Summary
抗体にリジンのシクロプロペン誘導体を組み込むことにより、抗体と薬物抱合体を生成する tetrazine ベアリング分子の部位特異的、迅速かつ効率的な連携。
Abstract
臨床実習でこの頃は使用される抗体と薬物抱合 (Adc) は、さまざまな異なる位置で毒素にリンクされている抗体分子の混合物です。前臨床研究は、毒素のサイト固有の連携によるこれらの伝統的な Adc の治療指数を改善できることを示しています。しかし、均質な Adc を生成する現在のアプローチは低蛋白質の表現および低速反応の速度論など、いくつかの制限にあります。このプロトコルでは遺伝コードの拡張を使用して抗体のリジン (CypK) のシクロプロペン誘導体の組み込む式システムを設定する方法をについて説明します。この最小限の bioorthogonal ハンドルにより、逆需要 Diels-alder 付加環化反応による tetrazine の誘導体の迅速な活用ができます。ここで報告式のシステムには、安易な生産および重鎖の各 CypK を軸受トラスツズマブの浄化ができます。毒素モノメチル auristatin E 抗体にリンクおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーと質量分析法・免疫を特徴付ける方法をについて説明します。最後に、我々 は活用から生じる dihydropyridazine リンケージのひと血清の安定性を評価するために、HER2 受容体の高レベルと乳癌細胞の ADC の選択的細胞毒性をテストするための試金をについて説明します。
Introduction
抗体薬物複合体 (Adc) は、伸びて性と小細胞分子の効力を組み合わせます。ほとんど Adc ターゲット癌細胞1DNA や微小管の重合に影響を与える薬によって従来の化学療法の副作用を減らすことを目的します。食品医薬品局 (FDA) によって承認された第一世代の Adc は、リジン、システイン、低下の薬物動態的特性2で別の位置に変更された分子の混合物を生成する変更に依存します。対照的に、抗体薬のサイト固有の共役化合物改善治療指数3,4を生成できます。均質な Adc を生産の課題に対処しようとして、いくつかの選択的な化学および酵素の変更は報告1、5とされています。しかし、現在の方法ことができます抗体の特定の位置のみを対象、低蛋白質の表現に苦しむ、低安定性をリンカーに提供またはゆっくりと低収量の反応に依存します。
遺伝暗号の拡張による非正規のアミノ酸類 (ncAA) の取り込みにより、可能性を生成するために使用する他の方法の限界を克服する蛋白質に bioorthogonal 反応グループの茄多のサイト固有のインストールAdc。ターゲット (停止) コドンに応えて ncAAs をエンコーディング標準アミノ酸6を組み込む内因性のペアに直交するアミノアシル tRNA 合成酵素/tRNA ペアに依存しています。いくつかの ncAAs は Adc を生成する抗体に組み込まれています。しかし、最も治療薬活用に適した様々 な負債に苦しみます。p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8はありません完全に bioorthogonal、p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, などアザイドながら低 pH (4.5) と反応時間が長い (> 60 h) が必要です。p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11、およびリジン (AzK)12,13のアジ化誘導体は、14細胞になることがあります、Huisgen 及び触媒に使用される銅は酸化的損傷を引き起こすことができます。15。
代替の ncAAs トランス cyclooctene (TCO) を基に、cyclooctyne (SCO)、ビシクロ [6.1.0] ノネン (BCN) 最近エンコードされている抗体のバイオ イメージング用、発現系に苦しんで非常に低い利回り (0.5 mg/L)16。さらに、cyclooctenes と cyclooctynes が大きい集計 -ADC ペイロードの ADC の感受性を高めることができる疎水性のハンドルが伝統的に疎水性とリンカーの物理化学的性質に大きく示されています。薬物動態と治療指数17に影響を与えます。対照的に、1, 3-disubstitued cyclopropenes、蛋白質の構造および physichochemical プロパティ18の最小変化を引き起こす必要があります小型の反応グループです。Cyclopropenes 選択的に急速反応電子オンデマンド逆 Diels-alder 付加環化19を介して tetrazines。このプロトコルではリジン (CypK、図 1 b) ベアリングが小さいメチル-シクロプロペン大きい緊張した不飽和サイクルより立体障害の影響を受ける、1 ~ 30 M-1のの順で反応速度定数の導関数の使用-1水溶液18,20で。
我々 は最近、tetrazine ベアリング分子21この最小限の bioorthogonal ハンドルを反応させることによって Adc を生成する抗体に CypK を組み込む方法を報告しました。ここで我々 は最も挑戦的な手順に重点を置いて詳細に ADC の準備手順をについて説明します。ピロリジル tRNA 合成酵素 (PylRS) を使用して CypK の設立を指示/tRNACUA(PylT) ペア抗体の重鎖に導入された琥珀のコドンに対応 (HC)22。ここでトランスフェクション (図 1 a)、1 つの抗体の重鎖をエンコード、他の 1 つの軽鎖 (LC)、PylRS/PylT カセットを含む両方のエンコードの 2 種のプラスミドを使用します。またより手間のかかる手順21を介して抗体歩留まりを可能にする安定したセルラインを生成できます。
前述式システムは、抗 HER2 治療免疫グロブリン 1 (IgG1) を作り出すことができる野生型抗体と同様のレベルで CypK とトラスツズマブ。我々 は、ncAA (HC 118TAG) をエンコードする重鎖の CH1 ドメインの最初の位置を選択します。これは Adc23で最もよく変更されるサイトです HC 118 (EU 番号) として知られているが、また HC-121 (シーケンスの位置) と HC 114 (Kabat 番号)24に呼ばれています。この位置は、すべての IgG1s の中で保存されている、のでこれらの表現システムはほとんどの治療上の抗体に従う義務があるはずです。
Trastuzumab(CypK)2簡単にによって精製できる蛋白質、続く疎水性相互作用列 (FPLC HIC) タンパク質の高速液体クロマトグラフィーによる紹介します。その後、抗体は共有に微小管重合阻害剤モノメチル auristatin E (MMAE) は、FDA が承認した ADC Adcetris で使用する 3 時間以内リンクします。ここでは、グルタル スペーサーとの後にp- aminobenzylalcohol self-immolative 単位; バリン シトルリン プロテアーゼ不安定なコンポーネントで構成されるリンカーと MMAE (tetrazine-vcMMAE) のベンジル-tetrazine 誘導体を使用します。このリンカーは、内面化毒素25の痕跡を残さない解放に終って ADC にリソソームにカテプシン B により切断されます。反応の広い範囲を表示するためには、抗体も蛍光 tetramethylrhodamine (耽羅) にリンクされます。我々 は質量分析計 (LCMS) に高速液体クロマトグラフィーによって共役の id を確認し、高速液体クロマトグラフィーを用いた疎水性相互作用列 (高速液体クロマトグラフィー-HIC) 薬-抗体比 (DAR) を計算する方法を説明します。.
抗体の性能の特性評価の一環として、ひと血清中の dihydropyridazine 結合の安定性をテストする方法をについて説明します。このパラメーターは、単純な elisa 法により定量化することができ、trastuzumab(MMAE)2のプロテアーゼの不安定なコンポーネントによって結果の解釈は、複雑ではないのでより簡単にトラスツズマブ耽羅で評価されます。最後に、選択性と trastuzumab(MMAE)2の効力は、HER2 のさまざまなレベルを表現する細胞間で ADC の細胞毒性評価を比較することによって評価されます。この試金はまた ADC の安定性・免疫血清で培養した後に実行するときの機能の検証を提供します。
Protocol
1. 生産し、抗体の特徴
- 抗体を表現します。
- 100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン 250 ng/mL アムホテリシン B. 維持で 8% CO2で 37 ° C でセル加湿搭載インキュベーターと式培の 50 mL を含む 250 mL フラスコに HEK 懸濁細胞のバイアルを解凍します。125 回転でシェーカー。株の前に少なくとも 2 回 0.3 0.5 x 106セル/mL (2-3 日ごと) にセルを分割します。
- 2.5 x 106セル/ml の密度は達された (2-3 日分割後)、準備 100 mM CypK の新鮮なソリューション。このため、CypK の 64 mg の重量を量る、すべて解けてない粒子を回復し、超音波照射下 0.1 の水酸化ナトリウム、渦、スピンの 2.5 mL を追加します。
- 抗生物質を添加した表現媒体の 42.5 ml 2.5 mL CypK (0.1 M NaOH で 100 mM) を追加します。よく混ぜる 0.1 M HCl の 250 μ L を追加し、0.22 μ m フィルターを使用して殺菌します。
- 低血清培地で 2.5 mL に HC と LC の pKym1 プラスミド21の 50 μ g を希釈します。別のチューブで減少血清培地で 2.5 mL トランスフェクション試薬の 135 μ L を希釈します。
- ソリューションを準備した後 5 分ミックス プラスミッドとトランスフェクション試薬溶液と DNA とトランスフェクション試薬間複合体の形成を許可する 20 分間インキュベートします。
- 一方で、500 × g で 5 分間ターゲット密度で 1 億 2500 万の細胞を遠心、CypK を含む表現媒体で再懸濁します、DNA-トランスフェクション試薬の混合物を追加します。CypK は、購入または報告以前18を合成できます。
- 20 h のための細胞を培養後、トランスフェクション試薬エンハンサー キットに付属の 250 μ L を追加します。
- CypK (培地交換は不要です式中) の付加の後の上清の 6-7 日から抗体を収穫します。
* またより高いより一貫した収量を得るためには、安定したセルライン生成できますオラー サルビアらで説明されているよう201821。この場合、trastuzumab(CypK)2は、単に式中 CypK 5 mM の追加によって表されます。
- 抗体を浄化します。
- 3000 × g で 15 分間細胞を遠心します。
- 0.45 または 0.22 μ m フィルターで上清をフィルター処理します。フィルターが隠蔽され、新しいものに交換してフィルタ リングを続行します。後数ミリリットルのみ場合は、遠心分離機の 7000 x g でさらに 15 分間清。
- 空ポリプロピレン カラムで蛋白質 A 樹脂 (上澄みの 2 mL/100 mL) を追加し、ビーズ洗浄バッファー (0.1 M リン酸ナトリウム、150 mM の NaCl) の少なくとも 5 冊と樹脂を平衡します。
- 2 つの 50 mL の円錐管に上清を分割し、続いて事前釣合い蛋白質 A 樹脂ビーズ洗浄バッファー (0.5 M リン酸ナトリウム、150 mM の NaCl) × 5 を追加します。清抗体をプルダウンする室温で 3 h のローラーの円錐形の管を配置します。
また: 推奨の樹脂量の少なくとも 2 倍の列で上清を追加し、通過できるようにします。、SDS-PAGE により上清に残っている抗体の有意な量ではないことを確認します。ある場合は、もう一度、樹脂を通して清を溶出します。 - 列に上清タンパク質 A 樹脂を転送し、液体を許可を通過します。
- 洗浄バッファー (または少なくとも 10 樹脂ボリューム) の 25 の mL を追加し、通過できるようにします。、
- 4 ml の 0.1 M クエン酸ナトリウム、pH 3、1 mL の 1 M リン酸バッファー、150 mM の NaCl の抗体を溶出します。
- 10 ml の PBS の抗体を希釈、0.5 - 1 集中 mL 遠心ろ過および PBS で 3 回交換バッファー。
- FPLC 0.5 mL/min と 0-100 の流ブチル HIC 列の使用によってサンプルを浄化高塩バッファー内低塩バッファー (50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0, 20% イソプロパノール) の 30 分の % 勾配 (1.5 M (NH4)2SO4、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0、5% イソプロパノール)。すべての画分を収集し、280 で溶出を監視 nm。少量 (< 1 mg) は、収量、純度を最大限に 2.4 で説明されている条件の下で高速液体クロマトグラフィー HIC で浄化することが。
- 抗体を含む、PBS で少なくとも 4 mL に希釈し、PBS で 3 回遠心ろ過と交換バッファーによってそれらを集中した分数をプールします。
- 抗体を定量化します。
- 280 で吸光度を測定することによりおおよその濃度を取得 nm マイクロ ボリューム分光光度計を使用しています。
- 正確な測定が必要な場合は、人間の Igg を測定する ELISA キットを使用します。大まかな見積もりのとおり Coomassie ベースの汚れで SDS-PAGE を使用してください。
- 1 mg/mL で elisa 法による定量化トラスツズマブ標準 2 倍 6 倍希釈することによって基準を準備します。
- 基準と読み込みバッファーを減らすに約 0.25 mg/mL で試料を沸騰します。
- 4-12% ビス トリス SDS-PAGE を使用してそれらを実行 MES SDS バッファーと Coomassie ベースの染料で染色します。最後に光や ImageJ を用いた重鎖に対応するバンドの色の濃さを測定し、標準曲線のサンプルからの信号を補間します。
- 4 ° C で抗体を保存します。
2. 抗体の共役し、ADC を特徴付ける
- Tetrazine ベアリング分子と抗体を共役します。
- 20 μ L のアセトニ トリルと小さな円錐管 (例えば、PCR チューブ) に 76 μ L の PBS の tetrazine vcMMAE (4 μ L、ジメチルスルホキシド (DMSO) で 3.4 mM) 10 モル同等を希釈します。
- Trastuzumab(CypK)2 (100 μ L, PBS で 2 mg/mL) の 1 モル当量を加えて混和, 3 h trastuzumab(MMAE)2を形成する室温 (25 ° C) で反応することができます。
注: tetrazine 5-耽羅など他の分子は、このプロトコルを使用して tetrazine vcMMAE ではなく抗体にリンクできます。
- ADC を浄化します。
- 製造元の指示に従って PBS で、サイズ排除カラムを平衡事前。
- 回転カラムと 1500 × g で 1 分間遠心に反応の全体のボリュームを追加します。
- ADC を定量化し、SDS-PAGE による共役を分析
- 1.3.2 で説明するように ADC を定量化します。SDS ページの軽鎖の色の濃さを測定することにより標準曲線の非修飾抗体を使用します。
- 重鎖は、活用に分子量の増加を示す少しシフトしている必要があります。
注: trastuzumab(TAMRA)2のように蛍光体に抗体を変更した場合は、染色する前にゲルの蛍光が重鎖に対応するバンドだけで表示されます。
- 高速液体クロマトグラフィー HIC によって共役を分析します。
- 100% のバッファー A と高速液体クロマトグラフィー HIC コラムを平衡させ (1.5 M (NH4)2SO4、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0, 5% イソプロパノール) 5 分。
- トラスツズマブ (CypK) 2 2 倍の 15 μ L での mg/ml 1 つ解決のミックス 15 μ L (67 pmol) は、バイアルのをバッファーします。HPLC で 10 μ L 注入をプログラムします。
- 続く 15 分勾配 B (50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0, 20% イソプロパノール) のバッファー A の 0 %100 から 1 分 100% のバッファー A のイソクラティック 1 mL/分フローで溶出します。280 で溶出を監視 nm。
- それぞれの種に対応するピークと次の式の結果の領域を使用して統合することにより、DAR を計算します。
DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Trastuzumab(CypK)2の予想される保存期間は 7.5 8.0 分、トラスツズマブ (CypK、MMAE) は 9.1 9.6 分、trastuzumab(MMAE)2は 10.5 11.0 分。
- LCMS による共役を分析します。
- 1 mg/mL ADC と非還元で非修飾抗体 Deglycosylate 30 μ L 37 ° C で少なくとも 6 時間 250 PNGase F ユニットを使用しての条件
- 水で 2 ~ 80% アセトニ トリル 20 分勾配を使用して 1-5 μ m 1.0 x 100 mm 列 C4 で質量分析計に抗体を溶出します。M/z 範囲は正イオン モードで 350-4000 コーン電圧 150 v のデータを取得します。
- Raw データの適切なソフトウェアを使用してようになりました。修正と変更されていない抗体質量の差を計算します。
3 Trastuzumab(TAMRA)2血清中の Dihydropyridazine のリンケージの測定安定性
- 無菌条件下で 0.22 μ m のフィルターを使用して血清をフィルター処理します。100 単位/ml ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシンを追加できます。
- 水で 96 ウェル プレートの外部井戸を埋めます。中央の井戸に最終濃度 0.1 mg/mL の PBS で 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2の 10 μ L でフィルター処理された血清の帳票の 90 μ L でミックスします。37 ° C と 4-5% CO2で湿度と飽和インキュベーターにプレートを配置します。
- ピペットの各 5 日間にわたってすべての 24 h も徹底的にミックス、5 μ L を分注、取る、液体窒素で急速凍結し-80 ° C で保存
- すべてのサンプルが収集されると、因数を解凍し、いくつかの変更と以前に報告された12として間接 elisa 法を用いた分析します。
- 4 ° C で 0.25 μ g/mL HER2 と一晩 96 ウェル プレートをコートします。他のすべての手順は、室温で実行されます。
- 次の日に PBS 0.05% トゥイーン (PBS-T) で 5 回を洗って、1 時間 1% ウシ血清アルブミンをブロックします。
- 洗って 2 時間 PBS の 1:10000 の希釈サンプルをインキュベートします。
- 洗って、1 時間 0.5 %bsa を PBS T の配分希釈でマウスで発生した反耽羅抗体を孵化させなさい。
- 洗浄し、抗マウス HRP 共役 1: 1000 1 時間 0.5 %bsa を PBS T で孵化させなさい。
- TMB を追加し、5-10 分に反応できるようにします。
- 50 μ L H2と反応、その停止4の 1 M とメジャーの吸光度 450 nm。570 で測定したバック グラウンド減算 nm。
- 標準的な希薄を 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰曲線に当てはめるし、サンプルから測定値を補間します。
注: trastuzumab(MMAE)2の安定性は、ADC の濃度を測定する市販 ELISA キットの 3.3 で説明されているアッセイを変更することで同じプロトコルを使用して評価できます。
4. ADC の細胞毒性を評価します。
注: このプロトコルは、いくつかの変更と以前に報告されたアッセイ23,26に基づいています。
- SK BR 3 および mcf-7 細胞を解凍し、10% 熱 DMEM は 100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 単位/ml ペニシリン、ウシ胎児血清を不活化すなわち完全培地を含む p25 フラスコに落ち着くことができます。
- アッセイの前に少なくとも 2 回の 80-90% 合流 (すべての 3-4 日) でセルを分割します。
- 2 日前のアッセイは、水で 96 ウェル プレートの外側の井戸を埋めます。その後 0.5 ミリメートルの EDTA、遠心分離機 250 x g で 3 分で 0.05% トリプシン リフト セルは新しい媒体で再懸濁します、96 ウェル プレートでの (空の) ウェルあたり 100 μ L で 3000 の細胞を播きます。
- 細胞を播種後 2 日間は、完全培地に 0.1 %dmso を 3 通すべてのサンプルの 10 のシリアル希薄を準備します。以下のサンプルとコントロールを考慮する: trastuzumab(MMAE)2trastuzumab(CypK)2、トラスツズマブ野生型、tetrazine vcMMAE、MMAE。
- 各ウェルに 100 μ L の各サンプルを追加し、37 ° C および 4-5% CO2で 5 日間インキュベートします。
- 5 日目、細胞生存率を測定します。この目的のためには、細胞を溶解し、ATP 放出を測定する市販キットを使用します。0.1 %dmso 処理制御の細胞に対する信号の割合をプロットします。
注: Adc が血清で 5 日間培養、機能の安定性を証明するために細胞毒性の試金。
注意: MMAE は非常に有毒です。したがって MMAE 誘導体を処理するときの手袋とゴーグルを使用します。あなたの実験でのコントロールとしてそのまま MMAE を使用すると DMSO で原液を準備するときに場合、は、ヒューム フード内部固体製品を扱います。
Representative Results
報告された一過性発現システム (図 1 a) には、22 ± trastuzumab(CypK)2培地、同じ条件 (図 1 c) 野生型抗体の 2/3 を表すのリットル当たり 2 mg が得られます。安定したセルラインは 31 ± 2 mg/L21までこの収量を増やすことができます。
Trastuzumab(CypK)2は、tetrazine-vcMMAE、25 ° C (図 2) で 3 時間以内準均一 trastuzumab(MMAE)2が得られますと共役することができます。このグリコプロテインの疎水性が高い 5 時 10% アセトニ トリル添加を必要とするまたは毒素 CypK あたりのより多くのモル同等を使用します。また、tetrazine-vcMMAE アセトニ トリル (図 2 c) なしの 2 の同等を使用して 20 時間内に、環化付加が完了も。Trastuzumab(CypK)2は、25 ° C で 2 時間以内 tetrazine 耽羅と反応し、温度が 4 ° C (図 3 c) に減少、3 〜 6 時間が必要。
Trastuzumab(MMAE)2 - ヒックは高速液体クロマトグラフィーを用いて予想される DAR は 1.9 (図 2 b) です。8.0 分でクロマト グラムの最初に観察されたピークは、非抗体 (DAR 0) を表し、反応が完了したとき完全に消えたはず。ダル 1 種 9.1 9.6 分を示して、3 時間後エリア < 10% あるはずダル 2 対象製品、予想] > 90 %10.5 11.0 の保持時間。移動性シフトと SDS ページのゲルの蛍光は、耽羅 (図 3 b) の定款及び、immunoconjugates の id (図 2 d-eおよび図 3 d) LCMS による検証を確認します。
ひと血清および elisa 法によるその後の分析の 5 日間の trastuzumab(TAMRA)2のインキュベーションは、ペイロードが (図 4 b) 抗体に添付されていることを確認します。Trastuzumab(MMAE)2を示しています高能 SK-BR-3 (HER2 高) の胸にがん細胞を半分の最大有効濃度 (EC50) 55 ± の細胞毒性の試金について 22 (図 4 d)。Trastuzumab(MMAE)2は、ひと血清 (図 4 c) で 5 日間の培養後細胞毒性を保持します。逆に、ADC は、MCF-7 (HER2 低) 試金される EC50は 200-fold (図 4 d) を下げます。野生型抗体, trastuzumab(CypK)2 , tetrazine-vcMMAE 対し MMAE 両細胞株 (図 4e) 高選択性細胞毒性が表示されます (図 4 d と 4 e)、非常に低い毒性を示します。
図 1: 一過性発現システムです。A. HEK293 細胞でのトランスフェクションに使用されるプラスミドの関連性の高い地域。CMV: サイトメガロ ウイルス プロモーター、WPRE: ウッド チャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、PylT: ピロリジル tRNA、U6: 特異的プロモーター、PylRS: pyrrolysil tRNA 合成酵素、> および <: トランスクリプションの方向。B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK)。C.野生型 (WT) トラスツズマブの式し、浄化蛋白質後しみの trastuzumab(CypK)2西で測定されます。誤差範囲は、生物をトリプリケートの標準偏差を表します。オラー サルビアらの許可を得てこの図が変更されました。201821。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: trastuzumab(CypK)2 tetrazine vcMMAE を活用。A.抗体 CypK 残基と MMAE の tetrazine 誘導体の逆電子需要 Diels-alder 付加環化反応。反応のグループが赤で強調表示されます、 paminobenzylalcohol は緑と青でバリン シトルリン ジペプチドで描かれています。B.高速液体クロマトグラフィー HIC のクロマト グラムが抗体の活用形の進行状況を示します。1.9 別試薬濃度を使用して最大の DAR に関して変換のc.程度。D e.活用の前後には、フルレングスの抗体の質量スペクトルを deconvoluted しました。Trastuzumab(CypK)2は、安定したセルラインを使用して得られました。オラー サルビアらの許可を得てこの図が変更されました。201821。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: trastuzumab(CypK)2 tetrazine 耽羅を活用。A.抗体 CypK 残基と耽羅の tetrazine 誘導体の逆電子需要 Diels-alder 付加環化反応。B. SDS ページのゲルの移動性シフトと耽羅の抱合によって発生したゲルの蛍光を示します。2 つの異なる温度でC.抱合反応。D. Deconvoluted 質量スペクトル trastuzumab(TAMRA) の2.Trastuzumab(CypK)2は、安定したセルラインを使用して得られました。オラー サルビアらの許可を得てこの図が変更されました。201821。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: トラスツズマブ抱合体の細胞毒性および血清の安定性。A.漫画内蔵 ADC で必要な機能を強調表示します。B. trastuzumab(TAMRA)2として elisa 法で測定した血清中の安定性。C.細胞生存率試験 trastuzumab(MMAE)2ひと血清 (+ 血清、黒) で 5 日後。コントロールのサンプルを PBS で血清の代わりに培養 (-血清、赤) 同法に含まれていた。D.細胞生存率試験たて、希釈サンプル。E.細胞生存率試験たて希釈 MMAE 誘導体。誤差範囲は、3 の独立した実験の平均値の標準誤差を表しています。オラー サルビアらの許可を得てこの図が変更されました。201821。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルで記述されている trastuzumab(CypK)2を生成する一過性発現手順は簡単、モジュール性の高いことができます。得られる利回り内にあるアカデミックな環境27で期待されるもの、生産収量21をさらに後押しする安定したセルラインを生成できます。式の間に CypK の濃度下げるより 5 mM 低い ncAA 定款にあり、高い金額が細胞の成長に影響を与えるし、抗体の利回りが低下します。遊離アミノ酸として CypK 低水容解性は最初 100 mM 0.1 M 水酸化ナトリウムで溶解し、培養液に追加されますので。媒体で、それをセルに追加する前に CypK を薄めても、HCl とフィルター殺菌する媒体を中和するために重要です。その後、このプロトコルで指定されたトランスフェクション試薬を使用、収式の重要次の製造元が推奨するインキュベーション時間です。ひと抗体の一過性の発現については、リーダーとその他公開プロトコル31,32が呼ばれます。
抗体を精製すると、タンパク質は樹脂の高い過剰上澄みからプルダウン完全抗体を確実に示されているように必要があります。トラスツズマブの溶出時に沈殿物を防ぐためには、高いバッファリングを容量、すぐに PBS で希釈したソリューションを使用し、過度の集中を回避するバッファーを交換推奨です。抗体は常に < 5 mg/mL。
Trastuzumab(CypK)2 tetrazine vcMMAE を活用は、Adc の他の bioorthogonal ハンドルと報告されたほとんどの反応よりも高速です。さらに、この cycladdition は非常に穏やかな条件の下で発生する: 部屋の温度や低いと生理学的 pH。PBS および抗体の添加前にアセトニ トリルと反応の DMSO 溶液を希釈することが重要です。それ以外の場合 tetrazine 誘導体を沈殿させます。アセトニ トリルは少ない疎水性分子共溶媒の添加は必要としないが、疎水性が高い MMAE と耽羅のためにだけ必要。また、tetrazine vcMMAE は、アセトニ トリルと tetrazine-vcMMAE 20 h 以内のモル同等物のみ 2 なし共役することができます。この毒素の少量は、ADC 現在 ncAA ベースのテクノロジと比較した場合の製造コストが大幅に減少を含むことができます。Trastuzumab(CypK)2は 4 ° C で保存するとき、少なくとも 4 ヶ月間完全に反応
高速液体クロマトグラフィー HIC MMAE 高疎水性があり、0, 1, 2 の毒素と抗体複合体に対応するピークの優れた解像度を提供しますのでダルの正確な定量が可能にします。未反応の tetrazine vcMMAE 約 13.7 分を示して、280 では検出されない nm。この手法では、純度の高い原料が必要です。また、それは彼らは、保持時間とピークの形状を変更できますので BCN オハイオなど他の tetrazine 反応の分子と反応を癒やすため推奨できません。サンプルの塩濃度と一致している移動相でグラデーションの開始で良い分離を得るために以上 10-20 μ L が注入される場合は特に重要です。
LC-MS 分析に関する抗体サンプル糖鎖切り出しが生のスペクトルのデコンボリューションに単一のピークを取得する必要です。合計抗体と ADC 質量の精度は、計測器のキャリブレーションによって異なります。したがって、変更のための質量を計算するために、ADC の得られたものからそのまま抗体取得質量を減算します。近代的な高分解能質量分析計は、1:10000 以下の相対誤差を提供しなければなりません。LC-MS は、異なる種の間の比率を計算する使用できますが、変更は生成した種のイオン化能力に影響を与えるために不純物の少量を検出されない場合がありますこの値は過大評価通常。
Adc のリンカーの安定性は重要な薬剤の早期リリースで高い毒性と効果が低い。無料グリコプロテイン損害健康な組織を裸の抗体は病気にかかったセルのターゲット結合サイトの武装の 1 つと競合しています。安定性試金の変動内である、5% 以下のリリースを期待する必要があります。
最後に、ADC trastuzumab(MMAE)2は SK BR 3 セル (HER2 高) の細胞毒性を比較することによって評価することができます、後者以来 mcf-7 細胞 (HER2 低) エクスプレス28 前者より少ない 15-fold の HER2 受容体、HER2 をターゲットの選択性.・免疫は、結果セル実行可能性に、少なくとも 2 桁の SK-BR - 3 MCF 7 と比較されたとき低いと予想されます。SK-BR - 3 EC50は、この ADC29,30高ポーテンシーを反映して 2 桁ナノモル範囲でする必要があります。非修飾抗体 trastuzumab(MMAE)2またはトラスツズマブ、必要がありますを示す毒性この試金。リンカー peptidomimetic 毒素の活動を削除しますので、効果 3 桁低い ADC より Tetrazine vcMMAE が必要です。逆に、MMAE は30の細胞膜を透過すること、ADC に同様の毒性があるが HER2 高と HER2 低細胞の識別表示されませんそれする必要があります。さらに、血清中の ADC の 5 日間の培養後この分析を実行する場合使える機能的リンカーの安定性の証拠を提供する: 毒素のリリースになりますいずれかに SK BR 3 で ADC 効率の減少 p MMAE がリリースされた場合リンカーまたはリンカーは痕跡を残さない方法で切断された場合選択性の減少の芸術。
ここ記載されている ADC 技術により、IgG1s にリジンのシクロプロペン誘導体の効率的なサイトスペシフィックな定款です。次の簡易精製 tetrazine を含む分子、均質な製品を降伏との抗体を急速に共役することができます。小さなサイズとシクロプロペン最小限ハンドルの高い反応性のためこのメソッド必要があります立体障害のペイロードの活用を有効にします。結果 immunoconjugates 血清中安定している、非常に強力な選択。全体的にみて、CypK 抗体および治療や診断で使用する他の蛋白質複合体の高速、サイト固有で安定の bioorthogonal リンクができます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、医療研究評議会は、英国によって支えられました。BO は S.エンボ フェローシップ (ATLF 158-2016) を保持し、H. ペラムとサポートについては、J.W. あごと g. キム、C ・ W ・ モーガンと助けやアドバイスを o. Perisic に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
| Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
| 125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
| Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
| Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
| Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
| Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
| Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
| Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
| HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
| Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
| Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
| Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | - | Costum synthesized |
| Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
| Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
| PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
| NanoAcquity | Waters | ||
| C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
| 96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
| CO2 incubator | Panasonic | ||
| HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
| Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
| Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| TMB | BioLengend | 421101 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
| PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
| SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
| Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
| Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
| MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
| Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
| Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
| Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |
References
- Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen. Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).
- Hamblett, K. J., et al. Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).
- Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code. Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Tian, F., et al. A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).
- Kern, J. C., et al. Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates. Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- VanBrunt, M. P., et al. Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).
- Xiao, H., et al. Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells. Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).
- Milles, S., et al. Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence. Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).
- Koehler, C., et al. Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering. Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).
- Lyon, R. P., et al. Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).
- Elliott, T. S., et al. Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal. Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).
- Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems. Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).
- Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).
- Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).
- Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
- Junutula, J. R., et al. Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Junutula, J. R., et al. Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs. Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).
- Doronina, S. O., et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).
- Shiraishi, Y., et al. Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).
- Sabourin, M., et al. Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM). CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102 (2011).
- Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer. Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).
- Shinmi, D., et al. One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies. Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).
- Badescu, G., et al. Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).
- Vazquez-Lombardi, R., et al. Transient expression of human antibodies in mammalian cells. Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).
- Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).
