תוך שאיפה להבין את אופני הפעולה של חיידקי conjugative DNA אלמנטים שונים בתנאים שונים, אנו מתארים את פרוטוקול זיהוי הבדלים תדר ההטיה, עם רזולוציה גבוהה, כדי להעריך באיזו מידת יעילות החיידק התורם יוזם ההטיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
קוניוגציה היא צעד חשוב בהעברת אופקי גנים עמידות לאנטיביוטיקה דרך אלמנט דנ א conjugative. חומר השוואתי של תדר ההטיה בתנאים שונים נדרשים להבין איך הרכיב conjugative מתפשט בטבע. עם זאת, שיטות קונבנציונליות להשוואת ההטיה תדירות אינם מתאימים עבור חומר השוואתי בגלל הרקע גבוה נגרם על-ידי ההתרחשות של אירועים נוספים ההטיה בצלחת סלקטיבי. בהצלחה הורדנו את הרקע על ידי החדרת שיטת (MPN) מספר הסביר ביותר, ריכוז גבוה יותר של אנטיביוטיקה כדי למנוע ההטיה במדיום נוזלי סלקטיבי. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול עבור הערכת ההסתברות של איך לעיתים קרובות ההטיה אתחול של תאי התורם על-ידי מיון תאי התורם יחיד לתוך בריכות הנמען על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS). בעזרת פלסמידים 2, pBP136, pCAR1, ההבדלים ההטיה תדירות בתאים Pseudomonas putida יכול להתגלות במדיום נוזלי בקצב מלהיב שונה. התדרים של חניכה ההטיה היו גבוהים עבור pBP136 מאשר עבור pCAR1. באמצעות תוצאות אלו, שנוכל להבין את תכונות ההטיה באלה פלסמידים 2.
מבוא
קוניוגציה של מרכיבים גנטיים ניידים, פלסמידים conjugative אלמנטים אינטגרטיבית של conjugative (גלידות) חשוב התפשטות אופקית של מידע גנטי. זה יכול לקדם את ההתפתחות המהירה חיידקי והתאמה ושידור של התנגדות multidrug גנים1,2. תדירות ההטיה עשויה להיות מושפעת חלבונים המקודדים על רכיבי conjugative גיוס של DNA (מאפיה), זוג ההזדווגות היווצרות (MPF), כולל סקס pili, הממויינות לפי המאפיה של MPF type3,4, 5. זה יכול להיות מושפעת גם את התורם וחתן זוג6 ו לתנאי גדילה תאים7,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תורם עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)- ואת Kanamycin ההתנגדות מתויג ג'ין פלסמידים
- ההיכרות של סמן גנים pBP136 פלסמיד המטרה
הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר pBP136::gfp. זני חיידקים של פלסמידים השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.- לגדל תרביות של Escherichia coli DH10B מחסה pBP13617 ב 5 מ ל מרק לוריא סטרילי (LB) ו- e. coli S17-1λפיר18 מחסה pJBA2819 [המכיל kanamycin (ק מ)-gfp ג'ין, ההתנגדות mut3 * ג'ין עם יזם, שליחות קטלנית מיני-Tn5] ב- 5 מ ל LB סטרילי המכיל 50 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השוואה של תדירות ההטיה בשיטת MPN
בדוח הקודם שלנו, השווינו את התדרים ההטיה של pBP136::ה-gfp , pCAR1::gfp החולוני מדולל ליברות (1/3 ליברות) נוזלי בינוני עם תעריפים שונים מלהיב לאחר 45 min ההזדווגות באמצעות 125 מ ל טווה מבחנות10. השווינו את התדרים ההטיה של pBP136::ה-gfp , pCAR1::gfp עם 106 CFU/mL של זנים התורם וחתן בתנאים שונים מלהיב (0-600 סל ד). תדירות ההטיה בשני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ברזולוציה גבוהה לגילוי הבדלים ההטיה תדירות בתנאים שונים, באמצעות שיטה MPN כדי להעריך את מספר transconjugants. צעד חשוב בפרוטוקול זה דילול התערובת של התורם ואת המטופל לאחר ההזדווגות עד אין transconjugants לגדול. צעד נוסף הוא הוספת ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה המדיום הנוזלי סלקטיבית כדי למנוע ההטיה. הליכים אלה יכול להפחית את הרקע הנגרמת על ידי ההטיה נוספת במדיום סלקטיבי. בהצלחה לנו היתה לזהות הבדלים, גם לאחר ההזדווגות משך זמן קצר בין התורמים לבין הנמען. תדירות conjugative מחושב על ידי פרוטוקול זה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ד ר ק' Kamachi של לאומי המכון של המחלות הזיהומיות (יפן) על מתן pBP136 פרופ ' ד ר Nojiri ה באוניברסיטת טוקיו (יפן) מתן pCAR1. אנחנו גם מודה ד ר פרופסור Molin Sølen של האוניברסיטה הטכנית של דנמרק על מתן pJBA28. עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (גרנט מספרי 15H 05618, 15KK0278) ל MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | תמיסת נדן |
| פלואורוספירות (10 μ מ) | בקמן-קולטר | 6605359 | חרוזים להקמת |
| חממת | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| ספקטרופוטומטר UV-VIS UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96 בארות | צלחות NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| צלחת פטרי מסוג מיקרופלטה | AXEL | 1-9668-01 | לאימות מיון |
| מסנן ממברנה | ADVANTEC | C045A025A | להזדווגות מסנן |
| פיפטות | Nichiryo Co. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 | 0.5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ L |
| פיפטות רב ערוציות | Nichiryo CO. בע"מ | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP | 0.5-10 μ L, 20-200 μ L |
| טריפטון | BD תמצית | 211705 | |
| דיפקו BD Difco | 212750 | ||
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| אגר | נקראי טסק | 01162-15 | |
| ריפמפיצין | וואקו | 185-01003 | |
| גנטמיצין | וואקו | 077-02974 | |
| קנמיצין | וואקו | 115-00342 | |
| צלחת פטרי | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| מיקרו-צינורות | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 מ"ל בקבוק ספינר חד פעמי | קורנינג | CLS3578 |
מקורות
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what th....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
