Summary
פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.
Abstract
השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. המחקר שלנו מתמקדת להערכת הפונקציה glomerular סוכרת כלייתית ועכברים podocyte ספציפיים של VEGF הנוק-אאוט; לכן, פרוטוקול זה מתאר כליות מלא העבודה לשימוש במעבדה שלנו לצורך הערכת מודלים אלה העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארים במאמר זה מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר יכול לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. השיטות לאפשר להערכה תפקודית מפורט של המכשול glomerular סינון באמצעות מדידה של השתן אלבומין קריאטינין יחס חדירות מים glomerular בודדים, וכן בדיקה מבנית והן אולטרה מבנית באמצעות חומצה המחזורית שיף הכתם מיקרוסקופ אלקטרונים. יתר על כן, ניתוח של dysregulated גנים ברמת mRNA, חלבון מאפשר ניתוח מכניסטית של הפונקציה glomerular. פרוטוקול זה מתאר את השיטות כלליים אבל יכולת הסתגלות ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.
Introduction
השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. הדגמים מאתר כזה כוללים מודלים ספונטנית כגון באופן ספונטני עם יתר לחץ דם עכברושים (שומר)1, streptozotocin (STZ)-induced סוכרתית חולדות, עכברים2והקלד db/db בעכברים סוכרתיים II3, מודלים מהונדס גנטית כגון ראשי ספציפי podocyte מוקד סגמנטלי glomerular טרשת נפוצה (FSGS) מודלים4, podocyte ספציפיים כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF-A) הנוק-אאוט (קו VEGF-A) דגם5, תסמונת אלפורט מודלים6והיא רכשה מודלים כגון כריתת כליה 5/67 ו- ureteral חד צדדית את החסימה (UUO) מודל8. על מנת להעריך את ההיבטים השונים של הפונקציה glomerular במודלים אלה, מספר טכניקות זמינים. מטרת הנייר בשיטה זו היא להדגים מקיף העבודה מעלה כי יש לבצעו במודלים של העכבר של מחלת כליות כדי להעריך באופן מלא פונקציה glomerular.
הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא שהם מאפשרים את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. זה כולל הערכת את החדירות glomerular, חלבון וגם כדי מים, מומים מבניים glomerular ו שינויים הביטוי/שחבור של mRNAs, חלבונים חיוניים לתפקוד נורמלי glomerular. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון המחלה, אשר נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה.
בספרות, זה תופעה שכיחה יוצגו עם דגם העכבר של מחלת glomerular איפה פנוטיפ נקבעת על-ידי רמה מוגברת של אלבומין בשתן. עם זאת, אין עדות לכך כי שיטה אחת לקביעת glomerular פונקציה אינה תמיד יעילה; מדידת קצב הפרשת אלבומין בדרכי השתן או על יחס השתן אלבומין קריאטינין (uACR) רק מספק מידע על תפקוד הכליות הכולל, ולא מתוך glomeruli בודדים. מחקרים קודמים הראו כי החדירות יכול להשתנות glomeruli שונה מן באותה כליה5,9,10. בנוסף, הערכה של החדירות של הפרט glomeruli היא דרך רגישה יותר להעריך פונקציית glomerular; הטכניקה של מדידה של חדירות מים glomerular בודדים (LpA / Vאני) הראתה להיות רגיש יותר לשינויים בתפקוד glomerular מאשר מדידה uACR9. Assay הזה הוא מועיל במודלים עכבר, כי הם עמידים בפני פרוטאינוריה, כגון אלה על רקע c57BL/611. היתרון של המאמר הנוכחי של השיטה היא כי זה בוחן הן את החדירות כליות מוחלטת כדי אלבומין, כמו גם את החדירות glomerular בודדים למים.
בחינה של מומים מבניים glomerular מוערך לעתים קרובות על ידי סוללה של כתמים כגון חומצה המחזורית שיף (PAS), trichrome, ואת כתמי כסף. אלה מאפשרים כליות פתולוג מיומן להעריך את הרמה של מחלת כליות באמצעות שיטת הניקוד. למרות כל שיטות טובות, שינויים במבנה-המאקרו glomerular הם לא תמיד נצפו אי-ספיקת כליות חריפה מודלים12. שיטה זו מציעה כי בנוסף בביצוע טכניקות היסטולוגיה כליות שתוארו לעיל, האולטרה-המבנה glomerular גם וצריך להעריך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). פקעית מוכתם יכול להיראות נורמלי יחסית במיקרוסקופ אור רגיל; עם זאת, בעת הערכת עם EM, שינויים קטנים רוחב גלומרולרי במרתף (GBM), podocyte הרגל תהליך הצטנעות, fenestrations אנדותל וכיסוי של sub-podocyte שטח ניתוח. לכן חיוני כי glomerular אולטרה-מבנה והן -מבנה שקובעת כדי לקבוע המנגנון של תפקוד glomerular.
בנוסף להערכת מומים מבניים glomerular, שינויים ב- mRNA, ביטוי חלבונים שחבור, וכן הפעלת חלבון (למשל, זרחון), צריך להיבדק להבהיר עוד יותר על מנגנוני המחלה glomerular. כאשר מסתכלים על מחלת glomerular, או, לדוגמה, כאשר קו/over-expressing גן בפרט glomerular תאים, כגון ספציפי podocyte VEGF-A KO העכבר5, זה חשוב כי השינויים חלבון ה-mRNA נבדקים רק בהישג תאים glomerular, לא כל הכליה. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבה glomeruli מבודדים מן קליפת הכלייה העכבר, ולאחר מכן החלבון/רנ א הם מבודדים. זה מאפשר ניתוח ספציפי של dysregulation חלבון/mRNA glomeruli של מודל המחלה.
פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.
Protocol
כל הניסויים נערכו על פי חקיקה בבריטניה ואישור הוועדה האתית מקומיים. מחקרים שנעשו בבעלי חיים אושרו על-ידי אוניברסיטת בריסטול מחקר בוועדת האתיקה.
1. השתן אלבומין קריאטינין יחס (uACR)
הערה: uACR משמש כדי להעריך את החדירות של GFB כדי אלבומין. הנוכחות של אלבומין בשתן מצביעה על חדירות מוגברת מעבר GFB, אשר הוא מנורמל ל קריאטינין לפקד עבור וריאציות של קצב זרימת השתן. Albuminuria הוא סמן נפוצה מחלת כליות כרונית.
- איסוף שתן על בסיס ניסיוני, במרווחי זמן קבועים (פעם בשבוע עד פעם חודשי) עד הקצה ניסיוני.
- להגדיר את העכבר כלובים מטבוליים עם דיאטה מים והעשרה. הצב עכברים (זכר, בגילאי 6-8 שבועות) בכלובים בודדים עבור 6-אייץ ' בחדר שקט.
- עכברים החזרה רגיל הדיור, לאסוף שתן מהכלובים ריק. נדרש מינימום של 50 µL.
הערה: אם העכבר אינו מייצר שתן בזמן נתון, חזור ביום אחר בחדר חם. - Centrifuge בשתן ב 500 x g עבור 10 דקות לאסוף את השתן ולשמר משקעים כדי להעריך את אובדן podocyte. אחסן את השתן ב-20 ° C לטווח קצר בנקודה זו.
- לדלל את השתן לתוך 1% אלבומין שור (BSA) ב 1 x Tris buffered תמיסת מלח (TBS pH 7.5) ב שבערך על דילול 1:10000, בהתאם לחומרת albuminuria.
הערה: עוצמת הקול בסוף אמור להיות > µL 400. מיטוב כדי לקבוע דילול נכון כל זמן הצבע. - לכמת את ריכוז אלבומין השתן באמצעות של העכבר אלבומין אנזים immunosorbent מקושר assay (אליסה) לפי הוראות היצרן.
- בקצרה, מעיל לצלחת אליסה, אשר ממוטבת עבור איגוד חלבון, עם 100 µL של נוגדן ראשוני אנטי-העכבר אלבומין (10 µg/mL ב 0.5 M ביקרבונט-קרבונט pH 9.6) לשעה בטמפרטורת החדר.
- שטיפת עודפי נוגדנים מן הבארות חמש פעמים עם 1 x TBS פלוס 0.05% Tween (pH 8.0), ולהוסיף 200 µL של חסימת פתרון (1 x TBS עם 1% BSA pH 8.0) ללילה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הצלחת חמש פעמים ולהוסיף µL 100 תקנים (דילול טורי: 2000 µg/mL כדי µg/mL 15.63 ב 1 x TBS עם 1% BSA, pH 8.0), הריק, והדוגמאות מדולל דולר. להשאיר לשעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף צלחת חמש פעמים.
- להוסיף 100 µL של נוגדן זיהוי HRP לכל טוב (10 ng/mL ב 1xTBS עם 1% BSA, pH 8.0), דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
- לשטוף את הצלחת חמש פעמים ולהוסיף 100 µL של אנזים מצע פתרון טוב לכל. להשאיר את הצלחת בחשיכה לפתח למשך 15 דקות, לעצור את התגובה על-ידי הוספת 100 µL של חומצה גופרתית מ' 0.18 (H2אז4).
התראה: H2כדי4 הוא מאכל.
- לקבוע את ריכוז אלבומין כל מדגם על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 450 ננומטר. השתמש העקומה סטנדרטי כדי לכמת את אלבומין נוכח כל דגימה. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות.
- לחלופין, להעריך את ריכוז אלבומין השתן באמצעות אלקטרופורזה. להוסיף 5 µL של 4 x חלבון לדוגמה טעינת מאגר µL 15 של שתן. מחממים דגימות עד 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן טעינה לתוך ג'ל טריס precast 4-12%.
- הפעל את הג'ל 100 וולט, הכתם למשך הלילה בכחול Coomassie לכל הפרוטוקול של היצרן.
- לאחר הדמיה הג'ל, השתמש densitometry כדי להעריך את הקיפול שינוי ריכוז אלבומין יחסי שליטה.
הערה: אם אין להקות שנצפו אלבומין כאשר צפוי, להעריך את ריכוז חלבון בשתן, לכוונן את עוצמת הקול של שתן לג'ל ההתפחה הוספנו.
- לדלל את דגימת שתן raw ב- dH2O-1:1, 1:5 ו- 1:10.
הערה: עוצמת הקול בסוף אמור להיות > 70 µL. מיטוב כדי לקבוע את הדילול נכון של כל דגימה. - לכמת את ריכוז קריאטינין השתן שימוש assay כימי לפי ההוראות קיט. בקצרה, טען µL 20 של קריאטינין סטנדרטים, שתן ריק, או מדולל על צלחת טוב 96 דולר.
- לקבוע את ריכוז קריאטינין כל דגימה על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 490 nm לפני ואחרי התוספת של הפתרון חומצה (זהירות, שורף; למנוע מגע עם העור).
הערה: ההבדל בין הערכים ספיגת הוא ביחס ישר לריכוז קריאטינין בכל מדגם. עיקול רגיל הוא דור של הסטנדרטים. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות. - ליצור את uACR (µg/מ ג). לנרמל את הנתונים לערך הבסיסית של כל בעכבר על ייצוג גרפי.
2. רקמת ואוסף דם
הערה: בכליות ורקמות glomerular יכול לשמש כדי להעריך סמנים ביטוי מבנית, חלבון ו- mRNA של מחלת כליות. הדם יכול לשמש כדי להעריך סמנים של תפקוד הכליות, כגון קריאטינין, אשר יכול להיות מוסדר למעלה, מחלת כליות, המעידה על הפחתת הקיבולת סינון של glomeruli.
- להכין את הפתרונות הבאים: גלוטראלדהיד 2.5% טרי ב- 0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.3), 4% paraformaldehyde 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), תמיסת רינגר יונקים (115 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 10 מ מ סודיום אצטט (CH3COONa), 1.2 מ מ סודיום פוספט (נה2HPO4), 25 מ מ סודיום ביקרבונט (NaHCO3), 1.2 מ מ מגנזיום גופרתי (MgSO4), 1 מ מ סידן כלורי (2CaCl), גלוקוז D (+) בעובי 5.5 מ מ, pH 7.4) עם 1% BSA, 1 x PBS.
התראה: 2.5% גלוטראלדהיד: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet. 0.1 cacodylate נתרן M: רעיל, שימוש בארון fume. 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume - להכין את החומרים הבאים: איזופלוריין, חומצה ethylenediaminetetraacetic קטן (EDTA)-מצופה צינורות דם, מחטים 23-25 גרם, 5 מ"ל EDTA מצופה מזרקים, צלוחיות זכוכית 10 מ ל, צלוחיות פלסטיק 10 מ"ל, צינורות פלסטיק 0.5 mL, בתבניות חד פעמיות רקמות, קרח יבש, נוזל N 2, כלי ניתוח העכבר, חיתוך אופטימאליים בינוני (אוקטובר).
- הנח את העכבר תחת הרדמה עמוקה, אשר מאומתת על ידי העכבר להיות שאינם מגיבים שמוק מחט כדי לרפד את הרגל, באמצעות תא איזופלוריין, או נתיבי המקבילה של הרדמה מסוף כגון בזריקות הרדמה סוכנים (פנטוברביטל, 50 מ"ג/ק"ג בקרום הבטן [IP]; avertin, ה-IP 240 מ"ג/ק"ג), או חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) (75% CO2/25% O2).
- ללקט העכבר באמצעות ניקוב הלב לתוך החדר השמאלי ולאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר. העברת הצינור דם EDTA מצופים עבור עד 4 שעות. אם מועדף, יכול ליקטו עכברים דרך צוואר הרחם פריקה עם מטופל לא להיקרע ומוחלף.
- שווייץ הכליות דרך הבטן לרחוץ קרח קר 1 x PBS.
- לבחון glomeruli קורטיקלית, להסיר את מוט אחד של קליפת הכלייה וחותכים לחתיכות3 1 מ מ. כדי לבחון glomeruli עמוק ארתרוזיס-מדולרי, חזור על אותה שיטה עם רקמת לשד. מקום 5 מ של 2.5% פתרון גלוטראלדהיד בקבוקון זכוכית EM. חנות ב 4 º C.
התראה: 2.5% גלוטראלדהיד פתרון: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet
הערה: תהליך בתוך חודש לקבלת התוצאות הטובות ביותר. - כלים, להסיר בשליש העליון של הכליה, כדי להבטיח glomeruli בקליפת המוח והן ארתרוזיס-מדולרי יהיה נוכח, וכן תיקון ב- 5 מ של 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור ה 24 העברה עד 5 מ"ל של 70% EtOH למשך 24 שעות לפני הטבעה של פרפין.
התראה: 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume - עבור immunofluorescence, מקום שלישי הכליה, כדי להבטיח glomeruli בקליפת המוח והן מדולרי יהיה נוכח, לתוך רקמות עובש ואת המעיל ב אוקטובר במקום על קרח יבש להקפיא ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- עבור חלבון ו- RNA, מקום 3 x 2 מ מ3 חתיכות של קליפת הכלייה לתוך צינורות פלסטיק 0.5 mL, הצמד להקפיא נוזלי N2. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך רקמות עבור ה-RNA, מקום רקמות 5 כרכים של RNA מייצב פתרון ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- עבור בידוד של glomeruli, לחתוך את רקמת הכליה הנותרת והציבו ב 5 מ של תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA על קרח. היכונו ניפוי glomeruli מיד.
3. קריאטינין פלזמה
הערה: קריאטינין פלזמה ניתן להמציא מוסדר מחלת כליות, המעידה על הפחתת הקיבולת סינון של glomeruli. רמות חנקן (BUN) של שתנן בדם יכול גם להיות מוערך, אף הפרוטוקול לא מתואר כאן.
- Centrifuge את דגימת הדם ב 500 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
- לאסוף את הפלזמה, אשר יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C לטווח קצר בנקודה זו.
- לכמת את ריכוז קריאטינין פלזמה שימוש assay קריאטינין כימי לפי ההוראות למעלה עבור קריאטינין השתן בפרוטוקול 1.11.
- לקבוע את ריכוז קריאטינין כל דגימה על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 490 nm לפני ואחרי התוספת של הפתרון חומצה.
הערה: ההבדל בין ערכים אלה ספיגת הוא ביחס ישר לריכוז קריאטינין בכל מדגם. עיקול רגיל הוא דור של הסטנדרטים. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות.
4. בידוד של Glomeruli
הערה: יכול להיות מבודדים Glomeruli כדי להעריך את החדירות של הפרט glomeruli ex-vivo, וכן את הביטוי של חלבון ספציפי וסמנים mRNA של מחלת glomerular.
- . קח את רקמת הכליה יכניסו תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA ומנתחים glomeruli באמצעות תקן ניפוי טכניקה13. בקצרה, מחסנית של 70 מיקרומטר (למטה), 100 מיקרומטר, 125 µm, 175 מיקרומטר, מיקרומטר 250 ו מיקרומטר 425 הנפות (העליון) על גביע זכוכית.
- מועכים את הכליה, באמצעות מזרק בוכנה, לתוך מיקרומטר 425 ניפוי, יקדם באמצעות קרח קר בתרבית של תמיסת רינגר BSA 1%. הסיביות של הכליה יידחפו, להסיר את המסננת העליון, להמשיך לעשות את אותו הדבר הבא. . אני חוזר עד רק ה-100 מיקרומטר הנפות מיקרומטר 70 נותרו.
- העברת הקציר glomerular נשמר על ידי מיקרומטר 100 על 70 מיקרומטר הנפות עד 10 מ"ל של תמיסת רינגר טריים יונקים עם BSA 1%, על קרח.
הערה: אם מספר glomeruli לכל תמיסת רינגר mL כמה, להפחית את עוצמת הקול של תמיסת רינגר נהגו לאסוף glomeruli שתי הנפות. - הסר מ של התמיסה המכילה glomeruli לתוך שני צינורות נפרדת (2.5 מ ל כל אחד), צנטריפוגה-1000 g x 10 דקות ב 4 º C. להסיר את תגובת שיקוע, הצמד להקפיא glomeruli נוזלי N2 לפני אחסון ב- 80 ° C עבור חלבון והפקת RNA במועד מאוחר יותר.
- מקם את הפתרון הנותרים המכילים glomeruli באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C למדידת glomerular LpA / Vאניex-vivo. להשלים בתוך 3 שעות של הסרת הכליה.
5. חדירות מים glomerular (LpA / Vאני)
הערה: glomerular LpA / Vאני assay מאפשר שמחוץ במדידת החדירות של הפרט glomeruli ב לשחזור באופן מהיר. עלייה glomerular LpA / Vאני מציין שיבוש GFB, אשר הוא סוגסטיבי של מחלת כליות.
- להגדיר את glomerular LpA / Vאני לבוש כפי שמתואר סלמון ואח'10. נא עיין באיור 1 עבור תרשים מפורט הגדרת.
- להכין את הפתרונות הבאים: תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA (pH 7.4), תמיסת רינגר יונקים עם 8% BSA (pH 7.4). לחמם את שניהם ל- 37 מעלות צלזיוס.
- משוך micropipettes מ זכוכית צינורות קפילר (צפיפות אופטית: 1.2 מ מ). ליצור 5-8 מיקרומטר צמצם עצה על ידי גזירה את micropipette תחת מיקרוסקופ.
- להשתמש את glomerular LpA / Vאני לבוש לתפוס glomeruli בודדים ללא פגע חופשיים של קפסולה של באומן ושברי הכרישים על גבי micropipette באמצעות שאיבה. סיכום מפורט של וזמינותו oncometric מצוי סלמון ואח'10. בקצרה, ברגע פקעית הוא נתפס ומאובטחים על micropipette היניקה, להתחיל בהקלטת וידאו פקעית מתחת למיקרוסקופ.
- ראשית, equilibrate של פקעית בפתרון 1% BSA רינגר ב-30 s לפני המעבר של perifusate מרוכזת 8% BSA תמיסת רינגר 10 s. לאחר מכן לעבור את perifusate חזרה אל תמיסת רינגר BSA 1%, לעצור את ההקלטה.
- לשטוף את פקעית, חזור על התהליך עבור 10-15 glomeruli לכל העכבר. להבטיח תעריפי זרימת perifusate הם זהים ולא על מהירות (10 מ ל/דקה) כדי לא לעוות את מבנה glomerular.
- למדוד את קצב הראשונית של הצטמקות glomerular כדי לחשב את החדירות glomerular מים (L.p. A) מנורמל לאמצעי האחסון glomerular (Vאני). ניתן למצוא מידע מפורט לגבי הניתוח סלמון ואח'10.
6. המחזורית חומצה שיף (PAS) כתם
הערה: הכתם PAS ידגיש הממברנות במרתף של לולאות נימי glomerular, האפיתל צינורי. הוא מאפשר ויזואליזציה מפורטת של תאים glomerular, mesangial מטריקס ופוטנציאל הרחבה, שינויי פוטנציאל GBM (קרי, עיבוי ואי סדרים).
- בסעיף קליפת הכליה פרפין-מוטבע, כדורגלן-קבוע באמצעות מיקרוטום עובי 5 מיקרומטר על גבי שקופיות מצופה פולי-L-ליזין. יבש ב 37 ° C עבור ה 1 ודא המקטע אינו מכיל כל הקפלים או חורים, אשר יכולה לעוות המורפולוגיה מתחת למיקרוסקופ.
- Deparaffinize השקופיות על-ידי המקננת פעמיים ב קסילן (זהירות, מגרה; שימוש בארון fume) למשך 3 דקות, פעמיים ב 100% EtOH למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב 95%, 70% ו- 50% EtOH למשך 3 דקות כל אחד, כל בטמפרטורת החדר. מימה מחדש את השקופיות dH2O.
- דגירה השקופיות בפתרון המחזורית חומצה (זהירות, מגרה; שימוש בארון fume) (1 g/dL) עבור 5 דקות ולאחר מכן לשטוף השקופיות מספר שינויים של dH2O. להשתמש מיכל עם 100 מ ל dH2O בטמפרטורת החדר.
התראה: חומצה המחזורית פתרון: מגרה; להשתמש בארון fume - דגירה בשקופיות ריאגנט של שיף (Parasoaniline HCl 6 g/L ו נתרן metabisulfite 4% HCl 0.25 מול/ליטר) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז מים במשך 5 דקות.
- Counterstain עם Hematoxylin 3 s לפני השטיפה ביסודיות שקופיות פועל מי ברז למשך 15 דקות.
הערה: אופטימיזציה מסוימים עשויים להידרש כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור Hematoxylin מכתים. - מייבשים השקופיות באמצעות ההפך של פרוטוקול deparaffinization בשלב 6.2. לסיים עם קסילן.
- אוויר יבש שקופיות והר עם מדיה מבוססי קסילן הרכבה.
- תמונה על מיקרוסקופ אור בהגדלה X 400 להעריך glomerular מבנים. להעריך את הדברים הבאים: עיבוי ואי סדרים של GBM, כיווץ של לולאות נימי, שהותירה רקמות, טרשת נפוצה, התפשטות הסלולר (אנדותל, podocyte, mesangial, או תאים דלקתיות שחדר את אניץ).
הערה: עבור הערכה מקיפה של פתופסיולוגיה glomerular, נגעים בחלקים אחרים של הכליה צריך להיות הערכה, כגון בקוריאנית.
7. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)
הערה: TEM מאפשר הבחינה של מומים מבניים אולטרה בכליה, כגון GBM, תהליכים רגל podocyte, ו fenestrations אנדותל, אשר אינם גלויים עם מיקרוסקופ אור. זה חשוב דגמים היכן כליות נזק לא כל-כך מבטאים את זה (כלומר, לא albuminuria, מומים מבניים עיקריים).
- לקחת gluteraldehdye 2.5% - קבוע קוביות הכליה ותקן פוסט ב 1% אוסמיום ארבע-חמצני עבור 1 ח' שטיפת ב 50 מ ל 0.1 M cacodylate מאגר (pH 7.3) ולאחר מכן 50 מ של dH2O (3 x 15 דקות משתנה).
התראה: 2.5% גלוטראלדהיד: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet. 0.1 cacodylate נתרן M: רעיל, שימוש בארון fume - מייבשים עם EtOH, להטביע שרף Araldite.
- לחתוך קטעים ב- 50-100 ננומטר עובי ו כתם עם 3% uranyl (מימית) אצטט והפתרון ציטראט של ריינולדס עופרת.
- קח את micrographs דיגיטלי על מספר אזורים פקעית-940 X, 1250 X, ו- 6200 X כדי לוודא podocytes, GEnCs, GBM ו מזנגיום ניתן לזהות.
- השתמש ImageJ כדי לנתח glomeruli עיוור. הגדר את המידה עבור כל micrograph 6200 X על ידי ציור קו בין שתי נקודות מרחק ידוע, כגון סרגל. ללכת לניתוח, ולאחר מכן הגדר קנה מידה, שבו מוצגות את אורך הקו בפיקסלים. הקלד המרחק ידוע ויחידות מידה. השתמש הפרוטוקולים המפורטים להלן עבור המידה של כל פרמטר.
הערה: ניתוח זה דורש בסביבות 1 יום לפי העכבר. לשימוש הולם עוצמה סטטיסטית, המדידות הממוצע מ glomeruli 3 מ- 3 עכברים.- GBM, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X, למדוד את עובי GBM בנקודה שבה קווי הרשת לחצות GBM. מדוד קרום התא אנדותל הבזליים אל קרום התא תהליך של הרגל podocyte הבזליים בהשקה בניצב על קרום התא אנדותל באמצעות הכלי קו ישר. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות.
- עבור המספר אשנוב אנדותל, למדוד את האורך של GBM נוכח micrograph 6200 X, לספור את מספר fenestrations אנדותל עבור אורך יחידה של GBM. קח ממוצע בין micrographs לפחות 4 לכל פקעית.
- עבור podocyte הרגל תהליך רוחב, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X. למדוד את הרוחב של התהליכים רגל podocyte לחצות את קווי הרשת. למדוד את הרוחב בחלק הרחב ביותר של תהליך רגל בו הוא נפגש עם GBM; ודא הקו בניצב הטנגנס של קרום הבסיס podocyte. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות.
- Podocyte חתך רוחב, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X. למדוד את הרוחב של דיאפרגמות לחתוך podocyte לחצות את קווי הרשת. זוהי נקודת איפה התהליכים רגל הם הקרובים ביותר יחד, בחלק הרחב ביותר של כל תהליך רגל, מן podocyte ממברנה אל הממברנה. ודא המדידה בניצב הטנגנס של קרום הבסיס podocyte. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות.
- עבור המספר של podocyte רגל תהליכים, למדוד את האורך של GBM נוכח micrograph 6200 X, לספור את מספר התהליכים רגל podocyte עבור אורך יחידה של GBM. קח ממוצע בין micrographs לפחות 4 לכל פקעית.
- עבור כיסוי שטח sub-podocyte, ראה שיטה מפורטת של ניל ואח. 14.
- שימוש של micrographs X 940, לבחון glomeruli לנוכחות של מבנה לא תקין, פיקדונות, תסנין לפי העין.
8. immunofluorescence עבור Podocyte וסמנים אנדותל
הערה: Immunostaining מאפשר הדמיה של דפוסי ביטוי של חלבונים, כגון לולאות אנדותל נימי, אשר ניתן לכווץ את מחלת glomerular.
- מקם את OCT-עובש המכיל הכליות קפואים ב-20 ° C כבר שעתיים לפני חלוקתה. ודא שהשטח לחתוך של הכליה ממוקמת בקפידה נגד לתחתית התבנית-OCT כדי לאפשר מקטעי רקמת orientated טוב.
- שימוש של cryostat, ברקמות סעיף 5 מיקרומטר עובי על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות.
הערה: ודא ואין קיפולים או חורים בסעיף רקמות, אשר יכולה לעוות המורפולוגיה. - בעת הסרת מ cryostat, לתקן את שקופיות ב- 4% מחברים עבור 10 דקות לשטוף שקופיות 3 x 5 דקות במיכל עם 100 מ של dH2O.
התראה: 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume - כדי למזער את כמות נוגדנים בשימוש, לצייר מקטעים עם עט הידרופובי. אל תתנו הסעיפים יבש.
- דגירה בחסימה פתרון (BSA 3% ו- 5% סרום רגילה ב- 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר.
- הסר את הפתרון חסימה עם העצמות, דגירה מקטעים עם נוגדן ראשוני (Nephrin, podocin או PECAM-1) מדולל 1:250 (BSA 3% ב- PBS 1 x). המקום שקופיות בתוך תא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם תא לח אינה זמינה, קלות להניח פס קטן של מצלמות-מיקרוסקופים מעל לשקופית מצופים נוגדן. יש להיזהר בעת הסרת למחרת כדי לא לשבש את המקטע.
- רחץ שקופיות 3 x 5 דקות ב- 1 x PBS.
- דגירה עם 1:1000 דילול המתאים נוגדנים משניים פלורסנט (BSA 3% ב- 1 x PBS) עבור 2 h בטמפרטורת החדר בחושך.
- רחץ שקופיות 3 x 5 דקות ב- 1 x PBS. הר עם פלורסנט טעינת המדיה המכילה דאפי.
- תמונות שקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה X 400 כדי להציג glomeruli. ודא שזה היא מתעוורת כדי למנוע הטיה.
- השתמש ImageJ כדי לנתח את העוצמה מכתימים מנורמל לאזור glomerular, ואת התבנית של צביעת, קרי, מספר לולאות נימי מנורמל לאזור glomerular, באופן עיוור.
9. חלבון החילוץ החיוורים ומכתים המערבי
הערה: סופג המערבי מאפשר לנו להעריך את החלבונים ביטוי ידוע dysregulated של מחלת כליות. לדוגמה, ירידה בביטוי podocin ו- nephrin מצביע על אובדן podocyte.
- תמצית חלבון לבין קליפת הכלייה sieved glomeruli; הפרוטוקול זהה עבור כל אחד, הנפח של פירוק מאגר מותאם עבור כמות הרקמה.
- הפשרה כליות/glomeruli על הקרח לפני הוספת NP-40 פירוק מאגר מעכבי פרוטאז, פוספטאז המכיל (150 מ מ NaCl, 1% NP-40, 50 מ מ טריס pH 8). Homogenize לדוגמה עבור 30 s.
- דגירה בדגימות homogenized על קרח למשך 30 דקות, vortexing במרווחי זמן קבועים.
- Centrifuge את הדגימות ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 º C.
- הסר את תגובת שיקוע לרכבת התחתית טריים על קרח.
הערה: מצפה לשחזר כ- 1 מ ג חלבון ליום המדגם. - Denature את החלבונים באמצעות המאגר x Laemmli תקן 4. מרתיחים את התערובת ב 95-100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- להעריך את הביטוי של חלבונים סמן תא glomerular (Nephrin, Podocin, PECAM-1, וכו '.), זרחון וביטוי חלבונים ידוע/המשוערות כדי להשתנות ב glomeruli/הכליה של הדגם המחלה באמצעות ווסטרן סופג ( השיטה הרגילה; ורד פנחסוב ויאנג15).
הערה: הפרוטוקול משתנה בהתאם גודל ואת שפע של החלבון עניין.
10. RNA החילוץ ואת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)
הערה: mRNA ביטוי ניתוח מאפשרת לנו לקבוע איך הגנים מוסדרים, מחלת כליות, כגון שינויים ביטוי גנים שחבור חליפי.
- בעוד קליפת הכלייה עדיין קפוא, ביסודיות לטחון ב- 3 מ"ל של פנול ריאגנט באמצעות שהעקב פצצות מרגמה. אם באמצעות תמציות glomerular, להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט פנול, homogenize לדוגמה עבור 30 s.
התראה: ריאגנט TRIzol: מגרה; להשתמש בארון fume - לבצע משימת חילוץ RNA באמצעות השיטה המתוארת על-ידי Chomczynski ועוד Sacchi16.
הערה: ערכות חילוץ RNA מסחריים זמינים כחלופה לשיטה זו. - להעריך את כמות ואיכות RNA שהושג באמצעות אחת השיטות השונות הזמינות. רנ א היא aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס בנקודה זו. להימנע חוזר להקפיא מפשיר.
הערה: אם חדש לשיטה זו, בדוק את האיכות של RNA לפני שתמשיך לשלב הבא על-ידי הפעלת את הרנ א ב ג'ל agarose כדי להבטיח 28S ברור והלהקה ribosomal 18S. מצפה להתאושש בין 2-5 µg של RNA בשיטה זו. - DNase לטפל µg 1 של RNA (יצירת אמצעי אחסון עד 10 µL במים נטולי RNase בתוספת 1 µL של DNase µL 1 DNase המאגר) עבור 1 h-37 מעלות צלזיוס. לעצור את התגובה עם 1 µL של DNase להפסיק פתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- הוסף µL 0.5 oligo (dT), תחל אקראי. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מיד להרוות בקרח במשך 5 דקות.
- להוסיף את הפעולות הבאות; האנזים רוורס טרנסקריפטאז MMLV (400 U; החלף DEPC H2O RT - שליטה לדוגמה), מאגר MMLV (1 x), מעכב מיקס (0.5 מ מ), ואת ribonuclease dNTP (40 U); להפוך µL עד 50 עם מים DEPC.
- דגירה תערובת התגובה ב 37 ° C עבור h 1 ואחריו 95 ° C עבור 5 דקות כדי לבטל את האנזים.
הערה: כדי להפיק תשואה גבוהה יותר של cDNA, דגירה ב 37 ° C עבור עד 3 שעות. - להעריך את כמות ואיכות cDNA באמצעות השיטות השונות הזמינות.
- שימוש PCR כדי להעריך את דפוסי שחבור וביטוי של mRNA של גנים היא שממוצע dysregulated במודל glomerular המחלה. הפרוטוקול משתנה בהתאם הגן עניין.
Representative Results
שתן נאסף באמצעות כלובים מטבוליים פראי סוג (WT), inducible podocyte ספציפיים של VEGF מדהימה (קו VEGF-A), VEGF-A קו X Neph-VEGF165b עכברים (VEGF-A KO עכברים המבטאים יתר על המידה את isoform b VEGF-A אנושי165ב podocytes ב אופן המכונן). על מדידה של יחס השתן אלבומין קריאטינין שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר דוקסיציקלין אינדוקציה של VEGF-A קו, קו VEGF-A עכברים שפיתח albuminuria מתקדמת 10 שבועות לעומת WT littermate שולט. ניתן לראות את הערכים המוחלטים איור 2A, ו מנורמל לקו הבסיס של כל הערכים העכבר איור 2B. עם זאת, albuminuria, לא נצפו בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (איור 2), המציין את VEGF-A165b הוא מגן הדגם של albuminuria5.
Glomerular LpAVאני נמדד glomeruli בודדים sieved מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A165b הכליות. דוגמה איך נתפסת פקעית הצטמקות נצפתה כאשר perifused עם 8% BSA מוצג איור 3 א. הצטמקות זה משמש לאחר מכן כדי לקבוע את glomerular LpA / Vאני עבור כל פקעית (איור 3B). עכברים KO VEGF-A היה משמעותי מוגברת glomerular LpA / Vאני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה VEGF-קו בהשוואה WT שליטה glomeruli. למרות התחתון בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, מוגברת glomerular LpA / Vאני לא סוכלה ע י ביטוי יתר של VEGF-A165b ב- 14 שבועות5.
צביעת PAS סעיפים קליפת הכלייה 14 שבועות לאחר אינדוקציה של VEGF-A קו שלא גילתה שום מומים מבניים glomerular בעכברים VEGF-A קו או VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (איור 4A). עם זאת, לאחר ניתוח של האולטרה-מבנה glomerular ויה EM, עכברים VEGF-A קו היה שפותחה על רוחב GBM גדל ירד מספר fenestrae אנדותל, ירד SPS כיסוי, עלה הממוצע podocyte חתך רוחב (איור 4C-4F ). כף הרגל podocyte הממוצע לעבד רוחב ומספר חריצים נותר ללא שינוי (איור 3B ו- 3g). ביטוי יתר של VEGF-A165b בעכברים VEGF-A KO מנעה את השינויים כדי GBM ולאחר חתך רוחב (איור 4C ו- 4F). עם זאת, VEGF-A165b לא היתה השפעה על fenestrae שינו את המספר של SPS כיסוי (איור 4D ו- 4E)5.
RT-PCR שבוצעה ב- RNA מופק sieved glomeruli גילה כי האדם VEGF-165לחצ mRNA קיים רק בעכברים VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (איור 5A). בעת חילוץ חלבון sieved glomeruli והערכה רמות חלבונים באמצעות סופג המערבי, ביטוי חלבונים glomerular של VEGFR-2 נמצאה הניתנות להפחתה בעכברים VEGF-A קו, אשר נמנעה על ידי ביטוי יתר של VEGF-A165b ( איור 5B ו- 5 C)5.
איור 1. Diagrammatic הקים של המתקן glomerular חדירות (Lpא). (א) פקעית נתפס (ב') micropipette בתוך מחזיק באמצעות שאיבה, אשר היא להדק על הר ליציבות. (ג) microslide מלבני. (ד) 4 X מטרת מיקרוסקופ עם מצלמת וידאו. (ה) 1% פתרון BSA התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (נ) 8% BSA פתרון התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (G) מרחוק הקש על שורות המכילות perifusate שני לה להתנהגות, מה שמקנה exchange perifusate מהירה. המסלול (H) של perifusate לכיוון microslide, אשר לאחר מכן מתרחץ של פקעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. השתן אלבומין קריאטינין יחס. (א) הערכים uACR שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר אינדוקציה של VEGF-A KO בעכברים b165WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A. (ב') אותם ערכים uACR מנורמל לערך בסיסית (לשבוע 0) של כל עכבר בודדות. UACR גדל באופן משמעותי בעכברים VEGF-A KO שבועות 10 ו- 14 לעומת WT littermate שולט, אשר נמנעה בעכברים b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (* p < 0.05; אנובה דו-כיווני, תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-12 עכברים לכל נקודת זמן; קווי שגיאה: שגיאת התקן של הממוצע [SEM]). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. מידת חדירות מים glomerular. (א) פקעית נתפס. את micropipette באמצעות שאיבה; perifusate הוא החליף מ- 1% BSA (Ai) 8% BSA (כל), התכווצות glomerular נצפית. (B) מדידות נלקח לפני ואחרי הבורר BSA 8% משמשים כדי לקבוע את glomerular LpA / Vאני. (ג) עכברים VEGF-A KO לפתח של מוגברת glomerular LpA / Vאני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה של VEGF-A קו לעומת WT שולט. זה לא היה משמעותי מנעה בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A, b165(* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-9 עכברים, glomeruli 15-30; קווי שגיאה: SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. ניתוח מבנה glomerular. (א) צביעת PAS של קליפת הכלייה לא מצביעים על חריגות מבנית ב glomeruli מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A165b עכברים (Ai - iii). EM גילה מומים מבניים אולטרה ב glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (ב') FPW הממוצע לא השתנו בין קבוצות. (ג) ה GBM גדל glomeruli VEGF-A KO, אשר נמנעה על ידי VEGF-A165ב' (ד) מספר fenestrae ירדו ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נותרה שהודעה על ידי VEGF-A165 (E) נולד ב- SPS הכיסוי היתה ירידה ב VEGF-A KO glomeruli, אשר גם נשאר ללא שינוי על ידי VEGF-A165ב' (נ) הממוצע חתך רוחב הוגדל ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה על ידי VEGF-A165ב' (G) המספר שסע היה ללא שינוי בין שלוש הקבוצות (* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 עכברים, 9 glomeruli; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. ביטוי mRNA וחלבון סמנים. (א) RT-PCR הראה כי הביטוי mRNA b165VEGF-A האנושי היה רק ניכר glomeruli sieved מ- VEGF-A קו X Neph-VEGF-A165b עכברים. (B) סופג המערבי ציין כי ביטוי חלבון VEGFR-2 היה למטה מוסדר ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה ב VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 - 6 עכברים; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השלבים הקריטיים בכל שיטה לאפשר ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, כולל הערכה של החדירות של הכליות בכללותה (uACR ופלסמה קריאטינין מידות), החדירות של glomeruli בודדים (glomerular LpA / Vאני), בדיקה של שינויים מבניים (PAS Trichrome כחול, EM), חלבון לוקליזציה (אם), וכן ביטוי גנים glomerular (RT-PCR ו סופג המערבי). שיטות אלה הם המפתח אישיותי של הפונקציה glomerular במודלים של העכבר של מחלת כליות.
כאשר מעריכים את החדירות של GFB, מחקרים רבים שבחרו להשתמש קונבנציונלית uACR או 24 שעות אלבומין הפרשה קצב אמצעי יעיל17,18. למרות שיטות אלה מאפשרות הערכת החדירות GFB בכללותה, זה אינו מאפשר הערכת הפרט חדירות glomerular והגיוון בין glomeruli. מחקרים קודמים מצאו מדידה של glomerular LpA / Vi להיות מדד רגיש יותר לשינויים GFB חדירות5,9. אכן, בתוצאות נציג הפגינו בעיתון הזה, ב- 14 שבועות לכתוב אינדוקציה של קו VEGF-A, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b עכברים יש של uACR נמוך באופן משמעותי בהשוואה ל- VEGF-A KO עכברים; אולם, תוצאה זו אינה משתקפת במלואה בתביעות glomerular LpA / Vאני מדידות, איפה VEGF-A165b לא משמעותית מנעו מגדילה GFB חדירות (איור 1 ואיור 2)5. זה מראה את החשיבות של שימוש מבחני מרובים כדי להעריך את החדירות הכליות וגם את החדירות של glomeruli בודדים. יתר על כן, glomerular LpA / Vאני oncometric assay מרמז כי החדירות של הפרט glomeruli מן הכליה באותו יכול להשתנות במידה רבה, במיוחד מחלות מודלים5,10, 19. מגבלה אחת כדי למדוד את glomerular LpA / Vאני הוא כי זה ניתן לבצע אך ורק במובילים ניסיוני; לפיכך, מדידות uACR רגילה נדרשים לתת אינדיקציה מובילים ניסיוני.
בנוסף הערכת של פנוטיפ פונקציונלי, השיטה הנוכחי מעודד גם הערכה של פנוטיפ ultrastructural מבניים. ניתן לבצע זאת באמצעות מבחר של כתמים כגון PAS, trichrome, כתמי כסף; כל אחד כדי להעריך היבטים שונים של המורפולוגיה glomerular. במודלים חריפה של מחלת glomerular, שבדרך כלל המקרה במודלים של העכבר, הוא יכול להיות קשה לזהות חריגות מבנית הגדולות באמצעות הכתמים האלה אלא אם כן אתה פתולוג מיומן כליות. לכן, בביצוע EM הוא הציע כדי להעריך את ultrastructure של GFB, אשר מאפשר את המדידה כמותית של פרמטרים כגון GBM, אנדותל fenestrae גודל, מספר וכן המאפיינים podocyte. מדידות כאלה דורשים הכשרה מינימלית כדי לבצע ומאפשר החוקר לקבוע את-הסוגים/מבנה התא מושפע מודל המחלה. כך, בדוגמה המוצגת בתוצאות נציג, העכבר VEGF-A KO נמצאה להיות דוגמנית מתון של מחלת glomerular, אין מומים מבניים עיקריים היו נוכחים בעת צביעת PAS. עם זאת, ספציפית podocyte VEGF-A קו זירוז את שינויים GBM, podocytes, תאי אנדותל כשבוחנים את אולטרה-מבנה glomerular5. למרבה הצער, ההכנה של הכליה EM שמתואר בשיטת ההווה אינו מאפשר זיהוי של glycocalyx אנדותל, אשר ידוע גם להיות השפעות משמעותיות על החדירות של GFB19. כדי למדוד במדויק את העומק glycocalyx, הכליות צריך להיות perfuse-קבועה עם 2.5% גלוטראלדהיד עם 1% Alcian כחול glycocalyx אנדותל labelling, כפי שמתואר ואחOltean19.
פעם היה להעריך את פנוטיפ פונקציונלי ומבניים, וצריך להעריך את דפוסי ביטוי/הפעלה של גנים שונים מסלולים ואז בפרט glomeruli. הערכת אולטרה מבניים מוקדמת יכול לתת מידע על התא מעורב, המציין אם podocyte אנדותל ספציפיים או גנים/מסלולים צריך להיבדק glomerular/סוגי מבנים. לדוגמה, בתוצאות נציג של העכברים VEGF-A KO, ירידה במספר fenestrae אנדותל נצפתה (איור 3D); לכן, הביטוי glomerular חלבון של סמן אנדותל ידוע להיות מעורב מסלול VEGF-A נבחנה; VEGFR-2 (איור 4B)5. בנוסף הביטוי של חלבונים ב glomeruli, לוקליזציה שלהם גם להיות visualized באמצעות אם. במחקר על-ידי ג'אנג ואח20, ביטוי ספציפי podocyte של GLUT1 אושרה podocytes על ידי אם שותף ההתאמה לשפות אחרות של GLUT1 מוגברת עם podocin.
לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארות במאמר זה כדי להעריך את תפקוד הכליות במודלים של העכבר של מחלת glomerular מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה של היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. בשיטה זו ניתן בקלות ליישם בעתיד חקירות פונקציה glomerular הערכה של המחלה פנוטיפים ואת הרפוי פוטנציאליים.
לסיכום, פרוטוקול זה כלליים וישימה מתאר כליות מלא עבודה-up עבור העכבר מודלים של המחלה glomerular, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן לב הבריטי ריצ'רד ברייט VEGF מחקר לבטוח, את MRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
| Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
| TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
| RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
| 4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
| 4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
| Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
| 10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
| Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
| 23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
| Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
| 0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
| Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
| Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
| Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
| Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
| Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
| Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
| Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
| Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
| Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
| Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
| Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
| Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
| Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
| Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
| Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
| Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
| 10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
| PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
| HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
| ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
| Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
| Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
| Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
| Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
| Image J Analysis Software | Image J | ||
| PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
| TEM Microscope | Britannica |
References
- Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
- Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
- Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
- Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
- Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
- Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
- Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
- Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
- Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
- Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
- Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
- Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277 (2011).
- Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
- Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
- Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).
