Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.
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Artigo de método
Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot
Neste artigo
Resumo
Resumo
Reação em cadeia da polimerase digital da gota (ddPCR) é um método de reação em cadeia (PCR) polimerase quantitativos altamente sensível baseado no fracionamento de amostra em milhares de reações individuais nanométricas de água em óleo. Recentemente, ddPCR tornou-se uma das ferramentas mais precisas e sensíveis para a deteção de DNA (ctDNA) tumor de circulação. Uma das principais limitações da técnica padrão ddPCR é o número restrito de mutações que podem ser rastreados por reação, como sondas de hidrólise específica reconhecendo cada possível versão alélico são necessárias. Um método alternativo, o ddPCR de entrega, aumenta a taxa de transferência, pois requer apenas um único par de sondas para detectar e quantificar potencialmente todas as alterações genéticas na região alvo. Entrega ddPCR exibe sensibilidade comparável para ensaios de ddPCR convencional com a vantagem de detectar um maior número de mutações em uma única reação. É cost-effective, conserva o material precioso de amostra e também pode ser usado como uma ferramenta de descoberta quando mutações não são conhecidas a priori.
Introdução
Milhares de mutações somáticas relacionadas ao desenvolvimento de câncer foram relatados1. Entre estes, alguns são marcadores preditivos da eficácia da terapia-alvo 2,3 e genética triagem destas mutações é agora rotina clínica. Tecnologia digital de PCR (ddPCR) da gota pode ser usada para monitorar a presença ou ausência de mutações com exatidão elevada da deteção e é altamente compatível com não-invasivos biópsias líquido4,5. No entanto, ensaios de ddPCR atual principalmente são projetados para detectar mutações conhecidas ....
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Protocolo
O protocolo aqui apresentado segue as diretrizes de ética do Institut Curie. Todas as amostras humanas foram obtidas de pacientes matriculados, após consentimento informado, em estudos aprovados pelo Conselho de revisão institucional no Institut Curie.
1. recolha, armazenamento de Plasma e extração de DNA sem célula de sangue
Nota: O DNA extraído de qualquer tipo de "tecido" pode ser usado (por exemplo, fresco ou formaldeído-fixo parafina incorporado tecidos (FFPE), células em cultura ou sangue amostras). Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a coleta de sangue, plasma isolamento e armazenamento ....
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Resultados
Em um estudo de prova de conceito, KRAS exon 2 mutações (códons 12 e 13) e EGFR exon 19 exclusões foram investigadas em FFPE tecidos e amostras de plasma de pacientes com câncer usando o declive ddPCR estratégia6.
A sonda de entrega KRAS interrogado uma região bp 16, englobando várias mutações no exon 2 do gene KRAS , que abrigam mais de 95% das mutações conhecidas .......
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Discussão
Para projetar um ensaio de ddPCR de entrega eficiente, otimização é crucial, e o protocolo deve ser seguido cuidadosamente. Cada combinação de primers e sondas tem uma eficiência de reação de PCR exclusiva. Assim, um ensaio individual tem de ser cuidadosamente validado em amostras de controle antes de serem utilizados em amostras de teste valioso. Otimização e validação são importantes para a detecção do sinal de pico de certificar e avaliar a sensibilidade e especificidade. Conforme descrito no protocolo, todas as mutaç.......
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Divulgações
Vários autores são nomeados os inventores de duas patentes (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados à detecção de ctDNA.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Os autores também desejam agradecer Caroline Hego por sua contribuição ao vídeo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo K2EDTA (código de cores: lavanda) | Os tubos BD | 367863 | EDTA são usados para obter uma amostra de sangue total ou plasma EDTA |
| Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual) | Qiagen | 55114 | Para isolamento de DNA circulante de plasma humano |
| Kit de DNA circulante QIAsymphony DSP (protocolo automatizado) | Qiagen | 937556 | Para isolamento de DNA circulante de plasma humano |
| Sistema QIAsymphony SP | Qiagen | 9001297 | sistema totalmente integrado e automatizado para purificação de cfDNA, DNA ou RNA |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | Para purificação de até 24 cfDNAs simultaneamente |
| Fluorômetro Qubit | Invitrogen | Q33226 | O fluorômetro Qubit é um fluorômetro de bancada para a quantificação do leitor de DNA |
| QX100 ou QX200 | Bio-Rad | 186-3003 ou 186-4003, respectivamente | O leitor mede a intensidade de fluorescência de cada gota e detecta o tamanho e a forma à medida que as gotículas passam pelo detector |
| Gerador de gotículas QX100 ou QX200 | Bio-Rad | 186-3002 ou 186-4002, respectivamente | Instrumento usado para geração de gotículas |
| C1000 termociclador | Bio-Rad | 1851196 | Plataforma modular de termociclador, inclui chassi de termociclador C1000 Touch, módulo de reação rápida de 96 poços |
| Seladora de placas | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ Seladora de placas PCR |
| Porta-cartuchos DG8 | Bio-Rad | 186-3051 | Posiciona e segura o cartucho DG8 no instrumento para geração de gotículas |
| Cartuchos e juntas geradoras de gotículas | Bio-Rad | 186-4007 | Cartucho microfluídico DG8 usado para misturar amostra e óleo para gerar gotículas; As juntas DG8 vedam o cartucho para evitar a evaporação e aplicam a pressão necessária para a formação de gotículas |
| Supermix de PCR | Bio-Rad | 186-3010 | supermix de PCR ddPCR para sondas (sem dUTP) |
| Placas de PCR de 96 poços | Eppendorf | 951020362 | Placas semi-contornadas de 96 poços |
| Vedação de folha | Bio-Rad | 181-4040 | Selagem térmica de folha perfurável |
| ddPCR Óleo de leitor de gotículas | Bio-Rad | Óleo 186-3004 | usado na leitura |
| Óleo de geração de gotículas para sondas | Bio-Rad | 186-3005 | óleo para geração de gotículas |
| DNA loBind Tube 1,5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Os tubos Eppendorf LoBind maximizam a recuperação da amostra, reduzindo significativamente a ligação da amostra à superfície |
| Conjunto padrão de referência Multiplex I cfDNA HORIZON | HD780 | Os Padrões de Referência Multiplex I cfDNA são materiais de referência biologicamente relevantes e altamente caracterizados usados para avaliar o desempenho de ensaios de cfDNA que detectam mutações somáticas | |
| KIT DE ENSAIO QUBIT DSDNA HS, 500 | Life Technologies | Q32854 | O ensaio HS é altamente seletivo para DNA de fita dupla (dsDNA) sobre RNA e é projetado para ser preciso para concentrações iniciais de amostra de 10 pg/µ L a 100 ng/µ L |
| Tubos de Ensaio Qubit | Life Technologies | Q32856 | Os tubos de ensaio Qubit são 500 µ L tubos de polipropileno de paredes finas para uso com o fluorômetro Qubit |
Referências
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic C....
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Reimpressões e permissões
