Qui, presentiamo un protocollo per confermare la presenza di mutazione di punto per la diagnosi di amiloidosi ereditaria da transtiretina, utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio.
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Articolo metodologico
L'analisi genetica di ereditario Transthyretin Ala97Ser relative amiloidosi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Test genetici è la prova più affidabile per transthyretin ereditario legate amiloidosi e deve essere eseguita nella maggior parte dei casi di amiloidosi da transtiretina (ATTR). ATTR è una malattia rara ma fatale con fenotipi eterogenei; di conseguenza, la diagnosi a volte è in ritardo. Con l'aumento dell'attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché trattamenti emergenti, studi diagnostici appropriati, tra cui la transtiretina (TTR) genetica test, per confermare i tipi e varianti di ATTR sono pertanto fondamentale per migliorare la prognosi. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazioni puntiformi TTR molto più rapidamente e più sicuro rispetto ai metodi tradizionali come la macchia del sud. Qui, dimostriamo la conferma genetica della mutazione ATTR Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan. Il protocollo comprende quattro fasi principali: raccolta dei campioni di sangue intero, estrazione del DNA, l'analisi genetica di tutti e quattro gli essoni TTR con PCR e sequenziamento del DNA.
Introduzione
Amiloidosi da transtiretina (TTR) (ATTR) sono la forma più comune di amiloidosi sistemica1e possono essere causato da una mutazione dominante ereditata autosomal in gene transtiretina (TTR)2. Mutazioni di TTR destabilizzano la struttura della proteina tetramerica e portano alla sua dissociazione nei monomeri che ricompone in fibrille amiloidi2. Più di 100 mutazioni di TTR amiloidogeniche sono stati segnalati in tutto il mondo1. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazione di punto TTR e presentano vantaggi tra cui ev....
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Protocollo
I test eseguiti in laboratorio è stato effettuato in conformità con i requisiti della clinica laboratorio miglioramento emendamenti (CLIA) del 1988, il regolamento, approvato dal Consiglio di revisione istituzionale di Chang Gung Memorial Hospital e Università (licenza n. 100 - 4470A3 e 104-2462A3). Consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.
1. raccolta di campioni di sangue
- Prelevare il sangue intero in provette EDTA-trattati commercialmente disponibili. Mescolare delicatamente e conservare il campione di sangue a 4 ° C fino al trattamento.
2. DNA estrazione da sangue periferico
<....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Elettroforesi del gel dell'agarosi di due pazienti e un sano singole bande ha rivelato delle dimensioni previste, tra cui un prodotto PCR di bp 454 per esone 4 del gene TTR (Figura 1).
Figura 1 . Elettroforesi del gel raffigurante PCR amplificato gene TTR. Normale: un in.......
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Discussione
Ci sono due passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, al fine di avere un numero sufficiente di cellule bianche del sangue, un esemplare di hemodiluted dovrebbe essere evitato11. In secondo luogo, l'uso appropriati degli iniettori di PCR è fondamentale per ottenere risultati affidabili12. Abbiamo utilizzato lo strumento web di Primer-BLAST per progettare il primer4,13; un minimo di 40 paia di basi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare Miss Shin-Fun Wu per il suo aiuto negli esperimenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal programma di ricerca medica di Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette trattate con EDTA | |||
| Kit di estrazione del DNA | Stratagen | 200600 | |
| Spettrofotometro NanoDrop ND2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Tergicristalli per compiti delicati | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| Kit AmpliTaq Gold 360 DNA polimerasi | Applied Biosystems | 4398823 | |
| primer intronici genici TTR | Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' | |
| Esone1 | R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' | ||
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' | ||
| Exon2 | R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' | ||
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' | ||
| Exon3 | R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' | ||
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' | ||
| Exon4 | R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' | ||
| termociclatore | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| cella per elettroforesi | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| Scala DNA | Protech | PT-M1-100 | |
| colorante | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| sequenziatore automatico | Analizzatore | di DNA Applied Biosystems 3730xl |
Riferimenti
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264
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Ristampe e permessi
