Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop

Summary

Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.

Abstract

Zachte weefsels in het menselijk lichaam hebben meestal stijfheid in het bereik kilopascal (kPa). Dienovereenkomstig, siliconen en hydrogel flexibele substraten hebben bewezen nuttig substraten voor het kweken van cellen in een fysieke communicatie dat gedeeltelijk in vivo voorwaarden nabootst. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het karakteriseren van de Youngs moduli isotrope lineaire elastische ondergronden meestal gebruikt voor mechanobiology studies. Het protocol bestaat uit voorbereiding van een zacht siliconen substraat in een petrischaal of stijve siliconen coating van de oppervlaktelaag van de siliconen coating met fluorescerende kralen, met behulp van een millimeter-schaal bol laten inspringen van de oppervlaktelaag (door zwaartekracht), de TL imaging kralen op de ingesprongen siliconen oppervlak met behulp van een fluorescentie Microscoop, en het analyseren van de resulterende afbeeldingen als u wilt berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Koppeling van de oppervlaktelaag van het substraat met een moduli extracellulaire matrix eiwitten (naast de fluorescerende kralen) kan het siliconen substraat te gemakkelijk worden gebruikt voor de cel plating en latere studies met behulp van tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve silicone, in plaats van een petrischaaltje, als basis voor de zachte siliconen, maakt het gebruik van mechanobiology studies waarbij externe stretch. Een specifieke voordeel van dit protocol is dat een widefield fluorescentie Microscoop, die gewoonlijk beschikbaar in vele labs is, belangrijke uitrusting die nodig is voor deze procedure. We laten zien van dit protocol door het meten van de Youngs modulus van zachte siliconen substraten voor verschillende elastische moduli.

Introduction

Cellen in zachte weefsels bevinden zich in een micro-omgeving waarvan stijfheid is in kilopascal bereik¹, in tegenstelling tot weefselkweek gerechten waarvan stijfheid verschillende ordes van grootte hoger is. Vroege experimenten met cellen in de extracellulaire matrix eiwitten-bedekt zachte ondergronden toonde aan dat de stijfheid van het substraat beïnvloedt hoe cellen verplaatsen op, alsmede voldoen aan de extracellulaire matrix onder^2,3. In feite, beïnvloedt de stijfheid van het substraat fundamenteel de cel functie⁴ op een wijze vergelijkbaar met doordringen....

Protocol

1. fabricage van zachte siliconen coating

1. Weeg 1.75 g van de een-component en 1,75 g van de B-component (A:B = 1:1) uit de zachte silicone-elastomeer kit met behulp van (polystyreen) met een gewicht van trays.
2. De een-component toevoegen aan de B-component in de wegen lade en meng ze samen voor 5 min met behulp van een passende applicator stick.
3. Het bovenstaande mengsel toevoegen aan een 35 mm petrischaal. Laat het mengsel gelijkmatig verspreid over de petrischaal voor een paar minuten.
   Opmerking: De keuze van de diameter van de petrischaal en de hoeveelheid zachte siliconen bepaalt de dikte van de siliconen. Hier zullen de dikte ongeve....

Results

Met behulp van het protocol die hierboven is uiteengezet, wij bereid siliconen in een 35 mm petrischaal, uitharden kan het oppervlak bij 70 ° C gedurende 30 minuten en combinatie van fluorescent microbeads (en collageen ik) naar de bovenste oppervlakte als schematisch afgebeeld in figuur 1. Diepe UV nog eerder is gebruikt voor de uiteindelijke proteïne koppelen aan substraten¹³. Opmerking (I) de uithardende voorwaarden die hier ge.......

Discussion

Terwijl de bol inspringing methode eenvoudig is te implementeren, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de keuze van de indentor en de dikte van het monster van de siliconen. De vergelijking voor de berekening van de Youngs modulus is geldig onder een aantal voorwaarden¹¹en deze meestal wordt voldaan wanneer de dikte van het monster silicone > 10% van de indentor-straal is en < ~ 13 x de straal van de indentor. We vonden dat een siliconen dikte van 5-10 x de straal van de indentor een goede .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CY 52-276 A/B silicone elastomer kit	Dow Corning	CY 52-276	Store at room temperature
Thermo Scientific Pierce EDC	Fisher Scientific	PI22980	Store at -20°C
Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker	Fisher Scientific	PI-24510	Store at 4°C
Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL	Spherotech, Inc.	CFP-0558-2	Store at 4°C, do not freeze
1.0 mm Acid washed Zirconium beads	OPS Diagnostics LLC	BAWZ 1000-250-33
Deep UV chamber with ozone evacuator	Novascan Technologies, Inc.	PSD-UV4, OES-1000D
Wide field fluorescence microscope	Leica Microsystems	DMi8
Collagen I, from rat tail	Corning	354236	Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C
ImageJ-NIH	N/A	N/A	public-domain software