. Вестибулярные neurectomy является определенным образом побудить полной вестибулярного потери, но это более сложные и инвазивные процедуры и может вызвать повреждение мозга8,9. Этот метод требует больше хирургических навыков и занимает больше времени, чем labyrinthectomy. Химических labyrinthectomy, включая гентамицина, arsanilate и тетракаина, легче и может дать надежные результаты10,,1112. Однако улитки также может быть поврежден и вестибулярные потеря может развиваться с течением времени11. Кроме того воздействие химических веществ в мозге, который должен быть сохранен для точной оценки, являются неясными. Хирургические labyrinthectomy был впервые представлен в исследованиях на животных в 1842 году15 и впервые сообщалось в крыса в 1936 году16. Этот метод был использован с тех пор во многих животных исследования5,,1718,19. Хирургические labyrinthectomy является конкретной, надежный и относительно простой метод. 13 , 14 . Кроме того, симптомы поражения вестибулярного видны сразу же после операции. Здесь мы описываем наши хирургической техники для labyrinthectomy крыса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с институциональной животное уход и использование Комитета из Сеула Национальной университетской больницы (14-0148-C1A1), которая аккредитована ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход Международная.
Примечание: Были проведены эксперименты на крысах Sprague-Dawley (SD) 7-8 недель старых (200/250 g). Каждое животное было акклиматизировались в лабораторных условиях за 1 неделю до начала эксперимента. Животные были размещены в комнате под контролем температуры и влажности с константой 12-h:12-h свет: темные цикл с свободный доступ к продовольствию и воде.
1. Labyrinthectomy
- Обложка газобетона хирургических инструментов стерильной салфеткой. Продезинфицируйте зоне с 70% этиловом спирте. Используйте стерильные Пелерина и поддерживать стерильные условия во время операции.
- Носить платье, маска (для покрытия носа и рта), крышка (для покрытия головы) и стерильные перчатки. Хирургические инструменты только должны соприкасаться с стерильных поверхностей.
- Придать tiletamine-zolazepam анестезии (40 мг/кг массы тела) внутримышечно в медиальной бедра или внутрибрюшинно и ксилазина (10 мг/кг массы тела) внутримышечно или внутрибрюшинно.
Примечание: Другие общей анестезии, в том числе изофлюрановая ингаляции, могут также быть использованы. - Место крысы на потепление площадку (первоначально устанавливается при 42 ° C). Применять мазь смазка глаз на обоих глазах крысы предотвратить сухость глаз под наркозом.
- Место крысы на его правой стороне. Бритье мех в области хирургического с машинки для стрижки волос. Лечить сайт с 70% этиловом спирте.
- Inject 1% лидокаина гидрохлорида подкожно в левой заушной области.
- С помощью лезвием скальпеля #15, делают разрез заушные см ~5.0. Отдельных мышц и фасции, чтобы разоблачить внешний слуховой канал с диафрагмой ножницы (рис. 1A). Слегка откройте внешний слуховой канал с помощью лезвия #15 или Ирис ножницы (рис. 1B). Широко предоставляют барабанной перепонки (рис. 2A).
- Под микроскопом (7,5 X или 12,5 X) удалите барабанной перепонки и косточек за исключением стремени, используя пинцет. Отсоедините мышцы на хребте lambdoidal лезвие #15 или Ирис ножницами (рис. 2B).
- С помощью сверла на низкой скорости (< 3000 об/мин) с алмазным бором (2.1 или 1,4 мм), дрель барабанные буллы кости вокруг точки выхода лицевого нерва (рис. 3A). Определите stapedial артерии. Будьте осторожны, чтобы не повредить stapedial артерии в процессе бурения.
- Продолжить бурение прихожую превосходит stapedial артерии и разоблачить круглое окно и костлявые бокового канала. Откройте боковые полукружных канала вблизи ее ампула. Продолжить, бурение в плоскости бокового канала и сверлить ампула Улучшенный полукружных канала.
- Аспирационная содержимое вестибюль с помощью иглы 18-G или 22-G. Инъецируй и аспирационная 1 см3 100% этанола 3 x.
- Закройте мышцы и кожу в два слоя с простыми Прерванный швами.
- Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Согревались крысы до тех пор, пока она пробуждает, используя грелку или тепла лампы. После пробуждения, переместите крысы индивидуальной клетке в номере обычных условий окружающей среды.
- Применять антибиотики (например, Cefazoline 20 мг/кг, триметоприм сульфонамид 100 мкл подкожно, или пенициллин 300 000 МЕ) на день 1; анальгетик (не опиоидом; например, Metacam 2 мг/кг, Carprofen 5 мг/кг подкожно) также может быть задано.
2. Шам хирургии
- Для хирургии Шам, как элемент управления, выполните те же хирургические и послеоперационные процедуры (в соответствии с разделом 1), включая воздействие на внешний слуховой канал и барабанной перепонки (шаг 1.7), удаление барабанной перепонки и косточки и отряд мышц на lambdoidal хребта (шаг 1.8), но не открывайте полукружных канала и придать этанола.
3. Проверьте потеря вестибулярные функции
Примечание: Потеря вестибулярные функции можно оценить с помощью тестов любой поведенческих или вестибулярной функции. 13 , 17 , 18 поведенческие тесты включают в себя оценки постурального асимметрии и нистагм.
- Определите постуральной асимметрия, которая включает в себя спонтанное или вызвала баррель прокатки, падение на левой стороне, или передвигаться во время склоняется в сторону пораженного18. Смотрите видео 1.
- Идентифицировать нистагм путем визуального осмотра движения добровольных глаз. Когда спонтанный нистагм отсутствует в состоянии покоя, слоеное воздуха нежно на голову животного18. Смотрите видео 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успех операции был подтвержден поведенческие тесты. Все животные выставляются типичное поведение односторонних потери вестибулярной функции. Спонтанное подвижного ствола проявляется сразу же после операции, будучи вызваны слоеного воздуха над головы или легкого прикосновения к телу на раннем этапе восстановления (1 видео). 3 d после операции, животных, переехал вокруг склоняется в сторону пораженного иногда падает на левой стороне. Спонтанный нистагм наблюдалось в течение 2 d (2 видео). В течение 3 d было отмечено вызвала нистагм.
Операции обычно требуется < 30 мин. В течение 50 кабинетов 2 крысы умерли во время операции и 3 в 1 d хирургии. В целом уровень потерь составила 10% (5 смертей во время/после 50 операций). Все случаи смерти были вызваны травмой stapedial артерии. Мы отметили, что смерти нет задержки и отсутствие инфекции в течение 1 недели. За несколько дней после операции крысы могут exhibit бедных устные потребление и потеря веса.
Рисунок 1: пост аурикулярных разрез левого уха. (A) A заушной разрез был сделан, и лицевого нерва (↑) была выявлена между височной мышцы (*) и sternomastoid мышцы (†). (B) затем, внешний слуховой канал (↑) был открыт слегка и хряща наружного уха была отделена от пирамидальной кости. Линейки шкалы 2 мм применяется для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: воздействие костные стенки прихожая. (A) после открытия внешний слуховой канал широкий, молот (*) был замечен под барабанной перепонки. (B) после удаления барабанной перепонки и косточек (за исключением стремени), была выявлена улитковый мыс (*) и мышцы на хребте lambdoidal повышенный (†). Линейки шкалы 2 мм применяется для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: вестибулярные фенестрации. (A) после того, как была пробурена удаление задней боковой стенке барабанной полости, кость вокруг точки выхода лицевого нерва. Подвергаются stapedial артерии (↑) и круглое окно (Δ) выше улитковый мыс (*). (B) после того, как бурение, боковой притвор, ампула полукружных каналов проявился в вестибулярных остаток (↑), как было уступает место мыса кохлеарного (*). Линейки шкалы 2 мм применяется для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. Спонтанное баррель подвижного. Крыса SD, который подвергся labyrinthectomy 2 d ранее показало, спонтанное баррель прокатки. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2. Спонтанный нистагм. Крыса SD, который подвергся labyrinthectomy 2 d ранее показал спонтанный нистагм. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод является полезным метод для создания потери внезапной, постоянного и полного вестибулярной функции. Это может использоваться для изучения вестибулярной патологии, например, вестибулярный неврит, акустических опухоли и болезнь Меньера. Многие исследования использовали этот метод для изучения пластичность нейронов вестибулярных ядер или соответствующий центральный процесс5,,1718,19.
The Most критические шаги для успешной операции являются 1) сохранение stapedial артерии, 2) тщательно бурения в точное положение и 3) тщательный контроль свертываемости крови. Большой заушной разрез может вызвать большие внешние раны, которые нарушают движение ногой на стороне лечение. Однако небольшой разрез ограничивает операционного поля и вызывает операцию, чтобы занять больше времени. Надлежащее опровержение имеет важное значение для поддержания достаточно хирургических мнение13. После заушной разрез лицевого нерва могут быть определены выше буллы и между двубрюшной мышцы и мышцы ключично, работает передней книзу на лицо. Заушные артерии и больше ушной нерв выполняются в противоположном направлении. Любые повреждения лицевого нерва вызывает паралич лицевого после процедуры. Для достижения широкой хирургические вид и избежать травмы артерии стремени, мы предпочитаем удалить Улучшенный внешний слуховой канал стены и затем подход превосходит стремени артерии17,19. Этот подход связан с большим риском инфекции по сравнению с вентролатеральные подход, который не имеет открытие внешнего слухового канала стены или удаление барабанной перепонки (который предоставляет среднего уха для внешнего окружающей среды). По нашему опыту, долгосрочных осложнений (общей продуктивности животных, кормления и выпивая привычки, возобновление веса и ВИЧ-статуса) не отличаются особенно между животными, подвергается пациента подход, описанный здесь и 17,вентролатеральные подход20. Открытие буллы может повредить грудинной мышцы, а иногда и результат в некоторых кровотечение. Рат стремени артерии пересекает недалеко от сайта вестибулярного фенестрации. В организме человека однако, стремя артерии исчезает во время эмбриогенеза. При узкой операционного поля, это не легко контролировать кровотечение, и поля можно быстро заполнить кровью. Чтобы избежать этого, некоторые авторы коагулировать стремени артерии прежде чем отверстие. Хотя его роль является не ясно, некоторые авторы предпочитают не свертывается стремени артерии14 , потому что он может поставлять внутреннего уха, центральной нервной системы (коленчатого ганглия, медиальной lemniscus и трапециевидные тело) и лицевого нерва в крыса14 ,21. Если кровотечение происходит, мы сжимать артерии с небольшой ватным тампоном, а затем использовать электрической коагуляции с достаточной всасывания.
Малогабаритные Берр полезен для сделать отверстие в вестибюле. Маленький крючок или иглы могут использоваться вместо заусенцев. Механическая буровая система приводит к менее порозность травмы и помогает получить устойчивые результаты. Без орошения этанола мы наблюдали переменной поведенческих реакций после13,labyrinthectomy17. Этанол ирригации и всасывания убедитесь, что лабиринт безнадежно повреждены. 13 тупым электрической коагуляции вестибулярного нерва может быть осуществляется через это отверстие22. Важно правильное увеличение и микроскопа является обязательным в большинстве случаев.
Среднего и внутреннего уха также поврежден во время labyrinthectomy, что приводит к глухоте. Существует не способ сохранения внутреннего уха безопасно. Химические labyrinthectomy можно сохранить слух животного, но дает различные результаты8. Вестибулярные neurectomy может также привести к повреждению улитковый нерва8. Чтобы выполнить операцию Шам в контрольной группе, мы удалили барабанной перепонки и косточек без стремени, что привело к мягким Кондуктивная слуха без любой вестибулярного ущерб13.
Несколько тестов поведенческих и вестибулярные функции могут использоваться для подтверждения, что labyrinthectomy был успешно выполнен13,14. Сразу же после процедуры может наблюдаться перекоса отклонение глаз. После восстановления от наркоза можно увидеть спонтанный нистагм, подвижного движения и наклона головы. Вращение на хвост висит это самый надежный тест17,20. Эти дефициты медленно выздоравливают в течение нескольких дней17,20. Спонтанный нистагм с быстрое движение в противоположную сторону, исчезнут в течение 3-4 d после процедуры. Наклон головы будет оставаться в течение нескольких месяцев. Вестибулярные функции тестов, например тест стул вращения или rotarod теста, может обеспечить более объективную и количественные данные23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грант от Кореи медицинских технологий R & D проекта через Корея здравоохранения промышленности развития института (ХИДИ), финансируемая министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
- Curthoys, I. S., Halmagyi, G. M. Vestibular compensation: a review of the oculomotor, neural, and clinical consequences of unilateral vestibular loss. Journal of Vestibular Research. 5 (2), 67-107 (1995).
- Smith, P. F., Curthoys, I. S. Mechanisms of recovery following unilateral labyrinthectomy: a review. Brain Research. Brain Research Reviews. 14 (2), 155-180 (1989).
- Lacour, M., Helmchen, C., Vidal, P. P. Vestibular compensation: the neuro-otologist's best friend. Journal of Neurology. 263, Suppl 1. S54-S64 (2016).
- Darlington, C. L., Smith, P. F. Molecular mechanisms of recovery from vestibular damage in mammals: recent advances. Progress in Neurobiology. 62 (3), 313-325 (2000).
- Shinder, M. E., Ramanathan, M., Kaufman, G. D. Asymmetric gene expression in the brain during acute compensation to unilateral vestibular labyrinthectomy in the Mongolian gerbil. Journal of Vestibular Research. 16 (4-5), 147-169 (2006).
- Dutheil, S., Brezun, J. M., Leonard, J., Lacour, M., Tighilet, B. Neurogenesis and astrogenesis contribution to recovery of vestibular functions in the adult cat following unilateral vestibular neurectomy: cellular and behavioral evidence. Neuroscience. 164 (4), 1444-1456 (2009).
- Gunther, L., et al. N-acetyl-L-leucine accelerates vestibular compensation after unilateral labyrinthectomy by action in the cerebellum and thalamus. PLoS One. 10 (3), e0122015 (2015).
- Pericat, D., Farina, A., Agavnian-Couquiaud, E., Chabbert, C., Tighilet, B. Complete and irreversible unilateral vestibular loss: a novel rat model of vestibular pathology. Journal of Neuroscience Methods. 283, 83-91 (2017).
- Cass, S. P., Goshgarian, H. G. Vestibular compensation after labyrinthectomy and vestibular neurectomy in cats. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 104 (1), 14-19 (1991).
- Vignaux, G., et al. Evaluation of the chemical model of vestibular lesions induced by arsanilate in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 258 (1), 61-71 (2012).
- Berryhill, W. E., Graham, M. D. Chemical and physical labyrinthectomy for Meniere's disease. Otolaryngologic Clinics of North America. 35 (3), 675-682 (2002).
- Morgenstern, C., Mori, N., Arnold, W. Experimental studies on the effect of labyrinth anesthesia. Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 237 (3), 255-261 (1983).
- Nadasy, G. L., Raffai, G., Feher, E., Schaming, G., Monos, E. A simple standard technique for labyrinthectomy in the rat: a methodical communication with a detailed description of the surgical process. Physiology International. 103 (3), 354-360 (2016).
- Hitier, M., Besnard, S., Vignaux, G., Denise, P., Moreau, S. The ventrolateral surgical approach to labyrinthectomy in rats: anatomical description and clinical consequences. Surgical and Radiologic Anatomy. 32 (9), 835-842 (2010).
- Flourens, M. J. Recherches experimentales sur les propriétés et les fonctions du système nerveux dans les animaux vertébrés. , Crevot. Paris. (1824).
- T'Ang, Y., Wu, C. F. The effects of unilateral labyrinthectomy in the albino rat. Chinese Journal of Physiology. 10, 571-598 (1936).
- Chang, M. Y., et al. MicroRNAs 218a-5p, 219a-5p, and 221-3p regulate vestibular compensation. Scientific Reports. 7 (1), 8701 (2017).
- Bergquist, F., Ludwig, M., Dutia, M. B. Role of the commissural inhibitory system in vestibular compensation in the rat. The Journal of Physiology. 586 (18), 4441-4452 (2008).
- Cameron, S. A., Dutia, M. B. Cellular basis of vestibular compensation: changes in intrinsic excitability of MVN neurones. NeuroReport. 8 (11), 2595-2599 (1997).
- Park, M. K., Lee, B. D., Lee, J. D., Jung, H. H., Chae, S. W. Gene profiles during vestibular compensation in rats after unilateral labyrinthectomy. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 121 (11), 761-769 (2012).
- Yamamoto, H., Tominaga, M., Sone, M., Nakashima, T. Contribution of stapedial artery to blood flow in the cochlea and its surrounding bone. Hearing Research. 186 (1-2), 69-74 (2003).
- Potegal, M., Abraham, L., Gilman, S., Copack, P. Technique for vestibular neurotomy in the rat. Physiology & Behavior. 14 (2), 217-221 (1975).
- Tung, V. W., Burton, T. J., Dababneh, E., Quail, S. L., Camp, A. J. Behavioral assessment of the aging mouse vestibular system. Journal of Visualized Experiments. (89), e51605 (2014).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I.
