Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Immunophenotypic karakterisering en moleculaire analyse hebben lange tijd gebruikt om af te bakenen heterogeniteit en definiëren van afzonderlijke cel populaties. FACS is inherent een eencellige assay, maar voorafgaand aan de moleculaire analyse, de doelcellen zijn vaak prospectief geïsoleerd in bulk vervoeren, eencellige resolutie waarbij u verliest. Eencellige gen expressie analyse biedt een manier om moleculaire verschillen tussen de afzonderlijke cellen in heterogene cel populaties te begrijpen. In bulk cel analyse resulteert een oververtegenwoordiging van een afzonderlijke celtype in vooroordelen en occlusie van de signalen van zeldzame cellen met biologische belang. Door gebruik te maken van FACS index Sorteren gekoppeld aan eencellige gen expressie analyse, populaties kunnen onderzocht worden zonder verlies van eencellige resolutie terwijl cellen met tussenliggende cel oppervlakte marker expressie worden ook vastgelegd, waardoor beoordeling van de relevantie van continu oppervlak marker expressie. Hier beschrijven we een aanpak die eencellige omgekeerde transcriptie combineert kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en FACS index Sorteren gelijktijdig karakteriseren de moleculaire en immunophenotypic heterogeniteit binnen cel populaties.
In tegenstelling tot de eencellige RNA sequencing methoden voorziet het gebruik van qPCR met specifieke doel versterking in robuuste metingen van lage-overvloed afschriften met minder uitvallers, terwijl het niet is verward door de kwesties in verband met cel-naar-cel variaties in lezen diepte. Bovendien, door rechtstreeks index-Sorteren single-cellen lysis buffer deze methode, voorziet cDNA synthese en specifieke doelgroep pre versterking moet worden uitgevoerd in één stap alsook wat betreft de correlatie van vervolgens afgeleide moleculaire signaturen met celoppervlak markering voor de expressie. De beschreven aanpak heeft ontwikkeld om te onderzoeken van hematopoietische single-cellen, maar hebben ook geweest tweedehands met vrucht voort andere celtypes.
Kortom, zorgt de hierin beschreven aanpak voor gevoelige meting van mRNA uitdrukking voor een panel van vooraf geselecteerde genen met de mogelijkheid tot het ontwikkelen van protocollen voor latere potentiële isolatie van moleculair verschillende subpopulaties.
Inleiding
Elke individuele bloedcel wordt verondersteld om te verblijven in een cellulaire hiërarchie, waar stamcellen vormen de apex op de top van een reeks van steeds meer begaan tussenliggende voorlopercellen, die uiteindelijk terminaal onderscheiden in de cellen van de definitieve effector specifieke uitvoering biologische functies1. Veel van de kennis over hoe de systemen van de cel van de stam worden georganiseerd is gegenereerd in het hematopoietische systeem, grotendeels als gevolg van de mogelijkheid om verschillende hematopoietische populaties hoogverrijkt voor stamcellen of verschillende progenitoren2 prospectief te isoleren ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van Lysis platen
- Met behulp van een gratis Bank van RNA/DNA, voorbereiden genoeg lysis-buffermengsel 96 putjes, met 10% extra, door het mengen van 390 µL nuclease gratis water, 17 µL van 10% NP-40, 2.8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT en 5.3 µL RNAse remmer (Zie Tabel van materialen). Vortex en de spin naar beneden.
- Distribueren van 4 µL van lysis buffer aan elk putje van een 96 goed PCR plaat en verzegel de platen met zelfklevende film. Spin down buizen voor het verzamelen van vloeistof op de bodem van de platen. Houden platen op ijs totdat de cel sorteren (maximaal 24 uur).
2. voorbereid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol beschreven is snel, gemakkelijk uitgevoerd en zeer betrouwbaar. Een overzicht van de experimentele opstelling wordt gepresenteerd in Figuur 1. Het volledige protocol, van sorteren van single-cellen, tot versterking van het specifieke doel, gen expressie metingen en voorlopige analyse kan worden uitgevoerd in drie dagen. Een voorbeeld van de geanalyseerde resultaten in de vorm van een warmte-kaart die voorlopige geanalyseerde gegevens vertegenwoor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de afgelopen jaren is de eencellige gen expressie analyse een waardevolle toevoeging aan het definiëren van de heterogeniteit van de verschillende cel populaties23geworden. De komst van RNA sequencing technologieën biedt theoretisch een mogelijkheid voor het meten van de gehele transcriptome van een cel, maar deze methoden worden bemoeilijkt door variaties in de cel-naar-cel sequencing diepten en drop-outs. Eencellige qPCR biedt een gevoelige en robuuste analyse van de expressie van honderden k.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Zweedse Cancer Society, de Zweedse Onderzoeksraad, The Swedish Society voor medisch onderzoek, de Zweedse Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, en The Knut en Alice Wallenberg Foundation
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD1 |
Referenties
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
