Summary
Det här protokollet beskriver de kirurgiska labyrinthectomy av en råtta, som är en användbar metod för att studera det vestibulära systemet.
Abstract
För att studera det vestibulära systemet eller vestibulära kompensationsprocessen, har ett antal metoder utvecklats för att orsaka vestibulär skada, inklusive kirurgisk eller kemiska labyrinthectomy och vestibulära neurectomy. Kirurgiska labyrinthectomy är en relativt enkel, pålitlig och snabb metod. Här beskriver vi den kirurgiska tekniken för råtta labyrinthectomy. Ett postauricular snitt görs under narkos att exponera den yttre hörselgången och trumhinnan, varefter trumhinnan och hörselbenen avlägsnas utan stigbygeln. Den stigbygeln artär, som ligger mellan stigbygeln och den ovala fönstret, är en sårbar struktur och måste bevaras för att få en tydlig operationsområdet. Ett hål till fenestrate vestibulen är gjord med en 2,1-mm borr bur överlägsen stigbygeln. Sedan är 100% etanol injiceras genom detta hål och aspirerade flera gånger. Noggrann dissektion under ett mikroskop och noggrann blödning kontroll är viktiga att få tillförlitliga resultat. Symtom på vestibulärt bortfall, såsom nystagmus, huvud luta och ett rullande vinkar, ses omedelbart efter operationen. Rotarod eller rotation stol testet kan användas för att objektivt och kvantitativt beräkna vestibulära funktionen.
Introduction
Vestibulära organ är viktig för balans och ögat. En normal vestibulär funktion beror på symmetriska afferenta signaler från de vestibulära organen i två inre öronen. Vestibulära svikt eller förlust framkallar yrsel, nystagmus och postural obalans. Akuta skador återfår den vestibulära funktionen spontant inom några dagar, en process som kallas vestibulär kompensation1,2. Vestibulär kompensation av statiska underskott är en process av återhämtning relaterade till obalansen av spontan vilande aktivitet mellan de ipsilaterala och kontralaterala vestibulära kärnorna. Vestibulär kompensation av dynamiska underskott sker huvudsakligen via sensoriska och beteendemässiga substitutioner (med visuella eller somatosensoriska ingångar)3. Dessa processer är attraktiva för neuronal plasticitet studier4,5.
Ett antal metoder har utvecklats för att studera det vestibulära systemet och de mekanismer som ligger till grund neuronal plasticitet under vestibulär kompensation, till exempel kirurgiska och kemiska labyrinthectomy och vestibulära neurectomy5,6 ,7,8. Vestibulära neurectomy är ett visst sätt att inducera komplett vestibulärt bortfall, men det är ett svårt och invasiv förfarande och kan orsaka hjärnskador8,9. Denna metod kräver större kirurgisk skicklighet och tar längre tid än labyrinthectomy. Kemiska labyrinthectomy inklusive gentamycin, arsanilate och tetrakain, är lättare och kan ge tillförlitliga resultat10,11,12. Dock snäckan kan också skadas och vestibulärt bortfall kan utvecklas över tid11. Dessutom är effekterna av kemikalierna på hjärnan, som bör bevaras för noggrann utvärdering, oklart. Kirurgiska labyrinthectomy introducerades i djurstudier i 184215 och först rapporterades hos råtta i 193616. Denna teknik har sedan använts i många djurstudier5,17,18,19. Kirurgiska labyrinthectomy är en specifik, pålitliga och relativt enkel metod. 13 , 14 dessutom symtomen av vestibulära skador ses omedelbart efter operationen. Här beskriver vi vår operationsteknik för råtta labyrinthectomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i enlighet med de institutionella djur vård och användning kommittén av Seoul nationella Universitetssjukhuset (14-0148-C1A1), som är ackrediterad av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorium djur vård International.
Obs: Experimenten utfördes på hanråttor Sprague-Dawley (SD) av 7-8 veckor gamla (200/250 g). Varje djur var anpassat till förhållandena i laboratoriet under 1 vecka före start av experimentet. Djuren var inrymt i en temperatur och luftfuktighet kontrollerade rum med en konstant 12-h:12-h ljus: mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
1. Labyrinthectomy
- Täcka de Ånghärdad kirurgiska instrument med en steril pad. Desinficera det operativa området med 70% etanol. Använd en steril draperi och upprätthålla sterila förhållanden under operationen.
- Bära en klänning, mask (till täcker näsa och mun), cap (att täcka huvudet), och ett par sterila handskar. De kirurgiska instrument måste bara komma i kontakt med sterila ytor.
- Injicera Tiletamin-zolazepam bedövningsmedel (40 mg/kg kroppsvikt) intramuskulärt i mediala låret eller intraperitonealt, och xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) intramuskulärt eller intraperitonealt.
Obs: Andra former av narkos, inklusive isofluran inandning, kan också användas. - Placera råtta på en värmande pad (ursprungligen inställd på 42 ° C). Applicera smörjmedel ögonsalva i båda ögonen för råttan att förhindra torra ögon medan under narkos.
- Placera råtta på dess högra sida. Raka päls i det kirurgiska området med hårklippningsmaskiner. Desinficera platsen med 70% etanol.
- Injicera 1% lidokain hydroklorid subkutant i området vänster retroauricular.
- Med hjälp av en skalpell blad #15, gör en ~5.0 cm retroauricular snitt. Separata muskler och fascia att exponera den yttre hörselgången med Iris sax (figur 1A). Något öppna den yttre hörselgången med hjälp av bladet #15 eller Iris saxen (figur 1B). Stor utsträckning Utsätt trumhinnan (figur 2A).
- Under mikroskop (7,5 X eller 12,5 X), ta bort trumhinnan och hörselbenen med undantag av stigbygeln, med hjälp av tången. Lossa musklerna på lambdoidal åsen med bladet #15 eller Iris saxen (figur 2B).
- Med en borr med låg hastighet (< 3000 rpm) med en diamant bur (2.1 eller 1,4 mm), borra trumhinna bulla benet runt punkten av går ut av ansiktsnerven (figur 3A). Identifiera den stapedial artären. Ta hand inte kommer för att skada den stapedial artären under borrning.
- Fortsätt borrning vestibulen överlägsen den stapedial artären och exponera det runda fönstret och den beniga laterala halvcirkelformade kanalen. Öppna den laterala halvcirkelformade kanalen nära dess ampulla. Fortsätt borrning i planet av den laterala halvcirkelformade kanalen och borra i ampulla av den överlägsna halvcirkelformade kanalen.
- Aspirera innehållet i vestibulen med en 18- eller 22-G nål. Injicera och aspirera 1 cm3 100% etanol 3 x.
- Nära musklerna och huden i två lager med enkel avbrutna suturer.
- Lämna inte ett djur utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Håll råttan varm tills det Smashbox med en värmedyna eller en värmelampa. Efter uppvaknande, flytta råtta till en enskild bur i ett rum med de vanliga miljöförhållandena.
- Administrera antibiotika (t.ex., Cefazoline 20 mg/kg, trimetoprim-sulfonamid 100 µL subkutant, eller penicillin 300.000 IU) som behövs på dag 1; ett analgetikum (inte en opioid; t.ex., Metacam 2 mg/kg, karprofen 5 mg/kg subkutant) kan också ges.
2. sham kirurgi
- För bluff operation som en kontroll, utföra samma kirurgiska och postoperativa förfaranden (enligt avsnitt 1), inklusive exponering av den yttre hörselgången och trumhinnan (steg 1,7), avlägsnande av trumhinnan och hörselbenen, och den avlossning av musklerna på lambdoidal ridge (steg 1,8), men inte öppna den halvcirkelformade kanalen eller injicera etanol.
3. Kontrollera förlusten av vestibulär funktion
Obs: Förlusten av vestibulär funktion kan utvärderas med hjälp av antingen beteendemässiga eller vestibulära funktionstester. 13 , 17 , 18 beteendemässiga tester omfattar utvärdering av postural asymmetri och nystagmus.
- Identifiera postural asymmetri som inkluderar spontan eller evoked fat-rullande, faller på vänster sida, eller flytta samtidigt som lutar mot den bort sida18. Se Video 1.
- Identifiera nystagmus genom en visuell inspektion av frivilliga ögonrörelser. När spontan nystagmus är frånvarande i vilande tillstånd, puff luft försiktigt över huvudet av djur18. Se Video 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången av kirurgi validerades av beteendemässiga tester. Alla djur uppvisade det typiska beteendet hos ett unilateralt bortfall av vestibulär funktion. Spontan fat-rullande märktes omedelbart efter operation, att vara framkallat av en luft puff över huvudet eller en lätt beröring på kroppen i tidiga återhämtningsfasen (Video 1). 3 d efter operation, djuren flyttas runt lutar mot den bort sidan med enstaka faller på vänster sida. Spontan nystagmus observerades inom 2 d (Video 2). Evoked nystagmus observerades inom 3 d.
Operationen oftast krävs < 30 min. Under loppet av 50 operationer dog 2 råttor under operationen och 3 inom 1 d av kirurgi. Sammantaget var förlust 10% (5 dödsfall under/efter 50 operationer). Alla dödsfall orsakades av en skada på den stapedial artären. Vi noterade ingen fördröjd död och ingen infektion inom 1 vecka. I flera dagar efter operationen, kan råttor uppvisar en dålig oral intag och vikt förlust.
Figur 1: efter auricular anskärning av vänster öra. (A) A postauricular snittet gjordes, och ansiktsnerven (↑) identifierades mellan temporalis muskeln (*) och sternomastoid muskeln (†). (B) sedan, den yttre hörselgången (↑) öppnades något och brosk i ytterörat avskildes från pyramidal benet. Skalstapeln 2 mm gäller alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exponering av beniga väggen i vestibulen. (A) efter öppnandet den yttre hörselgången brett, sågs hammarhuvud (*) under trumhinnan. (B) efter avlägsnande av trumhinnan och hörselbenen (med undantag av stigbygeln), cochlear udden (*) identifierades och musklerna på lambdoidal åsen förhöjda (†). Skalstapeln 2 mm gäller alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: vestibulära Fasadentreprenör. (A) efter avlägsnande av den bakre laterala väggen i det tympanic hålet, benet runt punkten av går ut av ansiktsnerven borrades. Exponerades den stapedial artären (↑) och det runda fönstret (Δ) ovanför cochlear udden (*). (B) efter borrning ut laterala vestibulen, ampulla av de semicircular kanalerna var uppenbar i vestibulära kvarlevan (↑), som var den sämre läge av cochlear udde (*). Skalstapeln 2 mm gäller alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Spontan fat rullande. SD råtta som genomgick labyrinthectomy 2 d tidigare visade spontana fat rullande. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2. Spontan nystagmus. SD råtta som genomgick labyrinthectomy 2 d tidigare visade spontan nystagmus. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik är en användbar metod för att skapa plötslig, permanent och komplett vestibulär funktion förlust. Detta skulle kunna användas att studera vestibulära patologier, såsom vestibulära neurit, akustisk tumör och Ménières sjukdom. Många studier har använt denna teknik för att studera neuronal plasticitet i vestibulära kärnor eller relaterade centrala processen5,17,18,19.
The Most kritiska steg för lyckad operation är 1) bevarandet av stapedial artär, 2) en noggrann borrning vid exakt position, och 3) noggrann blödning kontroll. En stor postauricular snitt kan orsaka en stor yttre sår, som stör benet rörelsen på den behandlade sidan. Dock ett litet snitt begränsar operationsområdet och orsakar åtgärden att ta längre tid. En ordentlig dementi är väsentligt att upprätthålla en tillräcklig kirurgiska Visa13. Efter postauricular snittet, kan ansiktsnerven identifieras ovanför bulla och mellan digastric muskeln och sternocleidomastoideus, kör främre-inferiorly till ansiktet. Den retroauricular artären och den största öron nerv som kör i motsatt riktning. Eventuella skador på ansiktsnerven orsakar ansiktsförlamning efter ingreppet. För att uppnå en bredare kirurgiska vy och undvika en stigbygeln artär skada, föredrar vi att ta bort den överlägsen yttre hörselgången vägg och sedan metoden överlägsen till stigbygeln artär17,19. Detta tillvägagångssätt är associerade med en större risk för infektion jämfört den ventrolaterala strategin, som inte har öppnandet av väggens yttre hörselgången eller avlägsnande av trumhinnan (som exponerar mellanörat till externa miljö). Vår erfarenhet, de långsiktiga följdtillstånd (allmänna djur prestanda, dess utfodring och dricka vanor, återupptagandet av viktökning och infektionsstatus) skiljer sig inte särskilt mellan djur som utsätts för det transtympanic tillvägagångssätt som beskrivs här och den ventrolaterala strategi17,20. Öppna bulla kan skada den bifogade muskel och ibland resultera i några blödningar. Hos råtta korsar stigbygeln artären nära platsen för vestibulära Fasadentreprenör. I människor försvinner dock den stigbygeln artären under embryogenes. När operationsområdet är smala, det är inte lätt att styra blödningen och fältet kan snabbt fylls med blod. För att undvika detta, koagulerar vissa författare stigbygeln artären innan hålet. Men dess roll inte är klar, vill vissa författare inte koagulerar stigbygeln artär14 eftersom det får leverera innerörat, central nervsystemet (den geniculate ganglion, mediala lemniscus och trapetsoid kropp) och ansiktsnerven råtta14 ,21. Om blödning uppstår, vi komprimera artären med en liten bomullspinne och sedan använda elektriska koagulering med tillräckligt sug.
En små burr är användbart för att göra hål i farstun. En liten krok eller nål kan användas istället för en burr. En mekanisk borrning system resulterar i mindre fenestration trauma och hjälper till att få konsekventa resultat. Utan etanol bevattning observerat vi variabel beteendemässiga Svaren efter den labyrinthectomy13,17. Etanol bevattning och sug säkerställa att labyrinten är dödligt skadad. 13 trubbiga elektriska koagulering av vestibulära nerven kan vara utförs via detta hål22. Rätt förstoring är viktigt, och Mikroskop är obligatorisk i de flesta fall.
Mitten och innerörat skadas också under den labyrinthectomy, vilket resulterar i dövhet. Det finns inget sätt att bevara innerörat säkert. Kemiska labyrinthectomy kan bevara djurens hörsel men ger varierande resultat8. Vestibulära neurectomy kan också orsaka skador till cochlear nerv8. För att utföra åtgärden sham i kontrollgruppen, vi tog bort den trumhinna och hörselben utan stigbygeln, vilket resulterade i milda konduktiv hörselnedsättning utan någon vestibulära skador13.
Flera beteendemässiga och vestibulär funktionstester kan användas för att bekräfta att labyrinthectomy har varit utförs framgångsrikt13,14. Omedelbart efter ingreppet, kan en skev avvikelse i ögat observeras. Efter återhämtningen från anestesi, kan spontan nystagmus, rullande vinkar och huvudet vippning ses. Rotation av svansen hängande är den mest tillförlitliga test17,20. Dessa underskott återhämta sig långsamt inom flera dagar17,20. Spontan nystagmus med snabb förflyttning till kontralaterala sidan försvinner inom 3-4 d efter ingreppet. Den huvud luta förblir i flera månader. Vestibulära tester, såsom en rotation stol test eller ett rotarod-test, kan ge mer objektiva och kvantitativa data23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag från Korea hälsa teknik R & D projekt genom den Korea hälsa industri utveckling Institute (KHIDI), finansierade av ministeriet för hälsa & välfärd, Sydkorea (bevilja nummer: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
- Curthoys, I. S., Halmagyi, G. M. Vestibular compensation: a review of the oculomotor, neural, and clinical consequences of unilateral vestibular loss. Journal of Vestibular Research. 5 (2), 67-107 (1995).
- Smith, P. F., Curthoys, I. S. Mechanisms of recovery following unilateral labyrinthectomy: a review. Brain Research. Brain Research Reviews. 14 (2), 155-180 (1989).
- Lacour, M., Helmchen, C., Vidal, P. P. Vestibular compensation: the neuro-otologist's best friend. Journal of Neurology. 263, Suppl 1. S54-S64 (2016).
- Darlington, C. L., Smith, P. F. Molecular mechanisms of recovery from vestibular damage in mammals: recent advances. Progress in Neurobiology. 62 (3), 313-325 (2000).
- Shinder, M. E., Ramanathan, M., Kaufman, G. D. Asymmetric gene expression in the brain during acute compensation to unilateral vestibular labyrinthectomy in the Mongolian gerbil. Journal of Vestibular Research. 16 (4-5), 147-169 (2006).
- Dutheil, S., Brezun, J. M., Leonard, J., Lacour, M., Tighilet, B. Neurogenesis and astrogenesis contribution to recovery of vestibular functions in the adult cat following unilateral vestibular neurectomy: cellular and behavioral evidence. Neuroscience. 164 (4), 1444-1456 (2009).
- Gunther, L., et al. N-acetyl-L-leucine accelerates vestibular compensation after unilateral labyrinthectomy by action in the cerebellum and thalamus. PLoS One. 10 (3), e0122015 (2015).
- Pericat, D., Farina, A., Agavnian-Couquiaud, E., Chabbert, C., Tighilet, B. Complete and irreversible unilateral vestibular loss: a novel rat model of vestibular pathology. Journal of Neuroscience Methods. 283, 83-91 (2017).
- Cass, S. P., Goshgarian, H. G. Vestibular compensation after labyrinthectomy and vestibular neurectomy in cats. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 104 (1), 14-19 (1991).
- Vignaux, G., et al. Evaluation of the chemical model of vestibular lesions induced by arsanilate in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 258 (1), 61-71 (2012).
- Berryhill, W. E., Graham, M. D. Chemical and physical labyrinthectomy for Meniere's disease. Otolaryngologic Clinics of North America. 35 (3), 675-682 (2002).
- Morgenstern, C., Mori, N., Arnold, W. Experimental studies on the effect of labyrinth anesthesia. Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 237 (3), 255-261 (1983).
- Nadasy, G. L., Raffai, G., Feher, E., Schaming, G., Monos, E. A simple standard technique for labyrinthectomy in the rat: a methodical communication with a detailed description of the surgical process. Physiology International. 103 (3), 354-360 (2016).
- Hitier, M., Besnard, S., Vignaux, G., Denise, P., Moreau, S. The ventrolateral surgical approach to labyrinthectomy in rats: anatomical description and clinical consequences. Surgical and Radiologic Anatomy. 32 (9), 835-842 (2010).
- Flourens, M. J. Recherches experimentales sur les propriétés et les fonctions du système nerveux dans les animaux vertébrés. , Crevot. Paris. (1824).
- T'Ang, Y., Wu, C. F. The effects of unilateral labyrinthectomy in the albino rat. Chinese Journal of Physiology. 10, 571-598 (1936).
- Chang, M. Y., et al. MicroRNAs 218a-5p, 219a-5p, and 221-3p regulate vestibular compensation. Scientific Reports. 7 (1), 8701 (2017).
- Bergquist, F., Ludwig, M., Dutia, M. B. Role of the commissural inhibitory system in vestibular compensation in the rat. The Journal of Physiology. 586 (18), 4441-4452 (2008).
- Cameron, S. A., Dutia, M. B. Cellular basis of vestibular compensation: changes in intrinsic excitability of MVN neurones. NeuroReport. 8 (11), 2595-2599 (1997).
- Park, M. K., Lee, B. D., Lee, J. D., Jung, H. H., Chae, S. W. Gene profiles during vestibular compensation in rats after unilateral labyrinthectomy. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 121 (11), 761-769 (2012).
- Yamamoto, H., Tominaga, M., Sone, M., Nakashima, T. Contribution of stapedial artery to blood flow in the cochlea and its surrounding bone. Hearing Research. 186 (1-2), 69-74 (2003).
- Potegal, M., Abraham, L., Gilman, S., Copack, P. Technique for vestibular neurotomy in the rat. Physiology & Behavior. 14 (2), 217-221 (1975).
- Tung, V. W., Burton, T. J., Dababneh, E., Quail, S. L., Camp, A. J. Behavioral assessment of the aging mouse vestibular system. Journal of Visualized Experiments. (89), e51605 (2014).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I.
