Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Résumé

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

Résumé

À terminaisons nerveuses présynaptiques actives, les vésicules synaptiques subissent des cycles d’exo - et l’endocytose. Lors du recyclage, les domaines luminales de protéines transmembranaires SV deviennent exposés à la surface cellulaire. Une de ces protéines est synaptotagmine-1 (Syt1). Un anticorps dirigé contre le domaine luminal de Syt1, une fois ajoutée au milieu de culture, est repris pendant le cycle exo-endocytose. Cette absorption est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV et peut être quantifiée par immunofluorescence. Ici, nous combinons l’absorption anticorps Syt1 avec double transfection des neurones hippocampal cultivés. Cela permet de nous (1) localiser les sites présynaptiques basées sur l’expression du marqueur présynaptique recombinant synaptophysine, (2) déterminer leurs fonctionnalités à l’aide de l’absorption Syt1 et (3) caractérisent le ciblage et les effets d’une protéine d’intérêt, GFP-Rogdi.

Introduction

Étudier le recyclage de la vésicule synaptique est importante pour déterminer comment les propriétés présynaptiques changent, soit au cours de la plasticité synaptique, ou en réponse à la perturbation de la fonction synaptique. Étudier la synaptotagmine-1 (Syt1) absorption anticorps fournit une méthode de mesure de la quantité de recyclage de la SV. SYT1 est une protéine associée aux SV qui agit comme un capteur de Ca^{2 +} et est nécessaire pour la libération du neurotransmetteur^1,2exocytotique. C’est une protéine transmembranaire avec un domaine cytoplasmique C-terminal en dehors de la SV et un domai....

Protocole

Aucune étude avec des animaux vivants ont été menées. Expériences impliquant des animaux euthanasiés pour obtenir cell cultures ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T10/30. Les expériences ont été menées avec les protocoles approuvés.

1. Culture de cellules hippocampiques primaire

1. Préparer la culture de cellules dissociées de l’hippocampe du rat le jour embryonnaire 19^16,17. Plaque de cellules de lamelles de 12 mm recouvert de POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI) dans les plats de 24 p....

Résultats

Un résultat attendu de cette approche est localiser approximativement 50 double transfectées neurones par lamelle à une densité de 50 000 neurones par puits. L’axone de chaque neurone est censé montrer plusieurs points d’accès de fluorescent-étiquetées synaptophysine accumulation, indiquant les clusters nhsp. À des sites fonctionnels présynaptiques, le signal de synaptophysine recombinant putative ponctuée Syt1 fluorescence. À l’aide de transfection double, soit GFP-Rogdi comme la protéin.......

Discussion

Il y a trois tests couramment utilisées pour étudier les vésicules synaptiques (SV) recyclage. Les deux premiers comprennent l’utilisation d’un) styryl fluorescente colorants comme FM1-43 (qui incorporent dans les membranes et sont repris dans les organites au cours de l’endocytose sont libérés après exocytose) ; et b) fluorescent tag protéines recombinantes de SV (qui, à la surexpression, incorporent dans la machinerie protéique de recyclage). Si les fluorophores attachés changer leur fluorescence selon le pH, il peuven.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
CoolSNAP HQ2	Photometrics
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	Merck	8.03456.0100
âne anti souris Alexa 647	Jackson-Immunoresearch	715605151	anticorps
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS	Gibco	14190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120094
multipuits 24 puits	Fisher Scientific	087721H
tube (50 mL)	Greiner Bio-One
FBS supérieur	BiochromAG	S0615
Glucose	Merck	1 083 421 000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)	ThermoElectron Corporation
KCL	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-Glutamin	Gibco	25030
MgCl2	Honeywell	M0250-500g
lames de microscope	Fisher Scientific	10144633CF
Microsoft Excel	Microsoft
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
OpenView Experiment Analysis Application	Logiciel gratuit, voir les commentaires		écrits par Noam E. Ziv, Technion &ndash ; Institut de technologie d’Israël, Haïfa, Israël
PBS (10x)	Roche	11666789001
Optimem	Invitrogen	31985
Penstrep	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
Capot de sécurité	ThermoElectron		N° de série 40649111
Sucrose	neoFroxx	1104kg001
Synaptotagmin1 Synaptic	Systems	105311	souris monoclonale ; clone 604.2
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Vortex Genius 3  ;	IKA	3340001
Bain-marie	GFL	1004
Zeiss Observer. Z1  ;	Zeiss

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