Summary
Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo di modello consolidata utilizzato in una gamma di ricerca biomedica di base. All'interno della comunità di ricerca del nematode, c'è un bisogno di un modo conveniente ed efficace per mantenere la popolazione di grande, di pari età di c. elegans. Qui, presentiamo una metodologia per meccanicamente l'ordinamento e la pulizia di c. elegans. Il nostro obiettivo è quello di fornire un processo conveniente, efficiente, veloce e semplice per ottenere animali di dimensioni uniformi e fasi della vita per il loro uso negli esperimenti. Questo strumento, il setaccio di Caenorhabditis , utilizza un sistema di coperchio su misura che discussioni sui tubi conici laboratorio comune e Ordina di c. elegans basato sulla dimensione del corpo. Inoltre dimostriamo che il setaccio di Caenorhabditis trasferisce efficacemente animali dalla piastra di una cultura ad un'altra che consente un ordinamento rapido, la sincronizzazione e pulizia senza impattare gli indicatori di salute, tra cui motilità e lo stress-viscoelastico reporter gene. Questo strumento innovativo e accessibile è un'opzione veloce, efficiente e non stressante per il mantenimento di popolazioni di c. elegans .
Introduction
Il verme nematode Caenorhabditis elegans, è un organismo modello premier. Oltre la natura semplice e controllata della loro coltivazione in laboratorio, è loro intero genoma sequenziato1 e il destino dello sviluppo di ogni cellula è noto2. Grazie a queste caratteristiche, c. elegans è un organismo di modello ampiamente usato per gli studi genetici. Tuttavia, insieme con queste caratteristiche benefiche vengono alcune sfide per i ricercatori. A causa del loro tempo di generazione rapida, popolazioni di c. elegans possono rapidamente a corto di cibo e/o diventano popolazioni con più generazioni miste e stadi di sviluppo presentano in una sola volta. Così, gli esperimenti eseguiti su supporti di solida crescita del nematode (NGM) richiedono ricercatori spostare fisicamente gli animali in piatti freschi prima esaurisce la fonte alimentare batterica e nuove larve si sviluppano. Questo può essere noioso come un frequente trasferimento degli animali è necessaria per prevenire le popolazioni sperimentali da diventando mescolato con generazioni di prole. Ancora, alcuni esperimenti richiedono entrambi i grandi numeri di animali e punti di tempo prolungato (ad es., estrazione di DNA o RNA in età adulta). Questo composti le sfide di accuratamente mantenendo una popolazione sincronizzata e il trasferimento di grandi quantità di animali.
Attuali metodi di trasferimento di c. elegans coltivati su NGM sono picking o lavare gli animali da piastra a piastra; trattare chimicamente gli animali (per esempio, con il DNA replica inibitore fluorodeossiuridina o FUDR); o mediante citometria a flusso per ordinare gli animali in piastre multi-pozzetto. Picking prevede l'utilizzo di uno strumento a mano, realizzato con un sottile filo di platino o un ciglio, trasferire manualmente i singoli o più animali3,4. Questo metodo è preciso ma richiede abilità e il tempo ed è una limitazione per gli studi che coinvolgono un numero elevato di animali. Picking maggio anche essere fisicamente dannosa e stressante per gli animali sottoponendo gli individui potenzialmente importi innaturali e incoerenti della dispersione e della forza. Lavaggio comporta una piastra di coltura con una soluzione tampone di risciacquo e trasferimento della soluzione con gli animali tramite vetro pipetta Pasteur di una nuova piastra di coltura. Questo metodo è rapido ed efficiente, ma non è accurato come più generazioni e stadi di sviluppo degli animali vengono trasferiti alla rinfusa. Trattamenti chimici, ad esempio FUDR, possono essere sciolto in coltura media per prevenire la produzione di prole attraverso il blocco di qualsiasi replica del DNA e quindi, lo sviluppo di uova e produzione di gameti. Mentre efficace, questo metodo deve essere applicato dopo la maturazione dello sviluppo per non interferire con i normali processi di sviluppo, e questo significa che c'è ancora un requisito per trasferire gli animali prima della sua amministrazione3. Questo metodo influisce anche più cellulari vie di segnalazione, con conseguente effetti notevoli sugli animali che invecchiano (ad esempio, un'estensione di durata della vita o un'alterata proteostasis) a seconda del ceppo di c. elegans utilizzato5, 6,7,8,9,10. Il flusso cytometry metodi automaticamente ordinare e trasferire singoli c. elegans da una piastra multi-pozzetto per un altro11. Mentre questo metodo è molto efficace ed efficiente, apparecchiatura di citometria a flusso è proibitivamente costosi e inaccessibili per molti ricercatori. Un'alternativa al trasferimento di animali consiste nell'utilizzare modelli di mutanti che sono termosensibili, quali fer-15 e fem-1, che diventano sterili con temperatura regolazione12. Durante l'utilizzo di animali mutanti è utile in alcune situazioni, questi ceppi specifici crescono più lentamente rispetto agli animali wild type e fanno affidamento su un genoma alterato, che serve come poveri rappresentanti per invecchiamento o sani vermi. Inoltre, il ricorso a un cambiamento di temperatura per indurre sterilità risultati anche in assenza di un ambiente statico, e cambiamenti di temperatura sono state prontamente indicati per influenzare gene espressioni13,14, 15. gruppi di ricerca sono pubblicati in precedenza tecniche che descrivono l'uso di una mesh per filtrare c. elegans di dimensioni16. Tuttavia, siamo riusciti a trovare un lavoro precedente test per eventuali modifiche negli esiti di salute globale che possono essere associati con l'uso di tali filtri.
C'è, così, un'esigenza di un metodo conveniente, efficiente, rapida e accurata per trasferire grandi quantità di animali tra piastre di coltura all'interno della comunità di ricerca di c. elegans . Abbiamo sviluppato un migliorato, accessibile pezzo di equipaggiamento (denominato il setaccio di Caenorhabditis ) e un protocollo associato per la fabbricazione e il suo funzionamento che soddisfa le esigenze della comunità di ricerca di c. elegans . Qui, condividiamo il design del setaccio di Caenorhabditis e metodi per il suo utilizzo, e dimostriamo che il suo utilizzo non influisce la salute comune o eventuali marcatori di stress rispetto alla raccolta manuale standard e un trattamento con il comunemente usati, limitare la fertilità chimica FUDR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Caenorhabditis setaccio costruzione e uso
-
Protocollo di costruzione
- Acquisire 2 coperchi da provette coniche da 50 mL (Figura 1A).
- Rimuovere l'area di centro all'interno del labbro interno dei coperchi (quando hanno visto dal basso, Figura 1B) utilizzando un bruciatore di Bunsen e una sonda di metallo caldo o un saldatore o ha fatto un passo trapano.
Nota: Utilizza il calore per tagliare il coperchio di plastica è preferibile una lama perché c'è meno rischio di lesioni. - Pulire e carteggiare i bordi tagliati e la superficie con una lima curva o un rotary rettifica strumento (ad es., Dremel) superiore. Vedere Figura 1.
- Tagliare il cerchio del monofilo al diametro appropriato (Figura 1). Per questo, tracciare un coperchio su uno strato di maglia di nylon monofilamento e tagliare appena dentro la linea tracciata.
- Tagliare le scanalature/barre la superficie superiore dei coperchi per migliorare l'adesione dei due coperchi quando la colla è applicata alla plastica (Figura 1E).
- Pulire i coperchi con etanolo e lasciarli asciugare.
- Applicare la colla cianoacrilato per la superficie superiore di entrambi i coperchi, mantenendo verso il bordo esterno.
Nota: un po' di colla va un lungo cammino. - Posare il monofilo, secondo la tabella 1, su un coperchio incollato (Figura 1F). Posizionare il secondo coperchio rovesciato sopra la maglia; entrambi i coperchi devono avere loro cime insieme. Premere saldamente insieme (Figura 1). Assicurarsi che la rete sia tesa.
Nota: come misura di sicurezza, uso delle pinzette per posizionare la mesh sui coperchi. - Una volta che il primo strato di colla si è asciugata, applicare un anello della colla del cianoacrilato intorno allo spacco esterno tra i coperchi. Essere generosi come questo aggiunge l'integrità e impedisce qualsiasi peeling apart o con perdite.
- Etichettare il filtro con la maglia dei pori del monofilo.
Nota: Qui, usiamo due maglie poro — 20 µm e 50 µm.
-
Utilizzare il protocollo
- Pre-bagnato il setaccio.
- Dispensare una soluzione salina, come M9 [5 g di NaCl, 6 g di Na2HPO4, 3 g di KH2PO4, 1 L di ultrapura H2O e 1 mL di MgSO4 (1m)]17, attraverso il centro del setaccio sino ad ottenere una gocciolina , si condensa e gocciola fuori dal centro della parte inferiore del filtro (Figura 2A). Facoltativamente, applicare un panno privo di lanugine (ad es., Kimwipe) verso il basso per forma o diffondere una gocciolina di umidità sulla mesh.
- Posizionare il setaccio sopra una provetta conica da 50 mL. Etichettare la provetta come 'Tubo di rifiuti' (Figura 2B).
- Lavare una popolazione di c. elegans fuori una piastra di agar.
- Lavare la piastra con il buffer di M9 e posizionare il mezzo verme-contenente sulla fesa di monofilo 1 mL alla volta (Figura 2). Assicurarsi di operare nel centro della maglia. Lavare tutti i vermi dalla piastra.
Nota: In genere, 3 mL di M9 per un piatto di 60 mm è sufficiente. - Per ridurre al minimo il numero di vermi perdita nel pipettaggio, utilizzare un pipetta Pasteur di vetro per spostare i vermi fuori la piastra e al centro della maglia (ripetere se necessario).
- Risciacquare il filtro con il buffer di M9 dall'alto. Ancora una volta, assicurarsi di operare nel centro della maglia e sciacquare tutti i vermi in quella zona. Lavare tante volte quanto necessario per garantire che tutti i batteri e i più piccoli vermi sono passati attraverso le maglie.
- Lavare la piastra con il buffer di M9 e posizionare il mezzo verme-contenente sulla fesa di monofilo 1 mL alla volta (Figura 2). Assicurarsi di operare nel centro della maglia. Lavare tutti i vermi dalla piastra.
- Raccogliere gli animali di pari dimensioni dal setaccio.
- Allegare una nuova provetta conica 50 mL alla parte superiore della sieve, con i vermi adulti dal passaggio 1.2.2.3 rivolto verso l'interno del nuovo tubo di raccolta (Figura 2D).
- Rimuovere il primo tubo (tubo di scarico) e capovolgere velocemente il setaccio e il nuovo tubo per mantenere la goccia dalla migrazione (Figura 2E).
Nota: Se la sterilità non è necessaria, utilizzare un panno privo di lanugine (ad es., Kimwipe) per stoppino fluido dal basso della maglia prima del capovolgimento. - Sciacquare la mesh con M9 nel nuovo tubo 50 mL da nuovo fesa (Figura 2F). Ancora una volta, operare nel centro della maglia e mantenere una goccia sulla parte inferiore della maglia.
- Consentire i vermi di estinguere o li spin delicatamente verso il basso (ad esempio, < 16 x g) per circa 1 min (Figura 2).
- Aspirare la soluzione tampone dal pellet di vermi, idealmente verso il basso per > 0,5 mL, o rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare il pellet.
- Pipettare i vermi usando un vetro pipetta Pasteur su un piatto NGM e lasciarli asciugare. Spazio più goccioline fuori su un piatto nuovo modo si asciugano più velocemente (Figura 2 H).
- Pulire il filtro.
- Sciacquare il setaccio delicatamente e accuratamente con acqua etanolo e ad osmosi inversa. Lasciarlo asciugare.
- Conservare in un contenitore pulito per un utilizzo futuro indefinito.
- Scartarla quando la rete si sviluppa un aspetto di "sag".
- Pre-bagnato il setaccio.
2. convalida del setaccio di Caenorhabditis metodo di ordinamento
- Manutenzione generale
- Per tutti gli esperimenti, cultura worms su un Nematode crescita Media standard17 (1 L di NGM è costituito da 2,5 g di peptone, 17 g di agar, 3 g di NaCl, 975 mL di acqua bidistillata, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL, 1 mL di 1 M CaCl2 1 mL di 1 M MgSO4, 25 mL di 1 M KHPO4e 0,5 mL di 100 mg/mL di streptomicina) a 25 ° C.
- Amministrazione di trattamento sperimentale
- Confrontare i tre gruppi di trattamento: pick, fluorodeossiuridina (FUDR) e Caenorhabditis setaccio.
- Per il gruppo di trattamento di FUDR, aggiungere 100 mg/mL FUDR ai media NGM ad una concentrazione finale di 100 μM per prevenire qualsiasi produzione di progenie e trasferire i vermi ogni altro giorno per un piatto fresco di NGM per evitare lo svuotamento del cibo.
- Per il gruppo di scelta, selezionare e trasferire i vermi manualmente utilizzando un'ansa di platino.
- Per il gruppo di trattamento del setaccio Caenorhabditis , seguire passo 1.2 e pipettare i vermi in un piatto NGM.
- Confrontare i tre gruppi di trattamento: pick, fluorodeossiuridina (FUDR) e Caenorhabditis setaccio.
- Caenorhabditis Percentuale del rendimento del setaccio
- Per quantificare quanto sia efficace il setaccio è presso l'ordinamento di c. elegans, crescere età-sincrono N2 animali al giorno 1 dell'età adulta a 25 ° C (cioè, 48 ore dopo la deposizione delle uova) e poi trasferirli di raccoglierli per piatti freschi di NGM (per un totale N = 50 o N = 100 animali per tre gruppo di primarie).
- Dopo 24 h di recupero, trasferire la popolazione a nuove piastre di NGM con il setaccio di Caenorhabditis seguendo il precedente protocollo (Vedi punto 1.2) e contare il numero degli animali trasferiti con successo.
- Calcolare la percentuale del rendimento come il rapporto tra il numero degli animali trasferiti in confronto al numero di partenza all'inizio del trasferimento moltiplicato per 100 (%).
- Healthspan saggi
Nota: Punteggio ottenuto healthspan parametri della classe motilità, il tasso di pompa faringea e sia l'anteriore che la posteriore tocco delicato risposta nei giorni 2, 4, 6 e 8 di età adulta per età-sincronizzato N2 animali mantenuti a 25 ° C.- Motilità di rilevamento
- Assegnare i punteggi di motilità basati su un sistema basato su classi (classi A, B e C) seguendo i metodi di Herndon et al. 18. confrontare gli effetti dei tre gruppi sperimentali utilizzando un modello di statistiche logistica ordinale nel software di analisi statistica.
Nota: Gli individui classe A muovono spontaneamente in un modello normale, sinusoidale. Individui di classe B spostare nei movimenti contrassegnato non sinusoidale e possono richiedere incitamento per incoraggiare la circolazione. Classe C individui spostare loro testa o la coda in risposta alla sollecitazione ma non sono in grado di spostarsi attraverso l'agar.
- Assegnare i punteggi di motilità basati su un sistema basato su classi (classi A, B e C) seguendo i metodi di Herndon et al. 18. confrontare gli effetti dei tre gruppi sperimentali utilizzando un modello di statistiche logistica ordinale nel software di analisi statistica.
- Portata della pompa faringea
- Contare il movimento smerigliatrice della lampadina di pharyngeal terminale dell'animale visivamente sotto un microscopio stereoscopico a un 600 X ingrandimento finale per 1 min.
- Condurre un'analisi statistica con un one-way ANOVA con α = 0.05 e post-test di Bonferroni con α = 0.05.
- Risposta al tocco
- Registrare una risposta al tocco delicato e confrontare tra tre gruppi di trattamento. Eseguire i saggi basati su metodi descritti da Calixto et al. 19.
- Risposta al tocco record anteriore e posteriore delicatamente accarezzando un pick ciglia perpendicolarmente attraverso la coda o la testa (5 x ogni, alternando testa e coda) degli animali.
- Punteggio ottenuto qualsiasi movimento nella direzione opposta del tratto come 1 punto su una scala da 0 a 5 per l'anteriore e il posteriore risposta.
- Condurre analisi statistica con un one-way ANOVA con α = 0.05 e post-test di Bonferroni con α = 0.05.
- Motilità di rilevamento
- Dosaggio di fecondità
- Per determinare l'uso dell'impatto del setaccio Caenorhabditis sulla riproduzione, crescere età-sincrono N2 animali al giorno 2 dell'età adulta a 25 ° C.
- 60 h dopo uovo laici, trasferire gli animali a nuove piastre di NGM con un plettro di platino o il setaccio di Caenorhabditis e dare loro 4 h per recuperare (asciugare le piastre setacciate per 20-30 min).
- Dopo il recupero, individualmente piastra gli animali tramite una ciglia pick a piastre NGM, dare loro 24h per deporre le uova e rimuovere gli animali. Consentire la progenie su ogni piatto di sviluppare in condizioni normali a 25 ° C per altre 24 ore.
Nota: Un pick di ciglia è un ciglio umano fissato all'estremità di una pipetta di Pasteur con smalto e sterilizzata con etanolo. - Contare il numero di individui di generazione F1 praticabili. Eseguire un'analisi statistica usando un T-test con α = 0.05.
Nota: Prole vitali sono considerati da uova che si schiudono e cominciano il loro sviluppo attraverso i cicli regolari larvali con successo.
- Saggi di risposta dello stress reporter fluorescente
- Eseguire tre saggi reporter fluorescenti comunemente utilizzati per rilevare potenziali markers di stress: una traslocazione di DAF-16::GFP in nuclei delle cellule in un ceppo [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; un'espressione di hsp-16,2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; e un' espressione sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
- Per ogni dosaggio, cultura età-sincrono animali da tre gruppi di trattamento a 20 ° C ed esaminarli al giorno 3 dell'età adulta: utilizzare un controllo negativo (su base giornaliera, trasferire un gruppo di animali manualmente con un plettro di platino), un controllo positivo (su base giornaliera trasferire un gruppo di animali manualmente con un plettro di platino più un fattore di sforzo stabilito) e il setaccio di Caenorhabditis (passano gli animali attraverso il setaccio e consentire loro di recuperare per 30 min in NGM appena prima di imaging).
- Nell'analisi della DAF-16::GFP, calore shock gli animali di controllo positivo a 37 ° C per 30 min prima dell'imaging di20. Per il dosaggio di hsp-16.2, calore shock gli animali di controllo positivo per 90 min, 20 h prima dell'imaging di21. Per il dosaggio di zolla-3, è necessario trattare gli animali di controllo positivo con il paraquat di 100 mM per 4 h prima dell'imaging di22.
- Raccogliere i vermi immediatamente con un prelievo di ciglia e montarle un vetrino coprioggetto con 1 μL di soluzione 36% poloxamer 407 tensioattivo per immobilizzare i vermi.
- I vermi montati con un altro vetrino coprioggetto un panino. Montare due lamelle ad un vetrino standard di microscopia e immagini i vermi con un ingrandimento 8x su un microscopio a fluorescenza invertito (per un ingrandimento complessivo di 80 X) e una costante esposizione con un filtro FITC.
- Per rilevare eventuali differenze tra i tre gruppi nel test DAF-16::GFP, classificare gli animali in base alla posizione del DAF-16::GFP reporter (nucleare se il reporter traslocata ai nuclei, citosolici se il giornalista si trova nel citosol e se intermedio il giornalista che si trova in entrambi i nuclei e citoplasma).
- Confrontare i risultati utilizzando un modello statistico di logistica ordinale nel software di analisi statistica. Per la hsp-16.2 e analisi della espressione sod-3, è possibile utilizzare un one-way ANOVA con α = 0.05 e prove di post hoc di Tukey con α = 0.05 per confrontare la fluorescenza totale della regione della testa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il setaccio di Caenorhabditis è costituito da 2 tappi a vite, protezione di un'area di monofilo di nylon tessuto inferiore al diametro del corpo dell'età dello sviluppo desiderato, utilizzato per estrarre dal vivo popolazioni di organismi usando una tecnica semplice lavaggio. Si attacca ai tubi conici standard e utilizza il setaccio a maglie per ordinare meccanicamente animali di diametro del corpo, lasciando gli animali desiderati nel tubo pronto per la successiva manutenzione e sperimentazione (ad es., trasferimento o raccolto genetica). Un delicato lavaggio con il setaccio di Caenorhabditis manuale è veloce, circa 5 min per piastra 60 – 100 mm e gli organismi sono facilmente recuperati dalla mesh.
Rendimento degli animali seguendo Caenorhabditis Setaccio utilizzare
Per stabilire la percentuale del rendimento del setaccio Caenorhabditis , dispositivi sono stati testati con 20 μm e 50 μm trame di formato del poro su animali adulti. A dire la resa di un > 90% successo del trasferimento degli animali è stata realizzata per entrambe le taglie maglia testate (tabella 1).
Maglia del monofilamento con dimensioni diverse lacune possono essere utilizzate per separare gli animali delle diverse fasi della vita. Maglia con 20 μm lacune è adatta per lavare via lo sviluppo di embrioni e stadi larvali più piccoli di quarto stadio larvale, mantenendo quest'ultimo (L4; con un diametro medio corpo 32 μm) e tutti gli animali nelle successive fasi di vita, mentre mesh con 50 μm lacune permetterà tutte le altre forme di vita in scena da parte dagli adulti (con un diametro medio corpo 70 μm) essere spazzati via (tabella 2).
Caenorhabditis Uso di setaccio non ha alcun impatto healthspan metriche
Motilità: C. elegans il normale movimento sinusoidale (cioè, motilità) diminuisce con l'età18 ed è un indicatore di salute globale. Per determinare se il setaccio di Caenorhabditis influenzato motilità, motilità punteggi sono stati rispetto per il prelevamento, FUDR e Caenorhabditis setaccio i gruppi di trattamento nei giorni 2, 4, 6 e 8 della vita adulta. Tutti gli animali in ogni gruppo (n = 10/gruppo) hanno esibito i modelli di movimento normale e spontanea (classe A) alle età più durante l'età adulta (giorni 2, 4, 6 e 8 di età adulta; p > 0,05 per i confronti multipli su tutti i giorni, Figura 3).
Tasso di pompa faringea: La capacità dei muscoli pharyngeal c. elegans di pompa diminuisce con l'età ed è un altro biomarcatore di healthspan23. Per determinare se il setaccio di Caenorhabditis influenzato la portata della pompa faringea degli animali, pick, FUDR e Caenorhabditis setaccio trattamento gruppi sono stati confrontati nei giorni 2, 4, 6 e 8 di età adulta (n = 8 a 10 per ogni gruppo). C'era una differenza significativa tra gli animali che hanno subito la pennata e FUDR metodi giorni 6 (p < 0,001) e 8 (p < 0,001). Inoltre, c'era una differenza significativa tra i gruppi FUDR e setaccio giorni 6 (p < 0,001) e giorno 8 dell'età adulta (p < 0,001). Tuttavia, non c'era differenza statisticamente significativa tra il prelievo e i gruppi di setaccio Caenorhabditis per qualsiasi giorno (p > 0.05, Figura 4), che indica che il setaccio non influisca su questa misura di healthspan.
Tocco gentile risposta: Risposta a stimolo meccanico è un marcatore fisiologico per valutare invecchiamento o generale salute24,25; così, l'impatto dei metodi di trasferimento su entrambi l'anteriore e le risposte di tocco delicato posteriore sono stati testati. Non c'era differenza statisticamente significativa tra il prelievo e la FUDR Caenorhabditis setaccio i gruppi di trattamento (n = 8/group), sia anteriormente che posteriormente, per ogni giorno di test (p > 0,4 per tutti i confronti; Figura 5A e 5B).
Fecondità: Per stabilire se o non il setaccio di Caenorhabditis influenzato la quantità di progenie vitale prodotto da c. elegans, la prole individuo prodotta in un periodo di 24 ore durante il giorno 3 di età adulta era contato e rispetto (n = 20-22 per ogni gruppo). L'uso del setaccio Caenorhabditis non influenza significativamente il numero di progenie prodotta rispetto ad un gruppo di trattamento pick (p = 0,61, Figura 6).
Analisi molecolari reporter
Traslocazione nucleare DAF-16: In c. elegans, l'attivazione del fattore di trascrizione DAF-16 è associato con lo sforzo aumentato resistenza26. La localizzazione nucleare di DAF-16 è stata esaminata in un ceppo di nematodi transgenico TJ356, che esprime DAF-16 fusi a una proteina fluorescente verde (DAF-16::GFP)20. In condizioni di crescita normale, DAF-16::GFP è localizzata principalmente nel citosol, ma sotto vari fattori di stress (ad esempio, lo stress da calore), si è rapidamente traslocata nel nucleo20. Per verificare l'impatto dell'ordinamento con il setaccio di Caenorhabditis su DAF-16 traslocazione, DAF-16::GFP localizzazioni sono state confrontate in pari età giorno-5 adulti in un gruppo di controllo positivo (stress da calore), un gruppo di controllo negativo (trasferimento manuale tramite pick), e un gruppi di trattamento del setaccio di Caenorhabditis (n = 10/gruppo). Il trasferimento con il setaccio di Caenorhabditis non ha influenzato la traslocazione nucleare di DAF-16::GFP e ha mostrato un fenotipo simile agli animali di controllo negativo (p > 0.05, Figura 7).
HSP-16.2 reporter: proteine da shock termico piccolo come HSP-16.2 sono biomarcatori di una risposta di sforzo, e sono altamente espressi durante un'esposizione a shock termico o stress ossidativo agenti21,27. Il ceppo di TJ375 ha un gene reporter GFP fuso con un promotore di hsp-16.2 che non è attivo sotto condizioni normali21. Tuttavia, dopo un'esposizione a una scossa di calore, viene indotta l'espressione della proteina HSP-16.2 e visualizzano gli animali alti livelli di espressione di GFP21. Per testare il coinvolgimento del setaccio Caenorhabditis su una risposta allo stress HSP-16,2-mediata, la densità di fluorescenza nella regione della faringe (n = 10 animali/gruppo) di pari età animali è stato confrontato a giorno-5 adulti tra un gruppo di controllo positivo (calore lo stress), un negativo controllo gruppo (raccolto) e un gruppo di trattamento di Caenorhabditis setaccio. Il trasferimento con il setaccio di Caenorhabditis non ha indotto significativamente l'espressione di HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) rispetto al controllo negativo (p > 0.05, Figura 8).
SOD-3 reporter: In c. elegans, il gene anti-ossidante che codifica per la superossido dismutasi (SOD-3) 3 è up-regolato durante lo sforzo ossidativo28. Il ceppo di c. elegans CF1553 esprime la proteina fluorescente verde (GFP)-etichettato SOD-3 promotore, cui espressione è indotta da fattori di stress ossidativi, come il paraquat5. Per verificare il coinvolgimento di Caenorhabditis setaccio ordinamento sulla risposta antiossidante in c. elegans, la densità di fluorescenza nella regione cefalica di pari età adulti 5 ° giorno è stata confrontata fra una popolazione di controllo positivo (paraquat 100 μM trattamento), una popolazione di controllo negativo (raccolta manuale) e un Caenorhabditis popolazione trasferiti a setaccio. Il trasferimento con il setaccio di Caenorhabditis non ha indotto significativamente l'espressione di sod-3::gfp rispetto al controllo negativo (p > 0.05, Figura 9).
Figura 1: Costruzione di setaccio Caenorhabditis . L'andamento del 'fai da te' fabbricazione dello strumento è rappresentato. Questi pannelli mostrano (A) due 50ml tubo conico tappi (B) cui centri sono stati rimossi, (C) tagliare i bordi levigati e (D - F) che sono dotati di monofilo corrispondono alla fase di vita desiderato di C. elegans (Vedi il protocollo per i dettagli). (G) il setaccio completato inoltre è indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione dell'immagine dettagliata dell'uso di Caenorhabditis setaccio. (A), il setaccio è pre-bagnato con una goccia di soluzione di M9, e (B) in forma sulla cima di una provetta conica da 50 mL. Tubo superiore (C), 1 mL di soluzione con i vermi è dispensato sulla zona superiore della sieve, (D) una provetta conica da 50 mL è posto sopra il setaccio con i vermi rivolto verso l'interno del tubo e (E) il setaccio con un appena collegato M9 è rapidamente capovolto o ver (G) il setaccio viene risciacquato con M9 che trasportano gli animali desiderati in 50 mL nuovo tubo e i vermi sono autorizzati a stabilirsi per gravità verso il basso del tubo. (H) i vermi sono pipettati e collocati come goccioline su un piatto fresco di NGM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caenorhabditis setaccio non ha impatto motilità in tutta la durata. Questa figura mostra la distribuzione di classe di motilità degli animali ai giorni 2, 4, 6 e 8 di età adulta per il prelevamento, FUDR e gruppi di trattamento di Caenorhabditis setaccio. Classe agli animali trasferiti normalmente e spontaneamente, classe B animali spostato in modo anomalo e possono aver richiesto sia stato bonariamente e classe C animali erano incapaci di muoversi. Non c'era differenza tra Caenorhabditis setaccio, pick e gruppi FUDR (p > 0.05). Tre repliche (n = 10 animali per piastra di trattamento) sono stati condotti e analizzati con modello di logistica ordinale. animali di classe B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Utilizzo di Caenorhabditis setaccio non ha impatto pompaggio pharyngeal in tutta la durata della vita. Questa figura mostra i tassi di pompa faringea di pick, FUDR, e gruppi di trattamento di Caenorhabditis setaccio, rispetto nei giorni 2, 4, 6 e 8 della vita adulta. Gli asterischi denotano un significato tra il pick, setaccio e gruppi di trattamento di FUDR per i giorni specificati (* * * p < 0,05). Non c'era alcuna differenza tra il setaccio di Caenorhabditis e il gruppo di pick (p > 0.05). Due repliche (N = 10 animali per piastra di trattamento) sono stati condotti e analizzati con un one-way ANOVA e un post-test di Bonferroni. Le barre rappresentano la media ± errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Uso di Caenorhabditis setaccio non ha impatto risposta al tocco anteriore in tutta la durata. Questi pannelli mostrano l'anteriore (A) e (B), il conteggio di risposta touch posteriore del pick, FUDR e Caenorhabditis setaccio trattamento gruppi confrontati nei giorni 2, 4, 6 e 8 della vita adulta. Due repliche sono state condotte con N = 10 per ogni gruppo di trattamento e rispetto con un one-way ANOVA e un post-test di Bonferroni (p = 0,4 e p = 0,9 per anteriore e posteriore, rispettivamente). Le barre rappresentano la media ± errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Caenorhabditis setaccio non ha impatto la quantità di progenie vitale il giorno 3 dell'età adulta. Questa figura mostra la progenie vitale di giorno-3 adulti dopo un periodo di deposizione delle uova 24 h, che attraversa il giorno 3 dell'età adulta per animali riproduttori. Le barre rappresentano la media ± errore standard della media. N = 20-22 animali da almeno due replicati biologici separati per gruppo di trattamento. I gruppi di trattamento sono confrontati con un t-test, (p > 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Caenorhabditis setaccio non ha colpito la traslocazione nucleare di DAF-16::GFP. Questi pannelli mostrano immagini rappresentative della traslocazione DAF-16 del gruppo (A) una scossa di calore (controllo positivo), gruppo (B) un pick (controllo negativo) e gruppo di trattamento (C) un Caenorhabditis setaccio. (D) gli animali nel gruppo di controllo positivo mostrato un'attivazione della traslocazione nucleare DAF-16. Il setaccio di Caenorhabditis non ha indotto una traslocazione nucleare e visualizzata la proteina di fusione citosolico simile agli animali nel gruppo di controllo negativo. N = 10 animali per gruppo di trattamento da almeno tre replicati biologici separati. I gruppi di trattamento sono stati confrontati con un one-way ANOVA e test post hoc, di un Tukey. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Caenorhabditis setaccio non ha colpito l'espressione di hsp16.2::gfp. Le espressioni di HSP-16.2 (in unità arbitrarie fluorescenza) di un gruppo di scossa di calore (controllo positivo), un gruppo di pick (controllo negativo) e un gruppo di trattamento di Caenorhabditis setaccio vengono confrontate. Gli asterischi indicano un'alta espressione di hsp16.2::gfp per il gruppo di controllo positivo che era significativamente differente da altri gruppi del trattamento (* * * p < 0,05). Il setaccio di Caenorhabditis non ha colpito l'espressione di hsp16.2::gfp e visualizzata l'intensità di fluorescenza simili agli animali nel gruppo di controllo negativo (p > 0.05). Tre repliche sono state condotte con N = 10 per ogni gruppo di trattamento e rispetto con un one-way ANOVA e test post hoc, di un Tukey. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Caenorhabditis setaccio non ha colpito l'espressione di sod-3::gfp. Le espressioni di SOD-3 (in unità arbitrarie fluorescenza) di un gruppo di paraquat di 100 μM (controllo positivo), un gruppo di pick (controllo negativo) e un gruppo di trattamento del setaccio di Caenorhabditis sono mostrate. Gli asterischi indicano un'alta espressione di sod-3::gfp per il gruppo di controllo positivo che era significativamente differente dagli altri gruppi (* * * p < 0,05). Il setaccio di Caenorhabditis non ha colpito l'espressione sod-3::gfp e visualizzata l'intensità di fluorescenza simili agli animali nel gruppo di controllo negativo (p > 0.05). Tre repliche sono state condotte con N = 10 per ogni gruppo di trattamento e rispetto con un one-way ANOVA e test post hoc, di un Tukey. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Dimensioni delle maglie | N = 50 | N = 100 |
| 20 μm | 95,33% | |
| 50 μm | 99.00% | 93.33% |
Tabella 1: percentuale del rendimento dello maglie. Questa tabella mostra i risultati di un dispositivo di 20 μm testato con N = 50 adulti per 3 replicati e un dispositivo di 50 μm testato con N = 50 adulti per 2 repliche e con N = 100 per 3 repliche.
| Dimensioni delle maglie | Stadio di sviluppo | Diametro del corpo |
| 20 μm | Stadio larvale 4 | ~ 35 μm |
| 50 μm | Giorno 1 adulto | ~ 70 μm |
Tabella 2: Diametro corpo media. Questa tabella consente di visualizzare il diametro medio corpo acquisito da una media di 3 misurazioni ugualmente distribuite su ogni verme per 15 animali in ogni fase di vita misurata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nel presente documento, abbiamo introdotto la progettazione e l'uso del setaccio Caenorhabditis accessibile, efficace come strumento per l'ordinamento e il mantenimento di c. elegans. Questo strumento presenta diversi vantaggi per picking manualmente singoli animali, popolazioni, trattamenti chimici (ad esempio, FUDR) e metodi più costosi degli animali segregating di lavaggio. In primo luogo, il Caenorhabditis setaccio efficientemente e rapidamente (meno di 20 min) Ordina progenie da grandi popolazioni miste di animali (tabella 2). Inoltre, l'uso dello strumento ha effetti tossici rilevabili su healthspan degli animali (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6), non induce stress genetico ben descritto reporter (Figura 7, Figura 8 Figura 9) e riduce la quantità di prodotto chimico straniero che poteva influenzare il trattamento applicato per le piastre di coltura o di qualsiasi analisi molecolare da allora in poi. La sua facilità d'uso è un vantaggio significativo; un ricercatore in qualsiasi fase della loro formazione possa essere addestrato ad usarlo (Figura 1 e Figura 2; Protocol).
I materiali richiesti per la fabbricazione e l'uso del setaccio (ad es., pipette, buffer) sono prontamente disponibili nei laboratori di ricerca standard; così, se rotto, il setaccio di Caenorhabditis non è costoso da sostituire o riparare. La natura auto-costruita del setaccio Caenorhabditis permette di essere uno strumento versatile: può essere costruito con maglie di dimensioni appropriate per diverse c. elegans fasi inerenti allo sviluppo e fenotipi. Il setaccio di Caenorhabditis può anche essere utilizzato in esperimenti condotti in altre specie di nematodi o quando isolare piccoli organismi, forniti la dimensione delle maglie appropriato viene utilizzato al momento della fabbricazione.
Oltre ai vantaggi questo strumento fornisce per manutenzione di popolazione di c. elegans , il setaccio può essere usato per pulire gli animali prima del loro utilizzo in altre applicazioni sperimentali. Ad esempio, con lo sviluppo della microfluidica di c. elegans di condurre ricerca arriva il numero di chip uso e pulizia. A seconda della quantità di batteri collegati agli animali, speciali precauzioni devono essere prese per non intasare il chip microfluidici, rendendolo inutilizzabile29. Spesso, quando c. elegans sono trasferiti a un chip microfluidici, residuo dal prato batterico è portato con loro. Questo residuo può e intasare i canali microfluidici, rendendo il malfunzionamento del chip, che quindi richiede la pulizia o la sostituzione. Il costrutto di dispositivo in questo protocollo offre un metodo per la raccolta non solo animali sincronizzati per microfluidica, ma anche per la pulizia degli animali prima del loro inserimento in un dispositivo microfluidico. Rimuovendo i detriti e residui batterici, preso quando raccoglie gli animali, i canali microfluidici sono meno soggetti a malfunzionamento, aumentando così la vita operativa dei singoli chip e il throughput successivo della ricerca condotta con loro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare. Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Heather Currey per il suo contributo iniziale per lo studio di progettazione e Dr. Swarup Mitra per la sua revisione critica del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Michael B. Harris per commenti, perfezionamenti e assistenza nella produzione la dimostrazione di questa metodologia. I ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numeri UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 e di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) da il National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero 5P20GM103395-15. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. UA è un datore di lavoro AA/EO e istituzione educativa e vieta la discriminazione illegale contro qualsiasi individuo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
