Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.
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Artigo de método
Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudar o Regulamento de efferocytosis requer métodos que são capazes de quantificar com precisão a absorção de pilhas apoptotic e sondar os processos de sinalização e celulares que controlam o efferocytosis. Esta quantificação pode ser difícil de executar como pilhas apoptotic são frequentemente efferocytosed fragmentada, necessitando de métodos que podem delinear com precisão entre a parte de efferocytosed de um alvo de apoptotic contra residual celular unengulfed fragmentos. A abordagem descrita neste documento utiliza abordagens dual-rotulagem para quantificar com precisão a dinâmica da capacidade de efferocytosis e efferocytic de efferocytes tais como macrófagos. O citoplasma da célula apoptótica é rotulado com uma tintura de seguimento-celular para habilitar o monitoramento de todos os materiais derivado de células apoptóticas, enquanto biotinylation superfície da célula apoptótica permite a diferenciação entre interiorizado e não-internalizada fracções de células apoptóticas. A capacidade de efferocytic de efferocytes é determinada pela tomada de imagens fluorescentes de células vivas ou fixas e quantificar a quantidade de limite contra alvos interiorizados, como diferenciados pela coloração de estreptavidina. Essa abordagem oferece diversas vantagens sobre os métodos tais como citometria de fluxo, ou seja a delimitação exata de não-efferocytosed contra efferocytosed apoptotic fracções de célula, a capacidade de medir efferocytic dinâmica por microscopia de viver-pilha e o capacidade para realizar estudos de sinalização celular em células expressando transgenes fluorescente-etiquetadas. Os métodos descritos neste protocolo combinado, servem como base para uma abordagem experimental flexível que pode ser usada para quantificar com precisão a atividade efferocytic e interrogar as vias de sinalização celulares ativas durante efferocytosis.
Introdução
Apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico que ocorre na maioria dos organismos multicelulares e é crucial para seu desenvolvimento e homeostase1altamente regulamentados. Além de estar envolvido na renovação celular normal e o desenvolvimento embrionário, apoptose permite a eliminação de células infectadas ou danificadas de tecidos e pode ser acionado em resposta à infecção, inflamação, câncer e também por intervenções médicas como a radioterapia ou esteroides1. Células apoptóticas expõem "coma-me" sinais em sua superfície celular, que são reconhecidos pelos receptores em um intervalo de fagócitos p....
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Protocolo
Coleta de sangue de voluntários saudáveis foi aprovada pelo Conselho de ética de saúde ciência pesquisa da Universidade de Western Ontario. Foi realizada punção venosa em conformidade com as orientações da instrução de diretiva Tri-Conselho na pesquisa humana.
1. cultura e preparação da linha celular THP-1 monócito
- Monócitos THP-1 de cultura como uma cultura de suspensão em frascos T25 em 37 ° C + 5% de CO2. Células devem ser cultivadas em 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% de soro Fetal bovino (FBS).
- Células de suspend cada dia uniformemente em toda a mídia de crescimento,....
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Resultados
Uma noite de cultura de células Jurkat com resultados de staurosporine de 1 µM em apoptose de > 95% das células, que podem ser confirmadas com anexina V coloração (Figura 1). Outros tipos de células podem ser usados para estas experiências, embora a concentração de staurosporine e a duração do tratamento staurosporine precisará ser otimizado para cada linha de celular. Para detecção confiável e quantificação de efferocytosis, > 80% das células deve ser .......
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Discussão
Os métodos descritos neste protocolo permitem que a imagem e a quantificação do processo de efferocytic dinâmico, com abordagens tanto fixo-célula e célula viver. Essas abordagens oferecem diversas vantagens sobre os métodos baseados em citometria de fluxo comumente empregados23,24. O uso de coloração de dentro para fora com amostras fixas fornece uma quantificação mais robusta e precisa da taxa e a extensão da efferocytosis — de fato, muitos métodos baseados em .......
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Divulgações
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelos institutos canadenses de saúde (CIHR) de pesquisa operacional Grant MOP-123419, ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá Discovery Grant 418194 e um Ontario Ministério da investigação e inovação início Research Award para BH. DGW contribuiu com algumas das imagens apresentadas, para a otimização dos protocolos e a escrita do manuscrito; Ele foi financiado por um subsídio de escorva da bomba da Universidade de Liverpool. CY é financiado por uma bolsa de pós-graduação de Vanier e CIHR MD/PhD Studentship. Agências de fomento não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Mídia | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM Mídia | Wisent | 319-005-CL | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 mm lamínulas de vidro circular # 1,5 espessura | Microscopia Eletrônica Ciências | 72290-08 | O tamanho e a forma da lamínula não são críticos, mas 18 mm se encaixam nos poços de uma placa padrão de 12 poços que simplifica a cultura de células |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Dissolva em DMSO a 1 mM (solução estoque 1.000x) |
| Anexina V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotina | ThermoFisher | 20217 | Armazene em um dessecador. Não prepare uma solução padrão. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Meio de separação de células linfólitas-poli | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| M-CSF humano recombinante | Peprotech | 200-04 | |
| IL-4 humano recombinante | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 Linha celular de macrófagos | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 Linha celular de monócitos humanos | ATCC | TIB-202 | |
| Jurkat T Linha celular | ATCC | TIB-152 |
Referências
- Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
- Ravichandran, K. S.
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Reimpressões e permissões
