نقدم بروتوكول للكفاءة والسائبة والسريع الارتداد الكيميائية الخلايا الجذعية pluripotent البشرية التقليدية أعدادا النسب (هبسك) إلى دولة برييمبلانتيشن مثل epiblast pluripotent السذاجة ابيجينوميكالي مستقرة. نتائج هذا الأسلوب في التعبير الجيني انخفاض النسب أعدادا وتحسن ملحوظ في تمايز مولتيلينيجي الموجهة عبر مرجع واسع النطاق من خطوط هبسك التقليدية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
السذاجة البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (N-هبسك) مع تحسين الأداء الوظيفي قد أثر على نطاق واسع في الطب التجديدي. والهدف من هذا البروتوكول أن تعود كفاءة الخلايا الجذعية pluripotent البشرية أعدادا النسب، التقليدية (هبسك) المحافظة على ظروف خالية من علبة التغذية بالورق أو علبة التغذية بالورق-تعتمد على أن السذاجة مثل بلوريبوتينسي مع تحسين الأداء الوظيفي. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة الكيميائية اللوكيميا الكلاسيكية المثبطة عامل (LIF)، GSK3β، ومنظمة مجاهدي خلق/إيرك تثبيط كوكتيل (ليف-2i)، وتستكمل مع فقط مثبط تانكيراسي XAV939 (ليف-3i). ليف-3i يعود هبسك التقليدية إلى دولة مستقرة pluripotent اعتماد النسخي، والكيمياء الحيوية، وميزات جينية من epiblast غرس ما قبل البشرية. يتطلب الحد الأدنى خلية ثقافة التلاعب هذا الأسلوب ليف-3i وهو الغاية استنساخه في مرجع واسع النطاق من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسك) وخطوط خالية من التحوير البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك). لا يتطلب الأسلوب ليف-3i خطوة إعادة فتيلة قبل التمايز؛ ن-هبسك يمكن أن تكون متباينة مباشرة مع كفاءات عالية للغاية والحفاظ على كاريوتيبيك وزيادة ابيجينوميك (بما في ذلك في مواضع مطبوع). ولزيادة الطابع العالمي للأسلوب، تستزرع هبسك التقليدية أولاً في كوكتيل ليف-3i تكملة مع اثنين من جزيئات صغيرة إضافية أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) وسونيك القنفذ (sHH) (بورمورفاميني) مما يشير إلى (ليف-5i). هذه الخطوة التكيف 5i ليف قصيرة إلى حد كبير يعزز توسيع الاستنساخ الأولية هبسك التقليدية ويسمح لها أن تكون بعد ذلك عادت ساذجة مع ليف-3i وحدها بكميات كبيرة، مما ينفي الحاجة إلى الانتقاء/سوبكلونينغ نادرة N-هبسك المستعمرات في وقت لاحق. يتم الاحتفاظ هبسكس ليف-5i-استقرت فيما بعد في ليف-3i وحدها دون الحاجة للجزيئات المضادة أبوبتوتيك. الأهم من ذلك، العودة ليف-3i يحسن ملحوظا بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسع النطاق هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب ومحو تقلب الناقلات من التمايز الموجهة عادة ولاحظ بين خطوط هبسك المستقلة. هي الأوصاف تمثيلاً لليف-3i-عادت N-هبسك الاستراتيجيات المقدمة، والتجريبية للمقارنات الفنية من هبسك اسوي في النسب معبي مقابل. وترد الدول الشبيهة بالسذاجة.
المقدمة
نظام الثقافة 2 طاء (مثبط لمنظمة مجاهدي خلق/إيرك و GSK3β) وضعت أصلاً صقل الماوس غير متجانسة على أساس المصل الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الثقافات إلى دولة أرض موحدة من بلوريبوتينسي أقرب إلى preimplantation epiblast الماوس1. ومع ذلك، لا يدعم 2 طاء مستقرة صيانة خطوط الخلايا الجذعية (هبسك) pluripotent البشرية2. جزيء صغير معقدة، عامل النمو-تستكمل، ومحوره وراثيا النهج المختلفة ذكرت في الآونة الأخيرة لالتقاط مزعومة مماثلة pluripotent الشبيهة بالسذاجة البشرية الجزيئية الدول2. ومع ذلك، العديد من الدول "ساذجة مثل" التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الأساليب أيضا أظهرت عدم الاستقرا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان والبروتوكولات التي وافقت عليها جون هوبكنز مدرسة للطب معهد رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-التحضير للماوس الجنينية الليفية (MEF) لتعتمد على التغذية التقليدية (هيسك المتوسطة/MEF) أو السذاجة عادت هبسك (ليف-3i المتوسطة/MEF) الثقافة
-
شراء أو إعداد داخلية منخفضة-مرور الإمدادات من مغذيات MEF من CF1 أو CF1 x DR4 الهجين E13.5 الماوس الأجنة بعد البروتوكولات المنشورة4.
- كريوبريسيرفي مرور منخفضة (p1-p2) MEF ثقافات ما قبل (للتخزين على المدى الطويل) أو التشعيع بعد (لمدة 6 أشهر) ومخزن في النتروجين السائل كما تم وصفه س....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول يحسن كفاءة ساذجة مثل العودة مع ليف-3i في كلتا الثقافتين هبسك التقليدية أعدادا النسب تعتمد على التغذية وتغذية مستقلة (الشكل 1). البروتوكول مفصلاً، والموضحة هنا، التكيف متسلسلة الخطوط العريضة لليف-3i بدءاً من أما الشروط هبسك تعتمد على تغذية أو خالية من التغذية التقليدية (مثل E8 المتوسطة).
الممثل يؤدي لعودة 3i ليف هيس التقليدية عدة وتعرض خطوط هيبسك خالية من التحوير في ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يطبق النظام ليف-3i نسخة معدلة من السذاجة 2 طاء موريني الكلاسيكية كوكتيل الارتداد1 للخلايا الجذعية pluripotent البشرية. المتمتعة بالحكم الذاتي-تجديد هبسك (التي لا يمكن أن يتوسع في 2 طاء وحدها) استقرت في ليف-2 طاء بتكميل هذا الكوكتيل مع مثبط تانكيراسي XAV939. يسمح ليف-3i الثقافة السائبة وكفاءة عودة هبسك التقليدية إلى دولة pluripotent تشبه epiblast preimplantation البشرية3. على الرغم من أن آليات العمل من XAV939 في هبسك مجمع المحتمل والتآزر مع .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
بموجب اتفاق ترخيص بين "التكنولوجيات الحياة" وجامعة هوبكينز جونز (الرهبان)، يحق للدكتور زامبيديس أن نصيباً الإتاوات التي تلقتها الجامعة لمنح التراخيص للخلايا الجذعية. شروط هذا الترتيب يديرها الرهبان وفقا لسياساته تضارب في المصالح. وهذا لا يغير من صاحبي التقيد بالسياسات اليومية على تقاسم البيانات والمواد.
شكر وتقدير
وأيد المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة/نيي (R01EY023962)، والمعاهد الوطنية للصحة/NICHD (R01HD082098)، جائزة الابتكار ستاين تجمع الشعب البوروندي، ميريلاند صندوق أبحاث الخلايا الجذعية (2018-مسكرفف-4048، 2014-مسكرفي-0742)، نوفو نورديسك العلم المنتدى جائزة، ومؤسسة موزلي لهذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 1 |
المراجع
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
