Summary
، نقدم هنا بروتوكولا السابقين فيفو الرئة سرطان نموذج يحاكي خطوات تطور الورم ويساعد على عزل ورم الابتدائي، تعميم خلايا الورم، وآفات المنتشر.
Abstract
من الصعب عزل الخلايا السرطانية في مراحل مختلفة من تطور الورم. قمنا بإنشاء نموذج الرئة السابقين فيفو يمكنه إظهار التفاعل بين الخلايا السرطانية مع مصفوفة الطبيعي والتدفق المستمر للمواد الغذائية، وكذلك نموذج يوضح التفاعل بين الخلايا السرطانية مع المكونات الخلوية العادية ومصفوفة طبيعية. يتم إنشاء نموذج الرئة اللاخلوي السابقين فيفو بعزل كتلة قلب والرئة في الفئران وإزالة كافة الخلايا باستخدام عملية ديسيلولاريزيشن. يتم ربط القصبات الرئيسية الحق قبالة وتوضع الخلايا السرطانية في القصبة الهوائية بحقنه. نقل الخلايا وملء الرئة اليسرى. ثم يتم وضع الرئة في مفاعل حيوي حيث يتلقى الشريان الرئوي إلى تدفق مستمر لوسائل الإعلام في دائرة مغلقة. الورم في الرئة اليسرى من الورم الرئيسي. ورم الخلايا التي يتم عزل في وسائط الإعلام يتناقل تنتشر الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية في الرئة اليمنى آفات المنتشر. يتم إنشاء نموذج الرئة الخلوية السابقين فيفو بتخطي عملية ديسيلولاريزيشن. يمكن استخدام كل نموذج للإجابة على الأسئلة البحثية المختلفة.
Introduction
سرطان خبيث هو السبب وراء معظم الوفيات الناجمة عن السرطان، ويشكل التحدي النهائي في الجهود المبذولة لمكافحة السرطان. والهدف العام لهذا الأسلوب هو تصميم بروتوكول لثقافة رباعية الأبعاد (4-د) خلية التي بعدا من التدفق، بالإضافة إلى نمو الخلية (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد. وهي تمثل ثلاث مراحل متميزة لعملية ورم خبيث [أي، الورم الرئيسي، تعميم الخلايا السرطانية (ريادية)، وآفات المنتشر].
على مدى العقود الثلاثة الماضية، حقق العلماء في جميع أنحاء العالم ثروة لم يسبق لها مثيل من المعلومات فهم الآليات الكامنة وراء تطور المنتشر في مختلف أنواع السرطان التي تحسن إمكانية علاج أو البقاء خالية من التقدم. الإدارة السريرية لبعض أنواع السرطان، مثل سرطان الثدي، تحسنت بدرجة كبيرة1؛ ومع ذلك، لا تزال لديها بعض أنواع السرطان، مثل سرطان الرئة، وبقاء فقراء2. نماذج حيوانية في المختبر و في فيفو كان لها دور أساسي في توليد رؤى جديدة في الآليات التي تدعم تطوير المرض. في السنوات القليلة الماضية، خلية تكثيفها المستمدة من خط (CDX) وقد تم تكثيفها المستمدة من المريض (PDX) أكثر فائدة كما أنها تحافظ على العديد من الميزات ذات الصلة الورم البشري الرئيسي3، مثل حركية النمو، ميزات النسيجي، والسلوكية الخصائص، والاستجابة للعلاج. ومع ذلك، كل نموذج لها حدودها لفهم إليه تشكيل لجنة مكافحة الإرهاب وورم خبيث إلى جهاز بعيد4،،من56.
في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج سرطان الرئة 4-د السابقين فيفو باستخدام مفهوم إعادة هندسة الجهاز وثقافة الخلية على أساس التروية. فإنه يحاكي نمو سرطان الرئة البشرية عن طريق تشكيل الورم بيرفوسابل العقيدات التي تنمو على مر الزمن مع إنسان مماثلة السرطان يفرز البروتين إنتاج7. وهو يمثل التوقيع التعبير الجيني الذي تتوقع بقاء الفقراء في المرضى الذين يعانون من السرطان، وكما يبين استجابة علاجية بورم في الانحدار عند سيسبلاتين معاملة8،9. كذلك تعديل نموذج الرئة حيث أن أنها يمكن أن تشكل آفات المنتشر. تتطور من الورم الرئيسي وإينترافاساتي إلى المفرج ريادية واكسترافاساتي في الرئة كونترالاتيرال تشكل آفات المنتشر10. دراسات التعبير الجيني تشير إلى ملف تعريف تعبير متميزة من الورم الرئيسي وريادية، والآفات المنتشر، و upregulation من مجموعة فرعية الجينات المطلوبة ل النمط الظاهري10. تحدث هذه العملية المنتشر بسبب وجود الظروف البيولوجية ينظر في المرضى الذين يعانون من السرطان. وميزة هذا النموذج هو وجود مصفوفة طبيعية والهندسة المعمارية، ونضح المواد الغذائية الذي يؤدي إلى تشكيل الورم العقيدات. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يوفر أيضا فرصة لدراسة آثار مختلف مكونات وورم المكروية أو المخدرات على تطور الورم على مر الزمن. يمكن استخدام هذا النموذج لنمو مجموعة من الخلايا السرطانية (سرطان الرئة، وسرطان الثدي، ساركومه إلخ) في إنشاء مختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكولات للتجارب على الحيوانات كانت وافقت عليها لجنة الاستخدام في معهد بحوث الميثودية هيوستن ورعاية الحيوان المؤسسية ونفذت وفقا لجميع اللوائح والقوانين المعمول بها، والمبادئ التوجيهية والسياسات.
1-فأر الحصاد الرئة
- تخدير الفئران سبراغ داولي ذكور 4-6 أسبوع بحقنه (الملكية الفكرية) داخل من الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ) في الجناح به. ضمان التخدير بالتأكد من عدم وجود حركة عندما يكون مقروص تو أطرافهم هند بالملقط.
- بعد 10 دقيقة، يحلق في الصدر والبطن ومسح الجلد بمسحه الكلورهيكسيدين.
- إزالة الجلد بالتقاط أنه مع الملقط وإينسيسينج أنه مع مشرط المتاح. بعد فتح تجويف الصدر عن طريق إينسيسينج مع مشرط، أداء thoracotomy ثنائية بقطع على الجانب الأمامي من القفص الصدري على الجانب الأيمن والجانب الأيمن للحجاب الحاجز بالمقص.
ملاحظة: هذا عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة. - تصمد القفص الصدري وحقن 2 مل الهيبارين (1,000 وحدة/مل) في البطين الأيمن لقلب ينبض باستخدام إبرة ز 27.
ملاحظة: هذا سوف يمنع أي تشكيل الجلطات الدموية في الرئة. - تماما إزالة القفص الصدري مع المقص ووضعه إبرة ز 18 في البطين الأيسر كتنفيس، حتى يخرج الدم. بعد ذلك، ضخ 15 مل من هيبارينيزيد فوسفات مخزنة المالحة (12.5 وحدة/مل؛ برنامج تلفزيوني هيبارينيزيد) في البطين الأيمن باستخدام إبرة ز 25.
- قطع أدنى وأعلى الأجوف فينا، هما الأوردة الكبيرة في الجانب الأيمن من القلب، وتدفق الرئتين مع إضافية 10 مل من برنامج تلفزيوني هيبارينيزيد في البطين الأيمن باستخدام إبرة ز 27.
ملاحظة: هو تصور الأجوف فينا أدنى تحت الجزء السفلي من القلب كسفينة كبيرة مليئة بالدم الحمراء. وبالمثل، هو تصور الأجوف فينا متفوقة في الجزء العلوي من القلب كسفينة كبيرة. - قطع القصبة الهوائية في القاعدة للغدة الدرقية. بعناية إزالة الابهر تنازلي على مستوى الوريد هيميازيجوس وفروع من الشريان الاورطي في القوس.
- إخراج كتلة القلب والرئة من تجويف الصدر وباقي الجسم الفئران.
- أداء فينتريكولوتومي بقطع نصف البطينين الأيمن والأيسر ووضع قنية إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ 18 جرام المعبأة مصنوعة خصيصا من خلال البطين الأيمن إلى الشريان الرئوي الرئيسي (السلطة الفلسطينية).
- تأمين القنية مع ربطه عنق حرير 2-0 وفضح بعناية في البطين الأيمن والاذين.
- ضع حاجز اللوير الإناث في البطين الأيسر وتأمينه بتعادل حرير 2-0.
- تدفق كتلة القلب والرئة مع 20 مل هيبارينيزيد برنامج تلفزيوني من خلال قنية السلطة الفلسطينية ووضعها في أنبوب 50 مل تحتوي على وسائط الثقافة أو برنامج تلفزيوني هيبارينيزيد.
ملاحظة: لنموذج خلوية، انتقل إلى الخطوة 3.1 لإعداد في مفاعل حيوي. نموذج اللاخلوي، انتقل إلى الخطوة 2.1 ديسيلولاريزيشن.
2-الرئة ديسيلولاريزيشن
-
إعداد وحدة ديسيلولاريزيشن
- تعد كل دائرة ديسيلولاريزيشن/زجاجة خارقة لاثنين من الثقوب في غطاء الزجاجة والعض اللوير الإناث في الثقوب (الشكل 1A و 1B). تأمين ذلك مع عصابة نايلون أسود على الجانب الآخر. وبالمثل، حفر حفرة واحدة في آخر زجاجة كاب للمرفق المحدد عن طريق الحقن الوريدي (الشكل 1).
ملاحظة: الشكل 1A و 1B من نفس قبعات زجاجة من الجانبين مختلفة. الرقم 1 من قبعة مختلفة مع ثقب واحد كما ورد أعلاه في الخطوة 2.1.1. - إرفاق أنبوب 0.5 بوصة (في الشريان الرئوي أو نهاية السلطة الفلسطينية) وأنابيب 6 بوصة (الشكل 1J) نظام الإناث من داخل زجاجة قبعات (الشكل 1A و 1B) وإرفاق قفل اللوير ذكور في النهايات. تعيين القفل مع زجاجة 500 مل كالدائرة/زجاجة ديسيلولاريزيشن.
- قم بتوصيل طرفي واحد من أنبوبين متر 2 (التي ترتبط بقفل اللوير ذكور) أما ينتهي من أنبوب المضخة (الشكل 1 ح)، الملحقة بمضخة الرأس (الشكل 1E و 1F) بخرطوشة (الشكل 1) مع اللوير الإناث قفل (1I الشكل).
- قم بتوصيل نهايات أخرى 2 قدم الأنابيب (من الخطوة 2.1.3) كل إلى ربه قفل اللوير على سقف الغرفة/زجاجة ديسيلولاريزيشن (الشكل 1 لتر).
- تعيين لأعلى 250 مل هيبارينيزيد زجاجة PBS (مع 200 مل من برنامج تلفزيوني) شنقاً زجاجة مقلوبة على الوقوف مع نهاية الدانية مجموعة عن طريق الحقن الوريدي (الشكل 1) بإدراجه في غطاء الزجاجة ونهاية القاصي استبدال الأنبوب 2 قدم متصلاً ج ديسيلولاريزيشن هامبير/زجاجة في نهاية السلطة الفلسطينية (الشكل 1B). قم بتوصيل هذا الأنبوب 2 قدم زجاجة المرتجع.
ملاحظة: يتم تعيين الزجاجات في الورق المقوى، كما هو مبين في الشكل 1 كيلو بايت. الأنابيب الوريدية الخروج من الزجاجات معلقة الاستغناء عن الكواشف في سقالة الرئة.
- تعد كل دائرة ديسيلولاريزيشن/زجاجة خارقة لاثنين من الثقوب في غطاء الزجاجة والعض اللوير الإناث في الثقوب (الشكل 1A و 1B). تأمين ذلك مع عصابة نايلون أسود على الجانب الآخر. وبالمثل، حفر حفرة واحدة في آخر زجاجة كاب للمرفق المحدد عن طريق الحقن الوريدي (الشكل 1).
-
عملية ديسيلولاريزيشن الرئة
- تشغيل برنامج تلفزيوني هيبارينيزيد عند ضغط التروية الفسيولوجية من 30 ملم زئبق (الشكل 1 K) حتى يتدفق بحرية في الدائرة/زجاجة ديسيلولاريزيشن، وثم قم بإرفاق كتلة القلب والرئة إلى نهاية السلطة الفلسطينية من خلال قنية السلطة الفلسطينية.
- تذكر تشغيل المضخة بشكل مستمر، بحيث يحصل تجاهل أي فائض المخزن المؤقت/الحل داخل الدائرة/زجاجة ديسيلولاريزيشن.
- قم بتشغيل برنامج تلفزيوني هيبارينيزيد من خلال السلطة الفلسطينية لمدة 15 دقيقة عند ضغط التروية 30 ملم زئبق للغسيل الأولى (الشكل 1 K).
- استبدال زجاجة PBS هيبارينيزيد مع الصوديوم 0.1% دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في المياه ونتخلل في الرئة ح 2 ديسيلولاريزيشن.
- وبعد ديسيلولاريزيشن، نتخلل يعقم المياه عن طريق السقالة الرئة لمدة 15 دقيقة.
- ثم نتخلل المنظفات غير الأيونية 1% في المياه لمدة 10 دقائق.
- استبدال ديسيلولاريزيشن الدائرة/الزجاجة مع 500 مل من يعقم برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 1 x المضادات الحيوية (البنسلين والستربتوميسين الامفوتريسين)، المساس في الرئة معلقة مع السقف داخل الزجاجة.
- تجاهل الوريد تعيين، وضع أنبوب 2 قدم يعلق على الحاوية تجاهل مرة أخرى إلى نهاية الشريان الرئوي دائرة ديسيلولاريزيشن، وتشغيل المضخة في 6 مل/دقيقة (الشكل 1 لتر).
- نتخلل الرئتين ح 72 والحفاظ على تغيير برنامج تلفزيوني مع المضادات الحيوية كل ح 12.
ملاحظة: الرئة اللاخلوي جاهز للاستخدام الفوري. يمكن تخزينه في-80 ˚C حتى المطلوبة. إذا كان يمكن تصور البقع الوردي أو تجلط الدم الواضح في الفصوص الرئة، إهمال الرئة. فمن الممكن لاختبار عشوائي للحمض النووي أو الأنسجة. لن يتم إظهار الرئة اللاخلوي كاملة سوف يتم غسله الخلايا و 99.9% من الحمض النووي.
ملاحظة: عند العمل مع نموذج الرئة خلوية، تخطي ديسيلولاريزيشن. يمكن تعيين الرئة المقطوع (الخطوة 1) مباشرة في مفاعل حيوي.
3. إنشاء مفاعل حيوي
- تحضير زجاجة مفاعل حيوي والعناصر اللازمة للإنشاء.
- حفر ثقوب ثلاثة في واحد 500 مل زجاجة كاب على مسافة متساوية وإصلاحها اللوير الإناث في كل ثلاثة ثقوب، استخدام حلقات النايلون الأسود (الشكل 2 ألف و 2 باء).
ملاحظة: في اثنين من الثقوب، قفل اللوير ينتهي الوجه الخارج، في حين يواجه نهاية واحدة داخل الزجاجة. - قطع 6 في أنبوب المضخة، 2 في الأنبوب، 6 في أنبوب أنبوب 1.5 متر، وأنبوب 2 متر وأنبوب مكساج 10 أقدام كل مفاعل حيوي.
- قص إبرة فولاذ المقاوم للصدأ 18 جرام، ومرة أخرى، ربط النهايات مع أنابيب متوافق حيويا قنية الرغامى.
- التفاف أنبوب مكساج، مع نظام تأمين الموصلات في نهايات، في شبكة سلك لولبي استخدام اﻷوتوكﻻف الأشرطة (الشكل 2).
- اﻷوتوكﻻف المشار إليها أعلاه البنود وإبقائهم في الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 10 دقائق.
- حفر ثقوب ثلاثة في واحد 500 مل زجاجة كاب على مسافة متساوية وإصلاحها اللوير الإناث في كل ثلاثة ثقوب، استخدام حلقات النايلون الأسود (الشكل 2 ألف و 2 باء).
- إعداد المضخة داخل حاضنة الثقافة الخلية العادية (37 درجة مئوية، 5% CO2) مع تباعد السليم بين الصواني تناسب بسهولة زجاجة 500 مل.
- رش الإيثانول 70% على خرطوشة مضخة وربط أنبوب المضخة مع موصلات قفل اللوير الإناث على طرفي للمضخة.
- قم بإعداد مكساج الملتفة حول شبكات سلكية اللولبي داخل حاضنة الثقافة الخلية عن طريق توصيل أحد طرفي (التدفق) مكساج أنبوب المضخة والآخر مع أنبوب 1.5 متر في مفاعل حيوي.
- إعداد زجاجة مفاعل حيوي في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع ظروف معقمة.
- إرفاق محبس الحنفية 3-طريقة (أصفر) على رأس واحدة من لارس الإناث للسيطرة على التدفق من خلال السلطة الفلسطينية.
- الاتصال محبس الحنفية أحادية اتجاه (أزرق) إلى آخر اللوير لوك الحاجز الإناث للخلية البذور عن طريق القصبة الهوائية (الشكل 2 واو).
- ربط 2 في الأنابيب في الخارج (أبيض) و 6 في أنابيب داخل الزجاجة بتعميم وسائل الإعلام بها. صالح قفل اللوير ذكور لأنبوب 2 متر وإرفاق نمط العروة اللوير الإناث المحملة لتوفير إمكانية الوصول إضافة أو إزالة أي شيء.
- إرفاق محبس الحنفية ذات اتجاه واحد إلى واحد من الفتحات موصل ثلاثي (العروة اللوير الإناث نمط المحملة).
- إرفاق قفل اللوير ذكور والإناث قفل اللوير أنابيب 2 متر.
- إضافة 200 مل RPMI1640 مع 10% FBS و 1% المضادات الحيوية خلية الثقافة المتوسطة (يختلف حسب متطلبات الخلية) ونقل مفاعل حيوي للحاضنة. قم بتوصيل أنبوب مكساج طرفي مفتوحة (محبس الحنفية أحادية الاتجاه وموصل المحملة) لجعله مفاعل حيوي حلقة مغلقة.
- قبل تشغيل المضخة في 6 مل/دقيقة داخل حاضنة الثقافة الخلية مع خلية ثقافة الإعلام لملء مكساج والأنابيب، حيث وجود لا فقاعات الهواء في الأنبوب.
- عندما تمتلئ الأنابيب أغلق محبس الحنفية وسائط الإعلام، وإزالة زجاجة مفاعل حيوي من الحاضنة بقطع اﻷوكسيجين في كلا طرفي زجاجة مفاعل حيوي.
- وضع زجاجة مفاعل حيوي في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء وتمرير وسائط الثقافة من خلال محبس الحنفية إرفاق قنية السلطة الفلسطينية من السقالة الرئة (اللاخلوي أو الخلوية) محبس الحنفية من خلال رابط اللوير الذكور.
ملاحظة: هنا من الممكن استخدام النموذج اللاخلوي (بعد عملية ديسيلولاريزيشن) أو كتلة الطازجة المحصودة قلب والرئة (أينموذج الخلوية، كما أنه يحتفظ بخلايا الفئران الأصلي). - تمرير وسائط الثقافة من خلال محبس الحنفية أحادية اتجاه إزالة أي الهواء وربطه عنق قنية الرغامى بخيط حرير إلى القصبة الهوائية.
- تأكد من تجنب أي التواء للسلطة الفلسطينية والقصبة الهوائية. إغلاق غطاء زجاجة مفاعل حيوي مع الرئة سقالة داخل، ومرة أخرى، أسيبتيكالي نقل في مفاعل حيوي للحاضنة وبدء تشغيل المضخة بسرعة 6 مل/دقيقة.
- تشغيل وسائط الثقافة لمدة 10-15 دقيقة للتأكد من الحصول على مبالغ فيها جميع الفصوص والرئة تبدو في حالة جيدة (الشكل 2).
4-نموذج ورم خبيث وبذر الخلية
ملاحظة: انتقل إلى الخلية البذر مع نموذج الرئة أعلاه لدراسة نمو ورم الرئيسي. تعديل سقالة الرئة (اللاخلوي أو الخلوية) على النحو التالي للنموذج المنتشر.
- تأخذ بها في مفاعل حيوي مع سقالة الرئة من الحاضنة ووضعه في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
- استخدام المحاقن قفل اللوير لتمرير 5 مل وسائط الثقافة من خلال القصبة الهوائية وافتح غطاء مفاعل حيوي مع الشنق سقالة الرئة (الشكل 2 واو).
- في هذه الخطوة، مطلوب شخص آخر للمساعدة في تعديل نموذج المنتشر في الرئة.
- الحصول على الحرير 2-0 جاهزة واستخدام الملقط الزاوي لجعل تمرير من خلال القصبة الهوائية عند نقطة التشعب.
- ربطه عنق القصبة الهوائية الذهاب إلى الرئة اليمنى عند نقطة التشعب وتحقق التدفق الحر لوسائل الإعلام من خلال القصبة الهوائية للرئة اليسرى بتمرير وسائط الثقافة.
ملاحظة: عندما يرتبط القصبة الهوائية عند نقطة التشعب، خلايا المصنف عن طريق القصبة الهوائية تلقائياً ستوجه إلى البذور الفصوص الأيسر. يمكن اختباره قبل البذر الخلايا بدفع الثقافة الإعلامية عن طريق القصبة الهوائية. في طراز المنتشر، سينتقل وسائط الإعلام إلى الفصوص الأيسر فقط، وتضخيم، وليس إلى حق الفصوص10. - تعيين حقنه 20 مل قفل اللوير على رأس قنية الرغامى وإضافة خلايا سرطان الرئة ATCC (A549، H1299) في 50 مل من RPMI1640 وسائل الإعلام ثقافة كاملة (الشكل 2 واو).
- أداء الخلية البذر في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. إضافة 15 مل خلايا في المحاقن والسماح لها بالمرور من خلال فصوص الرئة بالجاذبية. إضافة ما تبقى الخلايا قبل أن يمر أي فقاعات الهواء.
- في الرئة اللاخلوي البذر، جمع وسائل الإعلام perfused يقطر في زجاجة مفاعل حيوي والسماح لها بالمرور عبر القصبة الهوائية x 3 مرة أخرى.
ملاحظة: وسائط الإعلام perfused أحياناً على الخلايا السرطانية المصنف. ولذلك، لبذر فعالة، إعادتها وسائل الإعلام مرة أخرى في القصبة الهوائية عن طريق المحاقن. - عندما تبذر، إزالة المحاقن والانتظار لمدة 15 دقيقة، وإضافة وسائط جديدة والعودة مفاعل حيوي إلى حاضنة. قم بإزالة أي فقاعات الهواء في الأنبوب.
- بدء تشغيل المضخة نتخلل وسائط الإعلام في 6 مل/دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتحتفظ الرئة حصادها من الفئران سليمة المفرج والحويصلات الهوائية11 (الشكل 3 ألف و 3 باء). عند ديسيلولاريزيشن، يتم الاحتفاظ بعناصر المصفوفة خارج الخلية الرئة اللاخلوي، مثل الكولاجين، فيبرونيكتين، والايلاستين،11 (الشكل 3و 3D، 3Eو 3F). ديسيلولاريزيشن يؤدي إلى إزالة كاملة من خلايا الفئران الأصلية موجودة في الرئتين، التي يمكن ملاحظتها الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ تبين عدم وجود خلايا وعن طريق تحليل الحمض النووي11 تبين أن ثمة انخفاضا في كمية الحمض النووي ( الشكل 3D و الجيل الثالث 3g). يمكن استخدام نموذج الرئة 4-د السابقين فيفو لزراعة أي نوع من خلايا ملتصقة12. سرطان الرئة والرئة تنتجها الخلايا الليفية وسرطان الثدي والخلايا ساركومه كانت تزرع بالبذور من خلال القصبة الهوائية11،،من1213. يسمح نموذج خبيث لجمع أنسجة الورم الرئيسي، وريادية، وآفات المنتشر في فترات زمنية مختلفة لوبيكتومي10. تلطيخ ح & ه من الأنسجة وأظهرت المفرج سليمة والحويصلات الهوائية في كلا الخلوية واللاخلوي النموذج (الشكل 3 ح و 3I). نموذج اللاخلوي 4-د الرئة طراز الوظيفة إضافية دراسة التفاعل بين المكونات المختلفة المكروية. يوفر طراز الهاتف الخلوي 4-د الرئة المكروية الرئة سليمة مع لا الخلايا المناعية14. يمكن إضافة الخلايا المناعية لهذا النموذج من خلال المفرج لدراسة أثرها على نمو الورم والتفاعل مع الخلايا السرطانية. يمكن تقييم إمكانية تكرار نتائج ونوعية النموذج قبل تشغيل النموذج في التكرارات وتحليل خلايا الأنسجة/ح & ه وإيمونوهيستوتشيميستري باستخدام علامات خاصة بالخلية. ويبين الشكل 4 الرسم تخطيطي الذي يمثل الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها في خلق نموذج الرئة 4-د السابقين فيفو .
رقم 1: مطلوب عناصر لوحدة ديسيلولاريزيشن من السقالة الرئة. يتم حفر قبعات زجاجة 500 مل (A و B) ويتم إعداد الإناث اللوير الروابط مع أنابيب لإنشاء الزجاجات ديسيلولاريزيشن. (ج) احتياجات أخرى زجاجة كاب ثقب واحد فقط لإعداد (د) في الوريد لتدفقات كاشف عن طريق الشريان الرئوي من السقالة الرئة. يتم إعداد المضخة مع (و) مضخة، (ه) رأس مضخة، و (ز) خرطوشة. (ح) مضخة الأنابيب مع موصلات اللوير الإناث في كل نهاية والموصلات (أنا) (ي) أنابيب مع الذكور اللوير الموصلات في كلا طرفي مطلوبة لإعداد (ك) وحدة ديسيلولاريزيشن. تغسل السقالات (L) الرئة لمد 3-5 في نظام حلقة مغلقة مع 1 x المضادات الحيوية فطري في برنامج تلفزيوني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: إنشاء مفاعل حيوي لثقافة خلايا الرئة 4-د السابقين فيفو . (أ و ب) يتم حفر مفاعل حيوي أغطية زجاجات (500 مل) ويتم إدراج ثلاثة موصلات قفل اللوير الإناث والثابتة مع عصابة نايلون أسود. (ج) 10 أقدام مكساج أنبوب يتم التفاف حول لولبي شبكات سلكية مع عصابات لا يتجزأ قفل اللوير الذكور على طرفي. وتعد القنية الشريان الرئوي (د) و (ﻫ) قنية الرغامى استخدام أنبوب ز 18 إبرة ومضخة. يتم تعيين (F) مل 20 ألف حقنه بموصل أحادي الاتجاه القصبة الهوائية البذور الخلايا في الفضاء الظهارية من السقالة الرئة. (ز) معداً مفاعل حيوي مغلقة داخل حاضنة الثقافة الخلية التروية ونمو الورم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: صور الممثل من طراز الرئة 4-د السابقين فيفو لورم خبيث. (أ) كتلة سليمة قلب والرئة هو المقطوع من الفئران 4-6 أسبوع. (ب) الأنسجة تظهر الحويصلات الهوائية وبنيوموسيتيس. (ج) ديسيلولاريزيشن يؤدي إلى الإزالة الكاملة لخلايا الرئة. التشريح المرضى (د) يظهر غشاء سليمة مع الرئتين اللاخلوي. (E و F) وصمة عار بينتاتشرومي والايلاستين موفات الذي يكشف عن وجود الكولاجين، فيبرينوجين، والايلاستين مع المفرج سليمة والقصبات الهوائية. ويبين تحليل (ز) الحمض النووي انخفاضا في محتوى الحمض النووي لأكثر من 99%. (ح) الرئة الخلوية يمكن أن تستخدم مباشرة في مفاعل حيوي لخلية ثقافة و (أنا) تحليل النسيجي يظهر وجود نمو الورم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: رسم تخطيطي عرض أهم الخطوات في إنشاء نموذج الرئة 4-د السابقين فيفو . في الخطوة 1، يتم حصاد كتلة قلب والرئة من الفئران. وفقا لمتطلبات الدراسة، في الخطوة 2، الرئتين يمكن استخدامها أما مباشرة كنموذج خلوية أو يمكن أن تكون ديسيلولاريزيد لإزالة أي من الخلايا الأصلية. الخطوة التالية تتضمن إعداد نموذج الرئة في مفاعل حيوي والبذر الخلية. وأخيراً، يتم إعداد المفاعلات الحيوية في الحاضنة لثقافة الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الرئة 4-د السابقين فيفو يوفر فرصة لدراسة نمو الورم والانبثاث في إنشاء مختبر. مصفوفة الرئة أصلي هو نظام معقد التي تقدم الدعم لانسجة طبيعية ويحافظ على التفاعلات خلية خلية، والخلية-مصفوفة التفاعلات، والتمايز الخلوي وتنظيم الأنسجة. أنه يوفر فرصة لإضافة أي مكونات ورم المكروية لدراسة آثارها على نمو الورم والتفاعل مع خلايا أخرى.
الحصاد الرئة هو الخطوة الحاسمة لنموذج الرئة 4-د السابقين فيفو . قد يؤدي إلى تأخير في إدارة حقن الهيبارين بعد فتح الصدر تجلط الدم في الرئتين، مما قد يؤثر على التدفق الحر الكواشف خلال ديسيلولاريزيشن. التنظيف السليم مع برنامج تلفزيوني هيبارينيزيد حتى يأتي سائل عديم اللون من المنافس مهم، لا سيما فيما يتعلق بالنموذج الخلوية. قطع حذراً من الأجوف فينا متفوقة أمر هام لتجنب إلحاق أي ضرر بالسلطة الفلسطينية. أثناء عملية ديسيلولاريزيشن، من المهم جداً تجنب فقاعات الهواء الانتقال إلى سقالة الرئة. وجود فقاعات الهواء قد تبطئ أو وقف تدفق المواد الكاشفة والإسهام في ديسيلولاريزيشن غير لائق. يمكن إزالة الفقاعات بمص بها فقاعات باستخدام حقنه 10-20 مل. من المهم جداً للتأكد من هو ليس الملتوية قنية السلطة الفلسطينية. أثناء إنشاء مفاعل حيوي، أي التواء في الأنابيب قد يؤدي في إطار منبثق في الموصلات، ويؤدي إلى فوضى كاملة داخل الحاضنة. لتجنب التواء في القنية، القنية/الإبر ويمكن خفض وإعادة الاتصال باستخدام أنابيب متوافق حيويا، مما يوفر المرونة اللازمة لتدوير القنية دون الإخلال بالاتصالات. أي تسرب لوسائل الإعلام الثقافة داخل الحاضنة قد تتطلب زيادة التنظيف المهنية. أثناء إنشاء النموذج ورم خبيث، خياطة الحذر مطلوب في موقع التشعب القصبة الهوائية. أي ثقب القصبة الهوائية أو الرئتين يؤدي إلى تسرب الخلايا ونتائج غير متناسقة.
نماذج الرئة 4-د اللاخلوي والخلوية السابقين فيفو لديها العديد من المزايا عبر الثقافات التقليدية خلية ثلاثية الأبعاد فهم أفضل لتطور السرطان، كما أنها توفر فرصة لدراسة الخطوات البيولوجية الرئيسية في ورم خبيث مع إضافية بعد تدفق. كلا النموذجين تقليد بيولوجيا نمو الورم وورم خبيث وإتاحة فرصة لجمع الخلايا السرطانية في مراحل مختلفة من نمو السرطان فهم أفضل للتواقيع الجينات والاستجابة للعلاج وتطوير المقاومة للعقاقير. على الرغم من أنها مصفوفة الرئة، أنها يمكن أن تنمو مجموعة من خطوط الخلايا المحددة والخلايا الأولية. الحد طراز 4-د السابقين فيفو هو شرط > 10 ملايين الخلايا البذر للدراسة ورم خبيث. خلايا مع احتمال ضعيف التكاثري قد يستغرق وقتاً أطول لتظهر آفة المتنقل. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب هذا النموذج ظروف معقمة أكثر حالما يتم المصنف الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كيم ص دقيقة تلقي الدعم منحة من "جون الثاني جورج منحة البحث كيركلين"، الرابطة الأمريكية لمنح الصدر جراحة، غراهام مؤسسة، هيوستن الميثودية تخصص الطبيب فريق الأبحاث، ومايكل م. وجوان H. مخروط جائزة البحث. ونحن نشكر سيكين Ann لتحرير اللغة من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A.
- Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308 (2012).
- Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
- Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
- Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
- Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
- Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
- Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).
