Summary
거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.
Abstract
셀은 외부 섭에서 회복 하기 위해 그들의 부분을 다시 생성할 수 있이 필요가 있다. 단 세포 ciliate Stentor coeruleus 는 상처 치유 공부에 우수한 모델 유기 체 및 후속 세포 재생입니다. Stentor 게놈 최근, RNAi 등 현대 분자 생물학 방법을 함께 제공 되었다. 이러한 도구는 단일 세포 재생 분자 수준에서 연구를 가능 하 게. 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 단일 셀 또는 셀 조각 Stentor 문화를 유지 하는 것에 대 한 일반 지침과 함께 수립 Stentor 셀 문화를 다루고 있습니다. 생화학, 시퀀싱, 그리고 질량 분석 같은 유용한 도구를 사용 하 여 대량에서 Stentor 경작 할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 섹션 커버 Stentor재생을 유도 하는 다른 접근 방식. 수동으로 유리 바늘으로 세포를 절단 셀의 앞쪽 끝에 있는 특정 구조의 재생을 공부 하 고 수 자당 또는 요소 셀 치료 큰 셀 부품의 재생을 공부 수 있습니다. 이미징 개별 재생 셀에 대 한 방법은 준비 하 고 중생의 역학 분석 표제와 함께 제공 됩니다. 중생의 전체 과정은 3 단계로 분할 된다. 시각화의 진행 단계를 통해 세포의 인구 역학, 여 재생 타이밍에이 증명 됩니다.
Introduction
세포의 효소, 하지만 그 구성 요소는 신중 하 게 정확한 크기로 조정 하 고 잘 정의 된 위치에서 배열 오히려 매우 복잡 한 기계 간단한 가방 않습니다. 개별 셀의 morphogenesis 셀과 발달 생물학, 핵심 프로세스를 나타내지만 그것의 분자 메커니즘은 알 수 없는1,2. 동안 일부 교양된 셀 모양을 닮은, 단 세포 유기 체 수는 매우 복잡 한 아키텍처, ciliates3,4복잡 한 대뇌 피 질의 패턴에 의해 exemplified.
아마도 가장 극단적인 예를 고도로 구조화 된 셀의 거 대 한 heterotrichous ciliate Tetrahymena Paramecium 하 먼 관련 Stentor coeruleus, 이다. Stentor 길이 1 m m 이며 속눈썹 microtubule 리본 전체 셀의 길이 실행 하는 병렬 스택 주최의 행으로 교체 하는 블루 안료의 이상의 100 세로 줄무늬를 덮여 있다. 셀은 트럼펫-모양 (그림 1), membranellar 밴드와 그것의 앞쪽 끝과 후부 끝 기판에 셀 연결 holdfast 구강 장치 (OA). 분명 이전 후부 극성 외 셀 또한 보여줍니다 독특한 랄 패턴화 속눈썹 행 사이의 간격 점차적으로 시계 방향으로 증가 되도록. 불연속 좁은 행 만나는 넓은 행 및 셀 표면에의이 지역에서에서이 결과 스트라이프 대비의 소재 시로 알려진, 앞쪽 끝 구조에 다른 셀5, 융합 때의 두 번째 세트의 형성을 일으킬 수 있다 공식적으로 Spemann의 조직자에 해당 하 고 있습니다. 따라서, 개발 생물학의 모든 주요 프로세스에 있는 그들의 아날로그 Stentor: axiation, 패턴 형성, 그리고 유도. 배아, Stentor다른 세포 사이 에서도 이러한 프로세스 운명 차이 의해 구동 됩니다, 그리고 그들은 운명 단일 셀 내의 다른 지역 간의 차이 의해 구동 되어야 합니다. 무슨 Stentor 내에서 지역 간의 차이점을 정의 신비 이다.
Stentor 의 일부 차단 하는 경우 셀의 푸는 시간에 정상적인 세포를 재생할 수 있습니다. 셀 경우 절반, 또는 훨씬 더 작은 조각으로 심지어 각 조각 정상 찾고 하지만 작은 셀으로 재구성 하 여 잘라내어 셀 부품6,7사이의 적절 한 비례를 복구. 심지어 작은 조각, 1/64번째 원래 셀의 크기는 작지만 일반적으로 잡힌 셀으로 다시 생성 하 고 다음 전체 크기6성장 수 있습니다. Stentor 따라서 세포 기관이 크기 스케일링 및 세포 성장 규제의 조직 또는 전체 유기 체 수준에 일반적으로 적용 되는 수술 방법을 사용 하 여 기계 장치를 공부 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
Stentor 수술 작업의 넓은 범위에서 재생성 하 수의 속성 중 하나는 단일 nodulated macronucleus (그림 1)8전체 게놈 약 50000 사본을 포함입니다. 셀 조각 macronuclear 노드를 하나 이상 포함, 그것은 완벽 하 게 다시 생성 하는 기능. Stentor의 재생 능력을 기본 또 다른 재산의 막대 한 상처 치유 능력 이다. 많은 세포 유형9그들의 상처 치유 할 수 있다, 비록 Stentor 물리적 섭의 특별 한 범위에서 복구할 수 있다. Stentor10 세포질 흐름을 시각화 하는 방법 함께 과감 한 섭 동에서 Stentor 복구의 예로 이전 보고 되었다. 이러한 메서드는 세포질의 물리적 상태 어떻게 부상 하 고 이후 재생 영향의 연구를 수 있습니다.
Stentor의 거 대 한 크기, 특별 한 재생 능력, 그리고 사실 (예: 조직, axiation, 및 패턴화) 다세포 배아에서 발달 현상의 많은 명단 매력 중 많은 발달 생물학 토머스 헌트 모건7을 포함 하 여 지난 세기의 켜십시오. 50 년대와 60 년대 동안 microsurgical 접근 입증이 단 세포 유기 체11에서 재생 및 전체적 프로세스의 놀라운 배열. 그러나, Stentor 개발 되었습니다 분자 생물학 모델 시스템으로 최근에. 지난 몇 년 동안 Stentor 의 게놈 시퀀싱은8, 조립 하 고 먹이로 RNAi를 사용 하 여 유전자 발현을 교란 하는 방법은 개발된12살.
Stentor 현대 분자 생물학만을 위한 모형 유기 체에 개발 되었다 이유 중 하나는 최근 성장 때문에 그것의 긴 세포 주기 (3 ~ 5 일) 큰 문화의 어려움 이었다. 그러나 현대 genomic와 proteomic 방법 그들은, 사용 하 고 단일 Stentor 셀의 볼륨은 단일의 분석을 위해 개발 된 磁 방법에의 지 없이 이러한 방법에 대 한 충분 한 보다 더 적은 물자를 요구 하는, 셀 Stentor보다 훨씬 작은. 프로토콜의 섹션 1 단일 Stentor 셀에서 큰 문화를 설정 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 동일한 접근 셀 절단에 의해 얻은 세포 조각에서 큰 문화 확립을 사용할 수 있습니다. 섹션 1은 또한 시간의 오랜 기간 동안 건강 한 Stentor 문화를 유지 하기 위한 지침을 제공 합니다. 프로토콜의 섹션 2 유리 바늘으로 셀을 수동으로 절단 하 여 세포 재생을 유도 대 한 방법론을 제공 합니다. 특정 셀 구조 (membranellar 밴드와 구강 장치)의 재생을 유도 하는 두 가지 방법에 전념 하는 프로토콜의 제 3: 다음 이러한 구조를 흘리기 이끌어 자당 또는 요소 셀 치료 그들의 재생입니다. 프로토콜의 제 4 시간의 오랜 기간 동안 개별 재생 세포의 영상에 대 한 방법을 자세히 설명합니다. 제 4 단계의 중생과 중생 역학의 분석에 대 한 도움말의 설명으로 끝납니다.
Protocol
1. 배양 Stentor 와 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 문화
- Chlamydomonas reinhardtii 문화 Stentor위한 음식으로 사용할 준비.
- 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 Chlamydomonas reinhardtii 셀을 가져옵니다.
- 메 마른 기술13를 사용 하 여 상업적으로 이용 가능한 탭 미디어에 Chlamydomonas reinhardtii 의 500 mL 액체 문화를 설정 합니다.
- 일주일에 두 번 탭 미디어와 그것을 diluting 하 여 램프 아래 Chlamydomonas 문화 (약 1의 마약)에서 채도 근처 농도 유지.
참고: Chlamydomonas 문화 통에 성장 될 수 있다. - 정기적으로 문화의 한 방울 슬라이드에,는 coverslip로 덮고 놓고 40 X 확대 현미경 검사 Chlamydomonas 문화 건강 인지 확인 하십시오.
참고: Stentor 먹이 세균으로 오염 되 또는 Chlamydomonas 셀 클러스터로 집계 하는 경우에 대 한 문화를 사용 하지 마십시오. 이러한 문제 중 하나가 발생 하면, 새로운 Chlamydomonas 문화 시작.
- 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 Stentor coeruleus 셀을 가져옵니다.
- Stentor 세포는 필요한 경우 그들의 자연 서식 지에서 연못, 호수 또는 강11에서 그들을 수집 합니다.
- 수집 Stentor 연못, 호수 또는 강, 물이 상대적으로 그늘, 조용 하 고 분명 일부 식물 지역 찾아.
참고: 찾는 Stentor 내려면 성장 위치에서의 더 높은 확율이 있다. - 부 어 쉽게 용기에 물 2 리터 이상 수집 합니다.
- 암 및 미 립 자 물질 컨테이너의 하단에 정착, 한 후 부드럽게 Stentor, 대형 컨테이너에 정착 암 설에 대 한 각 컬렉션 후 몇 초 동안 대기에 대 한 검사를 몇 가지 작은 컨테이너를 입력 합니다.
- 샘플의 수집 위치에 완료 되 면 적어도 10 m 거리는 새 위치로 이동 하 고 거기 샘플의 컬렉션을 반복.
참고: 모든 연못 인구가 Stentor , 그래서 여러 연못 수 샘플링을 할 수 있습니다. - 실험실 샘플으로 돌아갑니다 하 고 개별 접시에 물 컨테이너에서 전송.
- 각 페 트리 접시에 5 배 확대에 비스듬한 빛 stereomicroscope Stentor 에 대 한 검색. 저온 살 균된 상용 샘물 (PSW)의 적어도 100 µ L를 포함 하는 유리 자리 접시의 우물에 1 mL 피 펫을 사용 하 여 개별 Stentor 셀을 전송 합니다.
참고: Stentor 세포 기판 (그림 1)에 연결 하는 경우 나 팔 모양에 있다. 수영 Stentor 세포는 기질 (비디오 1)에 연결 된 셀 보다 덜 확장. - PSW 적어도 3 Stentor 워시 x. 세척 Stentor 셀에 잘 유지 하면서 우물에서 물의 약 90%를 제거 하 여 수행 우물에 PSW의 500 µ L을 추가 하 여 다음.
참고: Stentor 펫 피 펫 팁 10 µ L의 또는 더 작은 사용 하 여 처리 하기 전에 잘라 큰 셀 흐르는 생성 되는 전단 세력으로 인해 셀 부상 방지를 위로 피 펫 팁의 끝에서 약 0.5 m m 팁 op의 너무 작은 ening입니다.
- 수집 Stentor 연못, 호수 또는 강, 물이 상대적으로 그늘, 조용 하 고 분명 일부 식물 지역 찾아.
- 각 Stentor의 먹이 기 전에 Chlamydomonas 를 준비 합니다.
- Chlamydomonas 문화 단계 1.1에서 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 준비의 1 mL를 전송 합니다. 3 분 2,095 x g에서 원심.
- 제거는 상쾌한 고 PSW의 1 mL에 펠 릿을 resuspended. 2,095 x g 3 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 PSW의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.
참고: 따라서, 세척 하 고 집중된 Chlamydomonas 참조 됩니다 "Chlamydomonas"준비로 다음 단계에서. 탭 미디어 Stentor, 따라서 Stentor 먹이 것이 중요 하기 전에 Chlamydomonas 를 세척에 유해 하다.입니다.
- 클론 Stentor 문화, 필요한 경우 개별 Stentor 셀 또는 셀 조각에서 문화를 시작 합니다.
- 때문에 단일 Stentor 셀 PSW에서 잘 성장 하지 않는다, 필터 미디어는 기존, 건강 Stentor 문화에서의 500 µ L를 살 균 하 여 바른된 미디어를 준비 합니다.
- 유리 자리 접시의 우물 중 하나에 500 µ L의 조건된 미디어를 전송 합니다.
- 한 Stentor 조건된 미디어를 포함 하는 유리 자리 접시의 우물에 전송 합니다. 사용 가능한 작은 매체로 전송.
- 모든 48 h 준비 Chlamydomonas 의 각 Stentor 5 µ L를 피드. 때 Stentor 분할, 우물에 있는 셀의 수를 계산 하 고 셀 당 준비 된 Chlamydomonas 의 5 µ L를 추가 합니다.
- 그늘진된 장소에서 계속 Stentor 이후 셀 (예를 들어 투명 한 플라스틱 상자 종이 타 올으로 덮여)에 빛에 민감합니다.
- 신선한 조절된 매체 모든 96 h와 잘에서 Stentor 매체를 교환 합니다.
- 1.5.1 단계에서 신선한 조건된 미디어를 준비 합니다.
- 부드럽게 잘에서 아래로 액체 pipetting 우물의 바닥에서 분리 모든 Stentor 셀을 확인 합니다.
- 신중 하 게 잘 사용 하는 모든 셀에는 잘 남아 있는지 1 mL 피 펫에서 액체 발음. 우물에 신선한 바른된 미디어의 500 µ L를 추가 합니다.
- 잘 셀 수 20을 초과 하면 더 큰 컨테이너, 예를 들어 넓은 입 유리 항아리에 셀을 이동 합니다.
- 압력가 넓은 입 유리 항아리에 PSW의 20 mL를 추가 합니다.
참고: Stentor 에 대 한 유리의 압력가 마로 소독 세척을 조심 하 고 rinsing 교체할 수 있습니다. - 조심 스럽게 미디어를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱에 우물의 바닥에서 모든 셀을 분리를 잘. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 모든 Stentor 셀을 수집 하 고 부드럽게 유리 항아리에 그들을 전송.
- 압력가 넓은 입 유리 항아리에 PSW의 20 mL를 추가 합니다.
- Stentor 문화, 공기에 대 한 충분 한 액세스를 허용 하도록 함께 항아리에 뚜껑을 조여 하지 마십시오.
- 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지를 항아리 마다 48 h에 PSW를 추가 합니다. 눈으로 셀의 밀도 견적 한다.
참고: 또는, 문화의 1 mL를 피펫으로 벽에서 분리 하 고 피 펫 팁에 있는 셀의 개수를 셀 수 있도록 항아리에 거품 공기 1 mL 피 펫을 사용 합니다. - 모든 48 h Stentor 문화 단지 (단계 1.4 참조)에 대 한 피드 Chlamydomonas 준비. 준비 된 Chlamydomonas의 200 µ L로 문화를 먹이 함께 시작 합니다. 문화의 볼륨 증가, 점차 준비 Chlamydomonas 먹이 1 mL에 대 한 사용의 양을 증가 합니다.
- 문화 볼륨 항아리의 능력의 약 90%를 도달 하는 때, 더 큰 컨테이너에는 문화를 전송 합니다.
- 유리에서 Stentor 분리를 1 mL 피 펫과 항아리, 내부 문화를 아래로, 플라스틱.
- 2 컵 유리 용기에 병의 전체 내용을 부 어.
- PSW의 나머지 Stentor수집 2 컵 유리 용기에 약 25 mL와 함께 항아리를 씻어.
- 2 컵 유리 용기에 건강 한 문화를 유지 합니다.
- 4-5 일 마다 Stentor 문화 문화의 100 mL 당 준비 된 Chlamydomonas 의 2 개 mL를 피드. 추가 PSW 유리 컨테이너에 4-5 일 마다 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지 합니다.
참고: 450 mL 2 컵 컨테이너를 보유 하 고 최대 볼륨입니다. - 일주일에 한 번 검사 해 부 현미경 rotifers, 곰 팡이, 그리고 다른 성장에 대 한 X 5에서 문화. 문화의 건강, 연장 1 mL 피 펫을 사용 하 여 비정상적으로 모양 하 고 무색 Stentor 셀 함께 오염 미생물을 제거 합니다.
- 유리 컨테이너는 전체 약 90% 때 분할 문화.
- 유리 컨테이너에 PSW 25 mL를 추가 합니다. Stentor 유리에서 분리 하려면 아래로 25 mL 피 펫 피 펫을 사용 합니다. 문화의 약 50%는 새로운 2 컵 유리 컨테이너에 이동 합니다.
- 두 문화에 PSW 25 mL를 추가 하 고 프로토콜의이 섹션에 설명 된 대로 두 개의 문화를 유지 하는 계속.
참고: Stentor 세포 높은 온도에 민감한 때문에, 문화 유지 됩니다 방에 온도 25 ° c 이하로 유지 합니다. 또는, 문화 인큐베이터에 보관 될 수 있습니다. Stentor 경작의 문제 해결 표 1 을 참조 하십시오.
- 4-5 일 마다 Stentor 문화 문화의 100 mL 당 준비 된 Chlamydomonas 의 2 개 mL를 피드. 추가 PSW 유리 컨테이너에 4-5 일 마다 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지 합니다.
2. 절단 Stentor 세포 재생을 유도
- 다음과 같이 프로그램을 사용 하는 모 세관 튜브에서 여러 바늘을 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여: 열-735, 풀-100, 110, 시간-속도 150, 압력-400.
- PSW 50 mL에 4% 스 솔루션을 준비 합니다.
- 스의 1 g 추가 (점도: 1500 cP) PSW의 50 ml.
- 스의 해체를 촉진 하기 위하여 적어도 8 h 4 ° C에서 품 어.
- 실 온에서 4% 스 솔루션을 유지.
- 인하를 수행한 후 셀 파편을 저장 하기 위한 자리 유리 접시를 준비 합니다.
- 필터 미디어는 건강 한 문화, 잘 필요한 자리 유리판 당 500 mL를에서 소독.
- 필요한 우물의 각 소독된 미디어의 500 mL를 전송 합니다.
- 2 µ L 방울에 한 건강 한 Stentor (정의 된 트럼펫 모양, 선명한 블루-그린 색상, 그리고 더 큰 그들 데)를 수집 하 고 coverslip 또는 슬라이드에 배치. 4% 스 (그림 2)의 2 µ L를 추가 합니다. Stentor (동영상 2) 절단 하기 전에 천천히 하자.
- 바늘을 침입을 방지 하기 위해 가능한 절단 표면에 평행으로 유리 바늘을 잡으십시오.
- 해 부 현미경 스테레오를 사용 하 여 유리 바늘의 팁 찾아서 셀 (그림 3A)에 가까이 이동 합니다. 바늘 (그림 3B와 C)과 접촉 시 Stentor 계약을 관찰 합니다.
참고: 셀이 어려운 후부 끝에서 앞쪽 끝을 분리 하는 방향으로, 회전 그것은 매우 부드럽게 바늘의 측면. - 조심 스럽게 두 셀을 잘라 유리 바늘의 측면과 Stentor 계약된 누릅니다(그림 3D 및 E, 비디오 3). 2 개의 파편 떨어져 그들을 피하기 위해 조각 퓨전 사이 세포질 연결 되도록 이동 (그림 3 층).
- 두 조각 간접 조명 해 현미경 파편을 검사 하 여 각 하나 이상의 macronuclear 노드를가지고 여부를 확인 합니다.
참고: macronuclear 노드를 하나 이상 갖는 세포 생존을 위해 필수적입니다. 셀 수 있습니다 동안 이나 컷 청록색 안료와 함께 자사의 박막 (투명 셸) 창. 대부분의 경우에서이 셀의 장기적인 생존 능력 영향을 주지 것입니다. - 준비 단계 2.3에서 유리 자리 접시의 우물에 조각을 이동 합니다.
- 잘라 셀의 일부분을 다시 생성 하지 것입니다 때문에 여러 셀을 잘라.
- 한 세션에서 여러 컷을 수행 하는 경우 대체 유리 바늘 Stentor 잔류물 또는 팁 깨졌습니다 코팅 무 겁 게 된다 때. 또는 부드럽게 실리콘 스페이서의 조각에 그것을 닦아 하 여 바늘을 청소.
참고: 유리 바늘 여러 셀 절단 세션 사용할 수 있습니다. - 습도 챔버에 세포 파편 자리 유리판을 유지.
- 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 결과의 해석을 진행 합니다.
3. Membranellar 밴드 및 자당 또는 요소 치료 구강 장치의 재생을 유도
- 자당을 사용 하 여 Membranellar 밴드와 구강 장치 제거
- PSW에 자당의 25% 솔루션을 준비 합니다.
- PSW에 스냅 캡 microcentrifuge 튜브 25% 자당의 500 µ L를 추가 합니다.
- 자당 치료 후 셀을 세척을 위한 3 microcentrifuge 튜브 각 튜브에 PSW의 1 mL와 스냅 모자를 준비 합니다.
- 1 mL 피 펫 (그림 4, 화살표 A)를 사용 하 여 별도 microcentrifuge 관으로 그들의 문화 미디어의 1 mL에 30-60 Stentor 세포를 수집 합니다.
- 125 µ L 최종 볼륨 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 단일 무승부에에 튜브에서 모든 세포를 수집 합니다. 20% 자당 솔루션 (그림 4, 화살표 B)의 625 µ L를 25% 자당 (단계 3.1.2에서에서 준비)의 500 µ L로 튜브를 그들을 전송. 스톱 워치를 시작 합니다.
- 이 20% 자당 해결책에 톡-스핀 1 분 동안 랙에서 microcentrifuge 튜브 Stentor 를 품 어.
- 하나의 무승부에 있는 모든 셀을 수집 (쉽게 컬렉션에 대 한 200 µ L 최대 용량 피펫으로 조정).
- 초시계 자당 치료의 2 분 표시 될 때까지 피 펫 팁에 셀을 계속.
- Microcentrifuge 튜브 3.1.3 (그림 4, 화살표 C) 단계에서 준비의 하나로 Stentor 를 꺼냅니다. 영화-스핀 랙에서 튜브입니다.
- 두 번 더, 한 번 PSW를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 남은 두의 각 준비 단계 3.1.3 (그림 4, 화살표 D와 E)에서 세포를 씻어.
참고: 단일 그리기 셀 컬렉션 기술은 세척 사이 중요 하지 않습니다. - 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 역학 (그림 4, F와 G 화살표)의 해석을 진행 합니다.
- 요소를 사용 하 여 Membranellar 밴드와 구강 장치 제거
- PSW에 4% 우 레 아의 솔루션을 준비 합니다.
- PSW에 스냅 캡 microcentrifuge 튜브 4% 우 레 아의 300 µ L를 추가 합니다.
- 셀 요소 처리 후 세척을 위한 각 관에서 PSW의 1 mL를 포함 하는 스냅인 모자 3 microcentrifuge 튜브를 준비 합니다.
- 1 mL 피 펫 (그림 4, 화살표 A)를 사용 하 여 별도 microcentrifuge 관으로 그들의 문화 미디어의 1 mL에 30-60 Stentor 세포를 수집 합니다.
- 300 µ L 최종 볼륨 1 mL 피 펫을 사용 하 여 단일 무승부에에 튜브에서 모든 세포를 수집 합니다. 2% 요소 솔루션 (그림 4, 화살표 B)의 600 µ L를 그들 4% 우 레 아 (단계 3.2.2에서에서 준비)의 300 µ L와 튜브 전송. 스톱 워치를 시작 합니다.
- 이 2% 우 레 아 해결책에 톡-스핀 1 분 동안 랙에서 microcentrifuge 튜브 Stentor 를 품 어.
- 하나의 무승부에 있는 모든 셀을 수집 합니다.
- 초시계 요소 치료의 2 분 표시 될 때까지 피 펫 팁에 셀을 계속.
- 3.2.3 (그림 4, 화살표 C) 단계에서 준비 microcentrifuge 튜브의 하나로 Stentor 를 꺼냅니다. 영화-스핀 랙에서 튜브입니다.
- 두 번 더, 한 번 PSW를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 남은 두의 각 준비 단계 3.2.3 (그림 4, 화살표 D와 E)에서 세포를 씻어.
참고: 단일 그리기 셀 컬렉션 기술은 세척 사이 중요 하지 않습니다. - 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 역학 (그림 4, F와 G 화살표)의 해석을 진행 합니다.
4. 이미징 및 세포 재생 분석
- 교수형을 사용 똑바로 현미경을 사용 하 여 개별 셀의 이미지 재생 방울 방법.
- 유리 자리 접시의 우물에 PSW의 100 µ L를 넣어.
- 문화 미디어 (그들은 미디어)의 4 µ L에 1 Stentor 셀을 분리, 플라스틱 10 또는 20 µ L를 사용 하 여. 22 x 22 m m2 coverslip (그림 5)의 한가운데에 작은 물방울을 예금 한다.
참고: 경우 셀에는 1) 건강에 해로운 (비정상적으로 모양 또는 무 겁 게 vacuolated) 또는 2) 아직도 membranellar 밴드 또는 구강 기관 (대 한 화학 치료 실험), 이미징에 사용 하지 마십시오. - 작은 물방울 사이 충분 한 공간을 떠나 하는 동안 이전 방울 주위 문화 미디어에서 Stentor 4 더 많은 방울을 정렬 합니다.
- 방울과 coverslip 반전 하 고 부드럽게 된 PSW 단계 4.1에서 추가 된 유리 자리 접시의 잘 위에 그것을 배치.
- 참고: PSW 우물에서 물방울 (그림 5)의 증발을 최소화 합니다.
- 4.1.4 4.1.1-단계에 따라 영상에 대 한 나머지 셀을 준비 합니다.
- 재생 셀 원하는 시간 분해능으로 현미경 이미지. 또는 재생 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 관찰 합니다.
참고: 재생 셀 절단 또는 자당 또는 요소와 치료 후 즉시 시작 됩니다. 그러나, 보이는 새로운 구강 구조는 중생의 시작 후 약 3 h를 형성할 것 이다.
- 각 시간 지점에 대 한 각 셀의 3 개의 재생 단계 중을 할당 합니다. 이렇게 하려면 (그림 4 및 그림 6) 단계를 설명 하는 대표 이미지를 각 셀을 비교 합니다.
- 1 단계는 membranellar 밴드 아직 (그림 6A)가 없는 셀에 할당 합니다.
- 2 단계 membranellar 밴드와 셀에 할당 합니다.
참고: membranellar 밴드 (그림 4, 그림 6B) 치료 후 3-6 h에 나타납니다. 이 단계의 끝부분에 membranellar 밴드의 후부 끝의 추가 곡률 구두 primordium 나타납니다 하기 바로 전에 표시 됩니다. - 3 단계 구강 primordium 셀에 할당 합니다.
참고: 구두 primordium membranellar 밴드 (그림 4, 그림 6 c 6 d)의 후부 끝에 치료 후 6-8 h를 표시 하는 invagination입니다. 재생 세포는 그들의 앞쪽 끝과 특성 트럼펫 셀 모양 (그림 4, 그림 6E) membranellar 밴드 때 완료 됩니다. 대부분 Stentor 세포 재생의 시작부터 8-9 h 이내 완전히 재생성 됩니다.
- 각 스택된 상자 그림 (그림 7)의 형태로 각 시간 지점에 대 한 재생 단계에 있는 세포의 백분율을 플롯 합니다.
참고:이 유형의 플롯 셀의 인구에서 재생 역학의 시각화 수 있습니다.
Representative Results
Stentor 문화를 안정적으로 설립 하 고 개별 셀 또는 셀 조각을 사용 하는 프로토콜의 섹션 1에서 유지 되었습니다 있다. 큰 건강 한 문화에 대 한 대표적인 예제 비디오 1에 표시 됩니다.
중생의 시간 과정 Stentor 시작 단계 3.1, 이미징 및 제 4 (그림 7)에서 설명 하는 분석 방법에서에서 설명 하는 재생에 대 한 자당 치료 방법을 사용 하 여 측정 했다. 이 음모는 어떤 특정 단계에 도달 하 셀의 인구에 의해 걸린 시간에서 한 시간 동안 확산 임을 나타냅니다. 이러한 유형의 분석 셀 회생의 인구에서 재생성 과정에서 시간적이의 연구를 수 있습니다.
다음은 지금까지 수십 자당 치료 (그림 4 및 그림 6) 후 관찰 되었습니다 재생 타이밍의 요약 이다. (이 단계는 자당 희미하게 직후 시작) 어떤 membranellar 밴드 없이 눈물 처럼 Stentor 셀 1 단계 때. 이 단계는 3-6 h. 단계 2는 membranellar 밴드 나타나고 (자당 치료 후 3-6 h) 성장 하는 때 지속 된다. 이 단계는 3-4 h. 3 단계 구강 primordium membranellar 밴드 (자당 치료 후 6-8 h), 후부 끝에 나타나고 두 구조는 셀의 앞쪽 끝으로 이동 하는 경우에 대 한 지속. 이 단계는 1-2 시간 지속 된다. Membranellar 밴드와 구강 장치 셀의 앞쪽 끝에 도달 하면,이 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 특성 Stentor 트럼펫 모양을 채택 했다. 셀 자당 치료 후 완전히 거듭난된 8-9 h를 했다.
그림 1입니다. 스냅숏 Stentor의. Membranellar 밴드와 구강 장치는 세포의 앞쪽 끝에 표시 됩니다. holdfast 셀의 후부 끝 이다. Stentor macronucleus nodulated입니다. 잘 먹이 Stentor 녹색 식품 그들 주로 Chlamydomonas를 포함 하는. 눈금 막대는 0.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Stentor 절단 설정. 셀 절단 수동으로 상용 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 셀을 보는 동안 유리 바늘을 조작 하 여 수행 됩니다. 티슈 페이퍼의 목적은 흰색 배경에 더 나은 셀 참조를 제공 하는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 비디오 3 유리 바늘 Stentor 를 잘라 하는 방법을 보여주는 스냅샷. (A) A Stentor 직전 바늘 접촉 그것. (B) A Stentor 바늘과 유리 슬라이드 사이 부드럽게 압착. (C) A 계약 Stentor 바늘의 힘에 반응. (D) A Stentor 눌러 부드럽게 셀에 바늘의 측면으로 절단 되 고 (E) A Stentor 하지만 지금 두 잘라 분리 되지 않는다. (F) 두 개의 Stentor 파편. 눈금 막대는 0.25 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 제 3과 제 4 프로토콜의 구조 시각화. 이것은 자당 또는 요소 치료 및 세포 재생의 관찰을 수행 하기 위한 그림된 프로토콜 이다. 하단 패널에 표시 된 시간 세척 1의 시작에서 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 똑바로 현미경으로 중생의 이미징 및 직접 관찰에 대 한 설정. 각 4 µ L 드롭릿은 coverslip에서 매달려, 한 세포 재생을 겪고 있다. 유리 자리 접시의 우물에 물 방울의 증발을 제한합니다. 이 설정을 동시에 여러 세포의 재생에 따라 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. Membranellar 밴드와 구강 장치 재생의 각 단계에서 Stentor 의 스냅샷. 1 단계 (A) 눈물 모양의 셀 모양 및 membranellar 밴드의 부재에 의해 특징입니다. (B) 단계 2 속눈썹 기반 구조를 지속적으로 뛰는 membranellar 밴드의 외관 특징 이다. Membranellar 밴드 패널 B에에서 흰색 파선으로 표시 됩니다-디 (C, D) 3 단계 구강 primordium (화살표 표시)의 외관에 의해 특징입니다. 구두 primordium membranellar 밴드의 뒤 끝에는 invagination 처럼 보인다. 구두 primordium 됩니다 다음 구강 장치 될 셀의 앞쪽을 향해 이동 합니다. (E) 재생 셀 Stentor 트럼펫 모양, 특성을 채택 했다 하 고 구강 장치 (화살표 표시) 셀의 앞쪽 끝에서 확대가 완료 됩니다. 눈금 막대는 0.25 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. 스택 상자 플롯 표시 어떻게 자당 치료 후 재생의 모든 단계에서 세포의 비율 시간이 지남에 변경. 음모 재생 세포의 인구 내의 재생 단계의 타이밍에서이 보여 줍니다. "최종 등록" 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 개수: 28. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1입니다. 건강 한 Stentor 문화의 예. 일반적으로, 문화는 집중, 문화를 나누는 것이 좋습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2입니다. 스와 Stentor 늦추고. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 3입니다. 절단 Stentor. 개별 셀 수동으로 스테레오 현미경 셀 통해 유리 바늘을 눌러 해 부 아래 여러 조각으로 잘릴 수 있다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
| 문화에 대 한 문제 | 가능한 치료 | 가능한 예방 |
| 문화는 rotifers 또는 다른 큰 유기 체에 의해 압도 됩니다. | 새로운 문화 접시에 가능한 많은 Stentor 를 제거 합니다. 다음 셀 세 번 세척. | 상용 공급 업체에서 구입 하는 경우에, 그들을 받을 때 Stentor 를 철저히 씻으십시오. |
| 문화는 곰 팡이 또는 다른 작은 유기 체에 의해 압도 됩니다. | 식별 코너는 최소한 Stentor. 그 지역에서 많은 Stentor 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW에 추가 합니다. 섞어 부드럽게 하지만 완전히 distrubute에 침입 유기 체. 다음 먹이 생략 하 고 Stentor 그들을 먹을 것 이다. | 문화를 정기적으로 관찰 하 고 신선한 PSW에 대 한 미디어를 교환 하 여 작은 오염 물질을 제거. |
| Stentor 서로 위에 누워 있다. | 농도 20 셀/mL 문화를 분할. | 더 자주 문화를 분할. |
| Stentor 셀 결합 됩니다. | 5 일 마다 대신 4 일 마다 피드. | |
| 문화는 어두운 폐기물의 많은 있다. | 어두운 소재, 셀을 제거 하지 않고 가능한 Stentor 폐기물의 제거. Stentor 어두운 소재에 장착 하는 경우 위쪽 및 아래쪽으로 그들의 낭비에서 Stentor 세포를 다음 셀을 제거 하지 않고는 쓰레기와 함께 미디어를 제거 플라스틱. 또는, 그 Stentor 제거 하 고 그에 따라 피드 덜. | 피드 Stentor 음식 문화의 100 mL 당 적은 1 mL. |
| 유해한 수준의 vacuolated/비 대 한 (둥근) Stentor. | 많은 Stentor 세포를 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW를 추가 합니다. | 미디어를 정기적으로 교환 합니다. |
표 1입니다. Stentor경작에 대 한 문제 해결 가이드입니다.
Discussion
경작 Stentor 다양을 한 도전 선물 한다. 첫째, 세포의 많은 수를 필요로 하는 실험을 수행 하기 위해 하나 Stentor 농도 20 셀/mL을 초과 하면 건강에 해로운 될 문화로 Stentor 문화의 많은 수를 유지 해야 합니다. 둘째, 자주 Stentor 문화를 오염 수 생물 Stentor 보다 빠르게 분할 하 고 (일반적인 오염 물질은 rotifers) 문화를 압도. 따라서, 그것은 현미경으로 문화를 주기적으로 검사 하 고 오염 물질을 제거 하는 데 필요한입니다. 때때로, 새로운 문화는 오염 된 문화에서 수동으로 구출 하는 세포의 작은 숫자에서 시작 될 필요가 있다. 이 건강 한 Stentor 문화를 유지 하는 데 필요한 시간이 증가 합니다. 셋째, 단일 셀 400 mL 문화 확대 필요 합니다 적어도 한 달 Stentor 세포 주기는 3-5 일 때문에. 넷째, 다른 모델과 달리 ciliates Stentor 드물게 낭종에가 하 고 그들은 동결 수 없습니다 키를 누릅니다.
Stentor 경작의 중요 한 측면의 적절 한 음식 유 기체의 선택 이다. Stentor 경작을 위한 다양 한 방법은 설명 이전 했다. 그들 중 하나를 사용 하 여 탈지 우유 Stentor피드 박테리아 문화 제안 합니다. 이러한 기술은 Stentor; 경작에 효과적입니다. 그러나, 게놈 기술 응용 프로그램에서 정의 되지 않은 식품 생물 게놈 읽기에서 발생 하는 혼동을 피하기 위해 순수 샘플을 요구 한다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, Stentor 질량에서 성장 될 수 있다 고, 그들의 음식, Chlamydomonas, 시퀀싱 되었습니다 때문에 genomic 오염 식품 유기 체에서 존재 수 수 감지 제어. 알 수 없는 이유로 타르 타르 어디 그가 발견 하기 전에 Stentor 반환 하 여 그의 주식을 보충 했다. 현재 프로토콜 우리 Stentor 수년간 계속 할 수 있게 되었습니다.
Stentor 재생 실험은 일반적으로 간단 하지만 마음에 계속 몇 가지 중요 한 세부 사항. 섹션 2에 관한 Stentor 절단 절반 세포 분에 마스터 수 있습니다. 마스터링 Stentor 의 고급 미세 절차 연습 주가 필요할 수 있습니다. 동안 때 자당 치료 다음 수행 됩니다에 대 한 10-30에 의해 부 화 시간을 증가 (제 3), 영상 시작 되는 시점에 대부분 셀 아직도 있다면 그들의 membranellar 밴드 자당 또는 요소 처리를 수행. 3 분 보육 넘어 자당 치료의 시간 그것은 세포 죽음 귀 착될 것 이다 때문에 늘리지 마십시오.
Stentor 의 영상 재생 시간의 오랜 기간 동안 이미지 큰 셀에 방법을 필요 합니다. 섹션 4에 이미징 방법만 똑바로 현미경으로 사용할 수 있습니다. 거꾸로 현미경 대신 사용할 수 있는 경우, 셀 슬라이드 또는 작은 챔버에 coverslip에 배치할 수 있습니다. 한 가지 방법은 증발을 방지 하기 위해 다른 coverslip와 석유 젤리와 커버 챔버를 만드는 것입니다. 또는 개별 셀에 대 한 챔버 1 x 1 cm2 실리콘 스페이서의 평방에 원하는 크기의 구멍 펀치 구멍을 만들어 할 수 있다 (테이블의 재료)는 coverslip에는 스페이서를 배치, 셀 챔버 그리고 다른 coverslip와 챔버. 이미징, Stentor 중생의 각 단계의 특성을 관찰 하는 올바른 방향에 있지 않은 경우 때 셀 계약을 확고 하 게 접시를 누릅니다. 중생의 단계를 식별 하는 확장 셀 보고 (전체 확장 소요 약 45 s). 셀이 잘못 된 방향에 있는 아직도, 두드리는 반복 합니다. 그림 1 과 그림 6 에 표시 된 이미지는 스테레오 줌 현미경;로 찍은 그러나, 모든 실험 상세한 해 부 실체 현미경 X 5를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
경작 및 이미징 Stentor 외 또 다른 도전을 재생, 특히 단계를 식별 하는 데 필요한 시간의 양의 추적 이다. 완벽 하 게 명확 하 게 보이는 구두 primordium의 지역 중심 재생 셀 이면 무대의 몇 초 걸립니다. 그러나 가끔은,, Stentor 셀 재생 단계, 따라서 식별 하기 위해 더 많은 시간을 복용의 명확한 임무를 방지 하는 방향에서입니다. 상당한 양의 무대 개별 재생 셀 모든 재생 세포, 따라서 감소 하는 준비 하 고 기다려야 관찰자 요구의 시간 정밀도의 정량화를 지연 시킬 수 및 다시 후 셀 이동 이미지 하는 데 필요한 시간 새로운 방향입니다. 따라서,이 실험은 모두 시간과 노동 집약. 이러한 이유로, 그것은 매우 바람직한 Stentor 세포를 감지 하 고 비디오 현미경 데이터에는 중생의 단계 할당에 대 한 자동화 된 방법을 개발 하는 것입니다. 이들은 또한 더 재현 실험에 대 한 허용 샘플 크기와 인간의 편견의 제거에서 증가 한다.
매우 민감한 genomic와 proteomic 방법의 출현은 단일 세포의 연구 범위에 넣어 하기 시작 했다. 이러한 단일 세포 분석 Stentor 셀의 거 대 한 크기 네요 개념 증명 실험에 대 한 바람직한 테스트 주제. 가능, 같은 실험에 대 한 기본적, 이다 Stentor 경작 하 고 그래서 여기에 설명 된 방법을 더 고급 단일 셀 기술의 추가 개발 역할을 담당할 해야.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 GM113602 (WFM) 보조금과 NSF 1144247 (알)에 의해 지원 되었다. 우리 인정 마크 Slabodnick 나탈리 커 클 랜드 이러한 프로토콜 중 일부의 초기 버전을 개발 하 고 유익한 토론 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 카 리 나 Perlaza 및 Greyson 루이스 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
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