Summary
سيلياتي العملاقة، كوروليس ستنتور، نظام ممتاز لدراسة تجديد والتئام الجروح. نقدم الإجراءات لإنشاء ستنتور الثقافات الخلية من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية، وحفز التجدد بقطع الخلايا، كيميائيا حفز التجديد للفرقة ميمبرانيلار والجهاز عن طريق الفم، والتصوير، وتحليل للخلية التجديد.
Abstract
الخلايا بحاجة إلى أن تكون قادرة على تجديد أجزائها على التعافي من الاضطرابات الخارجية. سيلياتي أحادي الخلية كوروليس ستنتور هو الكائن نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح وتجديد الخلايا اللاحقة. أن الجينوم ستنتور أصبح متاحاً في الآونة الأخيرة، جنبا إلى جنب مع طرق البيولوجيا الجزيئية الحديثة، مثل [رني]. هذه الأدوات تجعل من الممكن لدراسة تجديد خلية واحدة على المستوى الجزيئي. ويغطي الجزء الأول من البروتوكول ستنتور إنشاء خلية الثقافات من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية، جنبا إلى جنب مع المبادئ التوجيهية العامة للحفاظ على الثقافات ستنتور . استزراع ستنتور بكميات كبيرة تسمح باستخدام أدوات قيمة مثل الكيمياء الحيوية، وتسلسلها، والطيف الكتلي. وتغطي الأجزاء اللاحقة من البروتوكول نهج مختلفة لحفز التجدد في ستنتور. قص الخلايا يدوياً بإبرة زجاجية تسمح دراسة تجديد أجزاء الخلية الكبيرة، بينما علاج الخلايا مع السكروز أو اليوريا يسمح لدراسة تجديد هياكل محددة تقع في نهاية الأمامي للخلية. يتم توفير طريقة لتصوير الخلايا تجديد الفردية، جنبا إلى جنب مع شعار التدريج وتحليل ديناميات التجديد. وتنقسم العملية برمتها من التجدد في ثلاث مراحل. بتصور ديناميات تطور عدد سكان خلايا عبر المراحل، يتضح عدم التجانس في توقيت التجدد.
Introduction
الخلايا غير أكياس بسيطة من الإنزيمات، ولكن آلات معقدة للغاية بدلاً من عناصرها يتم تحجيمها إلى الحجم الصحيح بعناية ومرتبة في مواقف محددة تحديداً جيدا. Morphogenesis الخلايا الفردية يمثل عملية رئيسية في الخلية وعلم الأحياء التنموي، لكن آليتها الجزيئية غير معروف1،2. في حين تشبه بعض الخلايا المستزرعة النقط، الكائنات الحية أحادي الخلية يمكن أن يكون معقداً للغاية أبنية، يتجلى في أنماط معقدة القشرية ينظر في سيلياتيس3،4.
ربما هو المثال الأكثر تطرفاً لخلية التنظيم كويروليوس ستنتور، بعيد تتصل هيتيروتريتشوس عملاقة سيلياتي تيتراهيمينا و براميسيوم. ستنتور 1 مم طويل ومغطى بشرائط طولية أكثر من 100 من صبغة زرقاء بالتناوب مع صفوف من أهداب تنظمها المكدسات المتوازية من شرائط ميكروتوبولي التي تعمل طول الخلية بأكملها. الخلية البوق-يتشكل (الشكل 1)، مع عصابة ميمبرانيلار وجهاز عن طريق الفم (الزراعة العضوية) في نهايته الأمامية، وهولدفاست التي تعلق الخلية إلى الركيزة في نهايته الخلفية. الخلية بالإضافة إلى قطبية واضحة الأمامي الخلفي، كما يبين الزخرفة مراوان مميزة، مثل أن التباعد بين صفوف الهدبية تدريجيا الزيادات في اتجاه عقارب الساعة. ينتج عن هذا انقطاع حيث يجتمع الصف أضيق الصف أوسع، وهذه المنطقة من سطح الخلية، المعروفة باسم محور التباين شريطية، يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجموعة الثانية من هياكل نهاية الأمامي عند المطعمة على آخر خلية5، مما يعادل رسميا منظم سبيمان. وهكذا، يكون جميع العمليات الرئيسية لعلم الأحياء التنموي على النظير في ستنتور: أكسياتيون وتشكيل نمط التعريفي. في جنين، هذه العمليات هي مدفوعة بمصير الاختلافات بين خلايا مختلفة، ولكن في ستنتور، وأنهم يجب أن يكون مدفوعا بمصير الفروق بين المناطق المختلفة داخل خلية واحدة. ما يحدد الاختلافات بين المناطق داخل ستنتور لغزا.
إذا تم اقتطاع أي جزء من ستنتور ، يمكن تجديد القطعة المفقودة من الخلية تسفر عن خلية عادية في غضون ساعات. إذا كانت خلية قطع في نصف، أو حتى إلى قطع أصغر بكثير، كل قطعة يعيد إلى خلية يبحث عادي ولكن أصغر حجماً ويعيد التناسب الصحيح بين خلية أجزاء6،7. أجزاء صغيرة حتى، 1/64th حجم الخلية الأصلية، وقادرة على التجدد في زنزانة صغيرة ولكنها تتناسب عادة ومن ثم تنمو إلى الحجم الكامل6. ستنتور وبالتالي من فرصة فريدة لدراسة آليات عضية الحجم التحجيم خلية نمو التنظيم واستخدام الطرق الجراحية التي تطبق عادة على مستوى الأنسجة أو الكائنات الحية كلها.
واحدة من خصائص ستنتور التي يسمح لها بتجديد من طائفة واسعة من العمليات الجراحية يحتوي ماكرونوكليوس نودولاتيد واحد (الشكل 1) مع حوالي 50 ألف نسخة ل الجينوم الكامل8. ما دام جزء من خلية تحتوي على عقده واحدة على الأقل ماكرونوكلير، لديها القدرة على تجديد تماما. خاصية أخرى الكامنة وراء قدرة التجدد ستنتورهو قدرته المذهلة التئام الجروح. وعلى الرغم من العديد من أنواع الخلايا قادرة على شفاء الجروح على9، ستنتور قادراً على استرداد من مجموعة غير عادية من الاضطرابات الجسدية. وأفيد سابقا مثالاً لاسترداد ستنتور من اضطراب جذري، جنبا إلى جنب مع الأساليب لتصور تدفق هيولى في ستنتور10 . تسمح هذه الطرق دراسة كيفية إصابة واللاحقة تؤثر تجديد الحالة المادية السيتوبلازم.
ستنتورضخمة الحجم والقدرة على التجديد غير عادية، وحقيقة أن ذلك يظهر العديد من الظواهر الإنمائية التي ينظر في أجنة متعددة الخلايا (مثل المنظمين، أكسياتيون، والزخرفة) اجتذبت العديد من علماء الأحياء التنموي خلال مطلع القرن الماضي، بما في ذلك "توماس هانت مورغان"7. خلال 50 عاماً وال 60، أثبت النهج microsurgical مجموعة مذهلة من عمليات التجدد ومورفوجينيتيك في هذا الحي وحيدة11. ومع ذلك، ستنتور قد وضعت كنظام نموذجي لبيولوجيا الجزيئية إلا في الآونة الأخيرة. خلال السنوات القليلة الماضية، كان تسلسل جينوم ستنتور وجمعت8، وكان الأسلوب للتشويش التعبير الجيني باستخدام [رني] عن طريق تغذية المتقدمة12.
وكان أحد الأسباب أن ستنتور قد تطورت إلى كائن نموذج للبيولوجيا الجزيئية الحديثة فقط مؤخرا صعوبة متزايدة الثقافات الكبيرة نظراً لدورة الخلية طويلة (3 إلى 5 أيام). ومع ذلك، تتطلب أساليب الجينوم والبروتين الحديثة المواد أقل مما كانوا، وحجم خلية ستنتور واحدة كافية لهذه الأساليب، حتى بدون اللجوء إلى أساليب أولتراسينسيتيفي التي تم تطويرها لتحليل واحد الخلايا التي أصغر بكثير من ستنتور. المادة 1 من البروتوكول تفاصيل الإجراءات المتعلقة بإرساء ثقافة كبيرة من خلية واحدة ستنتور . يمكن استخدام نفس النهج لإرساء ثقافة كبيرة من جزء خلية التي تم الحصول عليها عن طريق خفض خلية. كما يقدم الفرع 1 المبادئ التوجيهية للحفاظ على صحة ستنتور الثقافات على مدى فترات طويلة من الزمن. تنص المادة 2 من البروتوكول المنهجية لحفز التجدد الخليوي بقطع الخلايا يدوياً بإبرة زجاج. المادة 3 من البروتوكول مكرس لطريقتين لحفز تجديد هياكل خلية معينة (جهاز ميمبرانيلار الفرقة والفم): علاج الخلايا مع السكروز أو اليوريا يؤدي إلى سفك هذه الهياكل، تليها بهم التجديد. المادة 4 من البروتوكول تفاصيل طريقة لتصوير الخلايا تجديد الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن. وينتهي القسم 4 مع وصف مراحل التجديد ونصائح حول تحليل ديناميات التجديد.
Protocol
1-استزراع ستنتور وإنشاء ستنتور الثقافات من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية
- تعد الثقافة رينهاردتي تشلاميدوموناس لاستخدامها كغذاء ستنتور.
- الحصول على خلايا رينهاردتي تشلاميدوموناس من مورد تجاري (جدول المواد).
- إرساء ثقافة سائل 500 مل من رينهاردتي تشلاميدوموناس في المتاحة تجارياً الاستفادة من الوسائط باستخدام تقنية تعقيم13.
- تبقى ثقافة Chlamydomonas تحت مصباح بتركيز قرب التشبع (في نقلت حوالي 1) باذابته مع الاستفادة من وسائل الإعلام مرتين في أسبوع.
ملاحظة: يمكن زراعة ثقافة Chlamydomonas على شاكر. - بانتظام التحقق مما إذا كان ثقافة Chlamydomonas صحية بوضع قطره ثقافة على شريحة وتغطي أنه مع ساترة، والتحقق من أنه تحت مجهر في 40 X التكبير.
ملاحظة: لا تستخدم الثقافة لتغذية ستنتور إذا أنها ملوثة بالبكتريا أو خلايا Chlamydomonas يتم تجميعها في مجموعات. في حالة حدوث أي من هذه المشاكل، تبدأ ثقافة Chlamydomonas جديدة.
- الحصول على خلايا كوروليس ستنتور من مورد تجاري (جدول المواد).
- إذا كانت هناك حاجة إلى الخلايا ستنتور من بيئتها الطبيعية، جمع لهم من الأحواض، وبحيرة أو نهر11.
- جمع ستنتور من بركة، بحيرة أو نهر، تجد منطقة مع بعض النباتات حيث المياه هادئة نسبيا، وشادي، وواضحة.
ملاحظة: هناك احتمال أكبر لإيجاد ستنتور في المواقع حيث ينمو دكويد. - جمع مالا يقل عن 2 لتر الماء في حاوية التي من السهل أن تصب من.
- بعد أن استقرت الفتات والجسيمات إلى الجزء السفلي من الحاوية، بلطف ملء الحاويات الأصغر حجماً قليلة لبحث ستنتور، الانتظار لبضع ثوان بعد كل مجموعة للبقايا تسوية في حاوية كبيرة.
- وبمجرد الانتهاء من جمع العينات في مكان، الانتقال إلى مكان جديد 10 متر على الأقل وكرر جمع العينات هناك.
ملاحظة: ليس كل الأحواض يبلغ عدد سكانها ستنتور ، حيث قد يكون أحواض متعددة أخذ عينات. - العودة بالعينات إلى المعمل ونقل المياه من الحاويات في أطباق بتري الفردية.
- في كل طبق بيتري، البحث عن ستنتور تحت ستيريوميكروسكوبي مع الضوء المائل في 5 X التكبير. نقل الخلايا ستنتور الفردية باستخدام ماصة 1 مل في بئر من الزجاج لوحة الموضعية المحتوية على الأقل 100 ميليلتر من مياه الينابيع المبستر المتاحة تجارياً (PSW).
ملاحظة: الخلايا ستنتور لها شكل يشبه البوق عندما كانت متصلة إلى الركازة (الشكل 1). السباحة ستنتور الخلايا الموسعة أقل من الخلايا تعلق على الركازة (1 فيديو). - يغسل ستنتور في PSW على الأقل 3 x. أداء يغسل بإزالة حوالي 90 في المائة المياه من البئر مع الحفاظ على خلايا ستنتور في البئر، متبوعاً بإضافة 500 ميليلتر من PSW في البئر.
ملاحظة: قبل التعامل مع ستنتور استخدام الماصات مع نصائح ماصة 10 ميليلتر أو أصغر، قطع حوالي 0.5 مم قبالة نهاية طرف الماصة مع مقص لتجنب إصابة الخلايا بسبب قوي القص التي يتم إنشاؤها كخلية كبيرة يتدفق عبر صغير جداً البروتوكول الاختياري تلميح تعزيز.
- جمع ستنتور من بركة، بحيرة أو نهر، تجد منطقة مع بعض النباتات حيث المياه هادئة نسبيا، وشادي، وواضحة.
- إعداد Chlamydomonas قبل كل تغذية ستنتور.
- نقل 1 مل ثقافة تشلاميدوموناس على استعداد كما هو الحال في "الخطوة 1، 1" في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. الطرد المركزي في 2,095 س ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية وحراكه بيليه في 1 مل PSW. الطرد المركزي في 2,095 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من PSW.
ملاحظة: وهكذا، غسلها وتتركز Chlamydomonas سوف يشار إليها باسم "أعد Chlamydomonas" في الخطوات التالية. الاستفادة من وسائل الإعلام ما يلحق الضرر ستنتور، وبالتالي الغسيل Chlamydomonas قبل تغذية ستنتور المهم.
- إذا كانت هناك حاجة إلى ثقافة ستنتور الاستنساخ، تبدأ الثقافة من خلية ستنتور فردية أو جزء من خلية.
- منذ واحد ستنتور الخلايا لا تنمو جيدا في PSW، تحضير الوسائط مشروطة بتصفية تعقيم 500 ميليلتر لوسائل الإعلام من ثقافة ستنتور الموجودة وصحية.
- نقل 500 ميليلتر لوسائل الإعلام مكيفة لأحد الآبار لصفيحة بقعة الزجاج.
- نقل أحد ستنتور في البئر من الزجاج لوحة الموضعية التي تحتوي على وسائط الإعلام مكيفة. استخدم كالمتوسطة قليلة قدر الإمكان جعل النقل.
- تغذية كل ستنتور 5 ميليلتر من استعداد تشلاميدوموناس كل 48 ساعة. عند تقسيم ستنتور ، حساب عدد الخلايا في البئر وإضافة 5 ميليلتر من استعداد Chlamydomonas كل خلية.
- الاحتفاظ ستنتور في مكان مظلل نظراً للخلايا حساسة للضوء (على سبيل المثال، في صناديق بلاستيكية واضحة مغطاة بمناشف ورقية).
- تبادل المتوسطة ستنتور في البئر مع متوسطة جديدة مكيفة كل ح 96.
- تحضير الوسائط مكيفة جديدة كما هو الحال في الخطوة 1.5.1.
- جعل كافة الخلايا ستنتور فصل من أسفل البئر بلطف بيبيتينج السائل صعودا وهبوطاً في البئر.
- عناية نضح السائل من جيدا باستخدام ماصة 1 مل، مع التأكد من أن كافة الخلايا تظل في البئر. إضافة 500 ميليلتر من وسائط جديدة مكيفة شكل جيد.
- عندما يتجاوز عدد الخلايا في البئر 20، نقل الخلايا إلى حاوية أكبر، على سبيل المثال، وعاء زجاجي واسع الفم.
- إضافة 20 مل PSW في جرة يعقم الفم واسعة زجاج.
ملاحظة: يمكن استبدال التعقيم من الأواني الزجاجية ستنتور بعناية للغسيل والشطف. - بدقة "الماصة؛" وسائل الإعلام صعودا وهبوطاً في البئر لفصل كافة الخلايا من أسفل البئر. جمع كافة الخلايا ستنتور استخدام تلميح ماصة 1 مل ونقلها بلطف إلى جرة الزجاج.
- إضافة 20 مل PSW في جرة يعقم الفم واسعة زجاج.
- لا تشديد الأغطية على الجرار مع الثقافات ستنتور ، للسماح بوصول كاف إلى الهواء.
- إضافة كلمة إلى جرة كل 48 ساعة للحفاظ على كثافة ستنتور في خلايا/مل حوالي 20. تقدير كثافة الخلايا بالعين المجردة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام ماصة 1 مل من الهواء فقاعة في الجرة جعل الخلايا فصل من الجدران، وماصة حتى 1 مل الثقافة، وحساب عدد الخلايا في تلميح ماصة. - كل ح 48، أعد تغذية Chlamydomonas ستنتور الثقافات في الجرار (راجع الخطوة 1، 4). تبدأ تغذية الثقافة مع 200 ميليلتر من استعداد تشلاميدوموناس. كما يزداد حجم الثقافة، تدريجيا زيادة مقدار استعداد Chlamydomonas المستخدمة لتغذية تصل إلى 1 مل.
- عندما يصل حجم الثقافة إلى حوالي 90% القدرة الجرة، ونقل الثقافة إلى حاوية أكبر.
- "الماصة؛" الثقافة داخل الجرة، صعودا وهبوطاً، مع ماصة 1 مل لفصل ستنتور من الزجاج.
- صب محتويات الجرة بالكامل في حاوية زجاجية 2-كأس.
- شطف الجرة مع حوالي 25 مل PSW في حاوية زجاجية 2-كأس لجمع بقية ستنتور.
- الحفاظ على ثقافات صحية في حاويات زجاجية 2-كأس.
- تغذية الثقافات ستنتور 2 مل من استعداد تشلاميدوموناس في 100 مل ثقافة كل 4-5 أيام. إضافة كلمة إلى حاوية الزجاج كل 4-5 أيام للحفاظ على كثافة ستنتور في حوالي 20 خلايا/مل.
ملاحظة: 450 مل هو الحد الأقصى لحجم حاوية 2-كأس تعقد. - مرة واحدة في أسبوع، تفقد الثقافات تحت 5 × تشريح مجهر الروتيفر والفطريات والنمو الأخرى. لإطالة أمد صحة الثقافة، إزالة الكائنات الدقيقة تلويث جنبا إلى جنب مع الخلايا ستنتور على شكل طبيعي وعديم اللون باستخدام ماصة 1 مل.
- حاوية زجاجية عند حوالي 90% من كامل، تقسيم الثقافة.
- إضافة 25 مل PSW إلى حاوية زجاجية. استخدام مل 25 ماصة ماصة صعودا وهبوطاً لفصل ستنتور من الزجاج. نقل حوالي 50% الثقافة في حاوية زجاجية 2-كأس جديدة.
- إضافة 25 مل PSW لكل الثقافات ومواصلة الحفاظ على ثقافات اثنين كما هو موضح في هذا الفرع من البروتوكول.
ملاحظة: نظراً للخلايا ستنتور حساسة لدرجات الحرارة العالية، الحفاظ على درجة الحرارة 25 درجة مئوية أو أقل في الغرفة حيث يتم الاحتفاظ الثقافات. وبدلاً من ذلك، يمكن الاحتفاظ الثقافات في حاضنة. الرجوع إلى الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لاستزراع ستنتور .
- تغذية الثقافات ستنتور 2 مل من استعداد تشلاميدوموناس في 100 مل ثقافة كل 4-5 أيام. إضافة كلمة إلى حاوية الزجاج كل 4-5 أيام للحفاظ على كثافة ستنتور في حوالي 20 خلايا/مل.
2-حفز التجدد بقطع ستنتور الخلايا
- استخدام ساحبة إبرة جعل الإبر العديد من الأنابيب الشعرية باستخدام البرنامج على النحو التالي: الحرارة-735، سحب-100، السرعة-110، الوقت-الضغط 150،-400.
- تعد حلاً ميثيلسيلولوسي 4 ٪ في 50 مل PSW.
- أضف 1 غرام ميثيلسيلولوسي (اللزوجة: 1500 cP) إلى 50 مل PSW.
- تبني في 4 درجات مئوية على الأقل 8 ح لتيسير حل methylcellulose.
- يبقى الحل ميثيلسيلولوسي 4% عند درجة حرارة الغرفة.
- إعداد لوحة بقعة زجاج لتخزين أجزاء الخلية بعد إجراء التخفيضات.
- فلتر تعقيم وسائل الإعلام من ثقافة صحية، 500 مل كل لوح الزجاج بقعة هناك حاجة أيضا.
- نقل 500 مل وسائط معقمة في كل من الآبار اللازمة.
- جمع صحية واحدة ستنتور (لها شكل بوق محددة، اللون الأزرق والأخضر نابضة بالحياة، ولا vacuoles الكبيرة) في معالجة تجميعية 2 ميليلتر ووضعه في ساترة أو شريحة. إضافة 2 ميليلتر من ميثيلسيلولوسي 4% (الشكل 2). واسمحوا ستنتور تبطئ قبل قطع عليه (2 فيديو).
- أمسك الإبرة الزجاج موازية لسطح القطع قدر الإمكان للحيلولة دون كسر الإبرة.
- استخدام ستيريو تشريح مجهر، موقع غيض الإبرة الزجاج ونقله أقرب إلى الخلية (الشكل 3A). الاحتفال بالعقد ستنتور عند الاتصال بالإبرة (الشكل 3 وج).
ملاحظة: إذا كانت الخلية في اتجاه الذي يجعل فصل النهاية الأمامية من الجهة الخلفية صعبة، تناوب عليها بلطف جداً مع الجانب من الإبرة. - اضغط برفق على التعاقد مع ستنتور مع الجانب من الإبرة الزجاج لقص الخلية في اثنين(الشكل 3D و ه، 3 فيديو). نقل الأجزاء اثنين إلى جانب ضمان عدم وجود أي اتصال هيولى بينهما، لتجنب انصهار جزء (الشكل 3F).
- التحقق من كل الأجزاء على عقده واحدة على الأقل ماكرونوكلير كل بفحص الشظايا تحت مجهر تشريح مع الإضاءة المائلة.
ملاحظة: بعد عقده ماكرونوكلير واحد على الأقل ضروري لبقاء الخلية. الخلية قد يلقي به جليده (شل شفافة) جنبا إلى جنب مع الصباغ الأزرق والأخضر أثناء أو بعد القطع. وفي معظم الحالات، هذا لن يؤثر الاستمرار في الأجل الطويل للخلية. - نقل الأجزاء إلى الآبار من الزجاج لوحة بقعة إعدادها في "الخطوة 2، 3".
- قص الخلايا متعددة نظراً لعدم تجديد جزء من الخلايا قص.
- إذا كان إجراء تخفيضات متعددة في جلسة عمل واحدة، استبدال الإبرة الزجاجية عند فإنه يصبح المغلفة بشدة مع بقايا ستنتور أو عندما يكون طرفها كسر. بدلاً من ذلك، بتنظيف الإبرة بمسحه بلطف على قطعة من السيليكون فاصل.
ملاحظة: يمكن استخدام الإبر الزجاجية للعديد من جلسات العمل قطع الخلية. - تبقى لوحة زجاج بقعة مع أجزاء الخلية في دائرة رطوبة.
- انتقل إلى القسم 4 من البروتوكول للحصول على تفاصيل حول التصوير وتفسير نتائج التجديد ستنتور .
3-حفز التجدد جهاز الشفوي السكروز أو علاج اليوريا والفرقة ميمبرانيلار
- ميمبرانيلار الفرقة والفم جهاز إزالة استخدام السكروز
- إعداد حل 25% من السكروز في PSW.
- إضافة 500 ميليلتر من السكروز 25% في PSW إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مع غطاء الأداة إضافية.
- إعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي 3 مع قبعات المفاجئة مع 1 مل PSW في كل أنبوبة للغسيل الخلايا بعد العلاج السكروز.
- جمع الخلايا ستنتور 30-60 في 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة في أنبوب ميكروسينتريفوجي منفصلة باستخدام ماصة 1 مل من (الشكل 4، السهم A).
- جمع كافة الخلايا من الأنبوب في 125 ميليلتر الحجم النهائي باستخدام ماصة ميليلتر 200 في رسم واحد. نقلها إلى الأنبوب مع 500 ميليلتر من السكروز 25% (أعد الخطوة 3.1.2) للحصول على 625 ميليلتر من محلول السكروز 20% (الشكل 4، السهم ب). بدء تشغيل ساعة توقيت.
- احتضان ستنتور في هذا محلول السكروز 20% ونفض الغبار--تدور أنبوب ميكروسينتريفوجي في الرف لمدة 1 دقيقة.
- جمع كافة الخلايا في رسم واحد (ضبط الماصة إلى 200 ميليلتر على الحد الأقصى من القدرة على جمع أسهل).
- إبقاء الخلايا في تلميح ماصة حتى يظهر ساعة توقيت دقيقة 2 السكروز في المعاملة.
- إخراج ستنتور في أحد أنابيب ميكروسينتريفوجي إعدادها في الخطوة 3.1.3 (الشكل 4، السهم ج). فليك-تدور الأنبوب في الرف.
- تغسل الخلايا اثنين أكثر من مرة، مرة واحدة في كل من أنابيب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على كلمة المتبقيين في إعداد الخطوة 3.1.3 (الشكل 4، أسهم دال وهاء).
ملاحظة: لا المهم رسم وحيد الخلية تقنية جمع ما بين يغسل. - انتقل إلى القسم 4 من البروتوكول للحصول على تفاصيل حول التصوير وتفسير دينامية التجدد ستنتور (الشكل 4، أسهم F و G).
- ميمبرانيلار الفرقة والفم جهاز إزالة استخدام اليوريا
- تعد حلاً يوريا 4% في PSW.
- إضافة 300 ميليلتر من اليوريا 4% في PSW إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مع غطاء الأداة إضافية.
- إعداد 3 ميكروسينتريفوجي أنابيب مع قبعات المفاجئة التي تحتوي على 1 مل PSW في كل أنبوبة للغسيل الخلايا بعد العلاج اليوريا.
- جمع الخلايا ستنتور 30-60 في 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة في أنبوب ميكروسينتريفوجي منفصلة باستخدام ماصة 1 مل من (الشكل 4، السهم A).
- جمع كافة الخلايا من الأنبوب في 300 ميليلتر الحجم النهائي باستخدام ماصة 1 مل في رسم واحد. نقلها إلى الأنبوب مع 300 ميليلتر من اليوريا 4% (أعد الخطوة 3.2.2) للحصول على 600 ميليلتر من حل اليوريا 2% (الشكل 4، السهم ب). بدء تشغيل ساعة توقيت.
- احتضان ستنتور في هذا الحل اليوريا 2% ونفض الغبار--تدور أنبوب ميكروسينتريفوجي في الرف لمدة 1 دقيقة.
- جمع كافة الخلايا في رسم واحد.
- إبقاء الخلايا في تلميح ماصة حتى يظهر ساعة توقيت دقيقة 2 اليوريا في المعاملة.
- إخراج ستنتور في أحد أنابيب ميكروسينتريفوجي إعدادها في الخطوة 3.2.3 (الشكل 4، السهم ج). فليك-تدور الأنبوب في الرف.
- تغسل الخلايا اثنين أكثر من مرة، مرة واحدة في كل من أنابيب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على كلمة المتبقيين في إعداد الخطوة 3.2.3 (الشكل 4، أسهم دال وهاء).
ملاحظة: لا المهم رسم وحيد الخلية تقنية جمع ما بين يغسل. - انتقل إلى القسم 4 من البروتوكول للحصول على تفاصيل حول التصوير وتفسير دينامية التجدد ستنتور (الشكل 4، أسهم F و G).
4-التصوير وتحليل تجديد الخلايا
- في حالة استخدام مجهر تستقيم، الشنق الأسلوب الحبرية إلى تجديد الصورة من الخلايا الفردية.
- وضع 100 ميليلتر من PSW في بئر صفيحة بقعة الزجاج.
- عزل خلية ستنتور 1 في 4 ميليلتر من ثقافة الوسائط (وسائط الإعلام التي هم في)، واستخدام ميليلتر 10 أو 20 "الماصة؛". إيداع الحبرية في منتصف ساترة2 22 × 22 مم (الشكل 5).
ملاحظة: إذا كانت الخلايا التي 1) غير صحية (على شكل طبيعي أو بكثافة الرغوة) أو 2) لا تزال العصابات ميمبرانيلار أو التجهيزات عن طريق الفم (لتجارب العلاج الكيميائي)، لا تستخدم للتصوير. - ترتيب 4 قطرات أكثر من ستنتور في ثقافة وسائل الإعلام حول الحبرية السابق، مع ترك مساحة كافية بين القطرات.
- عكس ساترة مع قطرات ووضعه بلطف فوق البئر لصفيحة بقعة الزجاج الذي أضيف PSW في "الخطوة 4-1".
- ملاحظة: سيتم تصغير PSW في البئر تبخر القطرات (الشكل 5).
- إعداد الخلايا المتبقية للتصوير باتباع خطوات 4.1.1-4.1.4.
- صورة تجديد الخلايا تحت مجهر مع القرار الوقت المطلوب. بدلاً من ذلك، نلاحظ في التجديد باستخدام مجهر تشريح ستيريو.
ملاحظة: سوف يبدأ التجديد فورا بعد قطع الخلية أو المعاملة مع السكروز أو اليوريا. ومع ذلك، ستشكل هياكل الشفوية الجديدة تظهر حوالي 3 ح بعد بداية التجديد.
- لكل نقطة الوقت، تعيين واحدة من ثلاث مراحل التجديد لكل من الخلايا. للقيام بذلك، قم بمقارنة كل خلية للصور التمثيلية التي توضح المراحل (الشكل 4 و الشكل 6).
- تعيين المرحلة 1 للخلايا التي لا تملك عصابة ميمبرانيلار حتى الآن (الشكل 6A).
- تعيين المرحلة 2 للخلايا مع عصابة ميمبرانيلار.
ملاحظة: تظهر عصابة ميمبرانيلار ح 3-6 بعد المعالجة (الشكل 4، الشكل 6B). في نهاية هذه المرحلة، سوف تظهر انحناء إضافية النهاية الخلفية للفرقة ميمبرانيلار فقط قبل ظهور بريمورديوم عن طريق الفم. - تعيين المرحلة 3 للخلايا مع بريمورديوم عن طريق الفم.
ملاحظة: بريمورديوم عن طريق الفم إينفاجينيشن الظهور ح 6-8 بعد العلاج في نهاية مؤخرة الفرقة ميمبرانيلار (الشكل 4، الرقم 6 و 6 د). يتم إكمال التجديد عند الخلايا يكون عصابة ميمبرانيلار في نهايتها الأمامي والشكل الخلية المميزة البوق (الشكل 4، 6E الشكل). يتم إعادة إنشاء معظم ستنتور الخلايا تماما ضمن ح 8-9 منذ بداية التجديد.
- رسم النسبة المئوية للخلايا في كل مرحلة من المراحل التجديد لكل نقطة الوقت في شكل قطعة مكدس مربع (الشكل 7).
ملاحظة: يسمح هذا النوع من الأرض تصور ديناميات التجديد في عدد أن خلايا.
Representative Results
أنشئت الثقافات ستنتور موثوق بها والحفاظ على من خلايا فردية أو أجزاء الخلية باستخدام المادة 1 من البروتوكول. ويرد مثال ممثل لثقافة صحية كبيرة في الفيديو 1.
وتم قياس مسار وقت التجديد في ستنتور استخدام أسلوب العلاج السكروز من أجل الشروع في تجديد المذكورة في "الخطوة 3-1"، جنبا إلى جنب مع التصوير وطريقة التحليل التي نوقشت في الفرع 4 (الشكل 7). هذه المؤامرة تشير إلى أن هناك فرقا استمرت ساعة واحدة في الوقت الذي يستغرقه السكان للخلايا للوصول إلى أي مرحلة معينة. يسمح هذا النوع من التحليل دراسة التغاير الزماني في عملية التجديد في عدد سكان لتجديد الخلايا.
ما يلي هو موجز لتوقيت التجديد التي لوحظت حتى الآن بعد عشرات من العلاجات السكروز (الشكل 4 و الشكل 6). المرحلة الأولى عندما الخلايا ستنتور تبدو وكأنها الدموع دون أي الفرقة ميمبرانيلار (هذه المرحلة يبدأ فورا بعد تبييض السكروز). وتستمر هذه المرحلة هو حاء 3-6 المرحلة 2 عند عصابة ميمبرانيلار يظهر وينمو (3-6 ح بعد العلاج السكروز). تستمر هذه المرحلة 3-4 ﻫ. المرحلة 3 هو عند بريمورديوم عن طريق الفم يظهر في نهاية مؤخرة الفرقة ميمبرانيلار (6-8 ح بعد العلاج السكروز)، ويتم نقل كل الهياكل نهاية الأمامي للخلية. وتستمر هذه المرحلة ح 1-2. عند الفرقة ميمبرانيلار وجهاز الشفوي، الذي تم التوصل إليه نهاية الأمامي للخلية، هذا وأشارت إلى انتهاء تجديد. وقد اعتمدت الخلية الشكل يشبه البوق ستنتور المميزة. وكانت الزنزانات تماما المجددة 8-9 ح بعد العلاج السكروز.
الشكل 1. لقطة من ستنتور- وترد الفرقة ميمبرانيلار وجهاز الشفوي في نهاية الأمامي للخلية. هولدفاست نهاية الخلفي من الخلية. ماكرونوكليوس ستنتور نودولاتيد. وقد جيدا تغذية ستنتور الأخضر vacuoles الأغذية المحتوية على الأغلب Chlamydomonas. شريط مقياس هو 0.5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. إنشاء قطع ستنتور - قطع الخلية يتم عن طريق التلاعب إبرة زجاج يدوياً بينما تبحث في الخلية باستخدام مجهر ستيريو تشريح متاحة تجارياً. والغرض من المناديل الورقية توفير خلفية بيضاء لرؤية خلايا الأفضل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. لقطات من الفيديو 3 توضح كيفية قص ستنتور بإبرة زجاجية. (A) A ستنتور فورا قبل الإبرة اللمسات عليه. (ب) ستنتور بلطف محشورة بين شريحة الإبرة والزجاج. A (ج) التعاقد مع ستنتور الرد على قوة الإبرة. (د) A ستنتور يجري خفض الضغط بلطف على الخلية مع الجانب من الإبرة. (ﻫ) A ستنتور قطع الآن في اثنين ولكن لا يفصل. (و) هما ستنتور الشظايا. هو شريط مقياس 0.25 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. التصور التخطيطي للمادة 3 والمادة 4 من البروتوكول. هذا بروتوكول مصورة لأداء السكروز أو علاج اليوريا والمراقبة لتجديد الخلايا. الوقت المحدد في أسفل لوحة تقاس من بداية الغسيل 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. الإعداد للمراقبة التصوير و/أو مباشرة للتجديد مع مجهر تستقيم. في كل قطره 4 ميليلتر تتدلى من ساترة، وهناك خلية واحدة قيد التجديد. المياه في الآبار التي بليت بقعة الزجاج يحد تبخر القطرات. يسمح هذا الإعداد في أعقاب تجديد خلايا متعددة في نفس الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. لقطات من ستنتور في كل مرحلة من الفرقة ميمبرانيلار وتجديد أجهزة الفم. (أ) المرحلة 1 تتميز بشكل خلية مثل الدمعة وغياب الفرقة ميمبرانيلار. (ب) المرحلة 2 يتميز بمظهر الفرقة ميمبرانيلار، وهيكل القائم على أهداب أن يدق باستمرار. عصابات ميمبرانيلار تتميز بخطوط متقطعة بيضاء في لوحات ب-دال (C و D) المرحلة 3 يتميز بمظهر بريمورديوم عن طريق الفم (ملحوظ مع سهم). بريمورديوم الشفوية يبدو وكأنه إينفاجينيشن في نهاية مؤخرة الفرقة ميمبرانيلار. سوف يتقدم بريمورديوم عن طريق الفم ثم صوب الأمامي للخلية ليصبح الجهاز عن طريق الفم. يتم إكمال التجديد (ه) عند الخلية قد اعتمد خاصية الشكل يشبه البوق ستنتور ، واتسعت على الجهاز عن طريق الفم (ملحوظ مع سهم) في نهاية الأمامي للخلية. هو شريط مقياس 0.25 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7. مكدس ارسم مربع إظهار كيفية تغيير أبعاد الخلايا في جميع مراحل التجديد بعد العلاج السكروز مع مرور الوقت. المؤامرة يظهر التباين في توقيت مراحل التجديد داخل سكان لتجديد الخلايا. "نهاية الصنع" يشير إلى انتهاء التجديد. عدد الخلايا: 28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1 من . مثال على ثقافة صحية ستنتور - عموما، إذا ثقافة مركزة، تقسيم الثقافة من المستحسن. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 2 من . تباطؤ ستنتور مع ميثيلسيلولوسي- من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 3 من . قطع ستنتور- ويمكن خفض الخلايا الفردية يدوياً إلى قطع متعددة تحت ستيريو تشريح مجهر بضغط إبرة زجاج عن طريق الخلية. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
| مشكلة مع الثقافة | علاج ممكن | الوقاية الممكنة |
| هو طغت الثقافة الروتيفر أو غيرها من الكائنات الكبيرة. | إزالة العديد من ستنتور قدر الإمكان إلى طبق ثقافة جديدة. ثم تغسل الخلايا ثلاث مرات. | يغسل ستنتور جيدا عند استلامها، حتى عند شرائها من مورد تجاري. |
| الثقافة هي غارقة في الفطريات أو الكائنات الحية الصغيرة الأخرى. | تحديد زاوية التي توجد فيها الأقل ستنتور. في هذا المجال، قم بإزالة الوسائط قدر ممكن دون إزالة العديد من ستنتور وإضافة كلمة جديدة. المزيج بلطف ولكن شاملة إلى ديستروبوتي الكائنات الغازية. تخطي تغذية القادم وسوف يأكل ستنتور لهم. | مراقبة الثقافة بانتظام وإزالة الملوثات الصغيرة عن طريق تبادل الوسائط لكلمة جديدة. |
| يتم وضع ستنتور فوق بعضها البعض. | تقسيم الثقافة حيث يكون التركيز أقل من 20 خلايا/مل. | تقسيم الثقافات أكثر في كثير من الأحيان. |
| يتم التزاوج ستنتور الخلايا. | تغذية كل 4 أيام بدلاً من كل 5 أيام. | |
| الثقافة لديها الكثير من مواد النفايات الظلام. | إزالة الكثير من المواد الداكنة، النفايات ستنتور بقدر الإمكان دون إزالة الخلايا. إذا تم إرفاق ستنتور مادة مظلمة، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً الإفراج عن الخلايا ستنتور من نفاياتها ثم قم بإزالة وسائط الإعلام مع النفايات دون إزالة الخلايا. أو إزالة تلك ستنتور وتغذية تبعاً لذلك أقل. | تغذية ستنتور 1 مل أقل الغذائية في 100 مل ثقافة. |
| يبحث الصحية (الرغوة/المتضخمة أو مقربة) ستنتور. | قم بإزالة الوسائط قدر ممكن دون إزالة الخلايا ستنتور كثيرة وإضافة كلمة جديدة. | تبادل وسائل الإعلام بانتظام. |
الجدول 1. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لاستزراع ستنتور.
Discussion
استزراع ستنتور يعرض عددا من التحديات. أولاً، لإجراء التجارب التي تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا، يحتاج المرء الإبقاء على عدد كبير من الثقافات ستنتور ، كثقافات تصبح غير صحية عندما يتجاوز تركيز ستنتور 20 خلايا/مل. ثانيا، الكائنات الحية التي يمكن أن تلوث الثقافات ستنتور غالباً ما تقسم أسرع من ستنتور وتطغى الثقافة (وهو الملوثات شائعة الروتيفر). وبالتالي، من الضروري أن تفقد الثقافة تحت مجهر بشكل دوري وإزالة الملوثات. في بعض الأحيان، يحتاج ثقافة جديدة ليبدأ من عدد صغير من الخلايا التي أنقذت يدوياً من ثقافة ملوثة. وهذا يزيد من الوقت اللازم للمحافظة على صحة جيدة ستنتور الثقافات. ثالثا، توسيع خلية واحدة إلى ثقافة 400 مل يتطلب شهر واحد على الأقل لدورة الخلية ستنتور من 3-5 أيام. رابعا، خلافا للنموذج الآخر سيلياتيس، ستنتور نادراً ما تذهب إلى شكل كيسه وأنهم لا يمكن أن تجمد.
جانبا مهما من استزراع ستنتور هو اختيار كائن حي الغذاء المناسب. أساليب مختلفة لاستزراع ستنتور وصفت سابقا. واحد منهم يقترح استخدام اللبن المقشود للبكتيريا الثقافة التي تغذي ثم ستنتور. هذه تقنية فعالة في استزراع ستنتور؛ ومع ذلك، يتطلب تطبيق تقنيات الجينوم عينات نقية لتجنب الارتباك الناجم عن قراءة الجينوم من الكائنات الحية الغذاء غير معروف. استخدام البروتوكول الحالي، يمكن زراعتها ستنتور في الكتلة و، لأنه قد تم تعيين تسلسل طعامهم، تشلاميدوموناس،، يمكن الكشف عن وجود تلوث الجينوم من الكائنات الحية الغذاء وتسيطر عليها. لأسباب غير معروفة، كان التكلس تجديد المخزونات له بالعودة إلى حيث وجد ستنتور قبل. مع البروتوكول الحالي، وقد تمكنا من إبقاء ستنتور لسنوات.
تجارب التجديد مع ستنتور واضحة عموما، ولكن هناك بعض التفاصيل الهامة نضع في اعتبارنا. وفيما يتعلق بالمادة 2، قطع ستنتور يمكن أن يتقن الخلايا في نصف دقيقة. وقد يتطلب إتقان إجراءات الجراحة أكثر تقدما من ستنتور أسبوع ممارسة. وفي حين أداء علاج السكروز أو اليوريا (الجزء 3)، إذا في بداية تصوير معظم الخلايا لا تزال تلك العصابات ميمبرانيلار، زيادة وقت الحضانة من 10-30 ثانية لعندما يتم تنفيذ المعاملة السكروز التالية. لا تزيد وقت المعاملة السكروز خارج الحضانة 3 دقيقة نظراً لأنه سوف يؤدي إلى موت الخلية.
التصوير من ستنتور يتطلب تجديد الأساليب بصورة كبيرة الخلايا على مدى فترات طويلة من الزمن. يمكن استخدام أسلوب التصوير بالتفصيل في القسم 4 فقط مع مجهر تستقيم. ثم إذا كان متوفراً مجهر مقلوب بدلاً من ذلك، يمكن وضع الخلايا على الشريحة أو ساترة في الدوائر الصغيرة. أسلوب واحد إنشاء دائرة من فازلين وتغطي مع آخر ساترة لمنع التبخر. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء دائرة لخلية مفردة بصنع حفرة لكمه ثقب من الحجم المطلوب في 1 × 1 سم2 مربعة من مباعدة السيليكون (الجدول للمواد)، وضع فاصل على ساترة، ووضع الخلايا في قاعة ، والتي تغطي الدائرة مع ساترة آخر. عند التصوير، وإذا لم ستنتور في الاتجاه الصحيح مراعاة السمات المميزة لكل مرحلة من التجدد، اضغط على لوحة بحزم لجعل العقد من الخلية. مشاهدة الخلية تمتد إلى تحديد مرحلة التجديد (ملحق كامل يأخذ حوالي 45 ثانية). إذا كانت الخلية لا تزال في اتجاه خاطئ، كرر التنصت. واتخذت هذه الصور هو مبين في الشكل 1 و الشكل 6 مجهر تكبير ستيريو؛ ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب بالتفصيل استخدام 5 × تشريح مجهر ستيريو.
يتمثل التحدي الآخر إلى جانب استزراع والتصوير ستنتور تتبع للتجديد، على وجه التحديد مقدار الوقت اللازم التعرف على مراحل. إذا كانت الخلية تجديد المنحى تماما مع منطقة بريمورديوم الشفوية واضحة للعيان، تحديد المرحلة التي تستغرق بضع ثوان. في بعض الأحيان، ومع ذلك، الخلية ستنتور في اتجاه الحيلولة دون تحديد واضح لمرحلة التجديد، ومن ثم أخذ مزيد من الوقت لتحديد. القدر الكبير من الوقت المطلوب لمرحلة الخلايا تجديد الفردية قد يؤخر التقدير الكمي للخلايا تجديد كافة، وبالتالي تقليل الدقة الزمنية التدريج والتي تتطلب المراقب الانتظار وإعادة الصورة الخلية بعد ذلك انتقل إلى توجه جديد. ونتيجة لذلك، هي هذه التجربة المرة وكثيفة العمالة. لهذه الأسباب، سيكون من المرغوب فيه جداً لتطوير أساليب مؤتمتة للكشف عن الخلايا ستنتور وتعيين مراحل التجديد في بيانات الفيديو مجهرية. هذه سوف تسمح أيضا لمزيد من التجارب استنساخه، زيادة في حجم العينة، وإزالة التحيز القائم على البشرية.
قد بدأ ظهور أساليب الجينوم والبروتين حساسة للغاية لوضع دراسات للخلايا المفردة في الوصول. لمثل هذه التحليلات خلية واحدة، يجعل حجم خلية ستنتور العملاقة موضوع اختبار المرغوب فيه لتجارب إثبات المفهوم. لهذه التجارب وذلك يكون من الممكن، استزراع ستنتور هو أمر أساسي، ومن ذلك الأساليب الموصوفة هنا ينبغي أن تلعب دوراً في زيادة تطوير تقنيات أكثر تقدما من خلية واحدة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة المنحة R01 GM113602 (الحركة) وجبهة الخلاص الوطني 1144247 (AL). ونعترف سلابودنيك مارك وناتالي كيركلاند لتطوير الإصدارات الأولية من بعض من هذه البروتوكولات ومناقشات غنية بالمعلومات. ونحن نشكر بيرلازا كارينا ولويس غريسون لقراءة نقدية من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
- Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. Molecular "vitalism". Cell. 100 (1), 79-88 (2000).
- Shulman, J. M., St Johnston, D. Pattern formation in single cells. Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).
- Wloga, D., Frankel, J. From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila. Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).
- Frankel, J. Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , Oxford University Press. Oxford. (1989).
- Tartar, V. Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus. Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).
- Lillie, F. R. On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures. Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).
- Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).
- Tartar, V. Biology of Stentor. , Pergammon Press. Oxford. (1961).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).
- Harris, E. The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).
