Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vescicole extracellulari (EVs) sono recentemente scoperti componenti sottocellulari che svolgono i ruoli importanti in molti biologico le funzioni di segnalazione durante gli stati fisiologici e patologici. L'isolamento del SVE continua ad essere una grande sfida in questo campo, a causa delle limitazioni intrinseche di ogni tecnica. L'ultracentrifugazione differenziale con metodo di centrifugazione su gradiente di densità è un approccio comunemente utilizzato ed è considerato come la procedura di gold standard per l'isolamento di EV. Tuttavia, questa procedura è che richiede tempo, lavoro ad alta intensità e provoca generalmente bassa scalabilità, che potrebbe non essere adatto per piccoli volumi di campioni come fluido di lavaggio broncoalveolare. Dimostriamo che un metodo di isolamento di centrifugazione di ultrafiltrazione è semplice ed efficiente in tempo e lavoro ancora fornisce un recupero ad alta resa e purezza. Proponiamo che questo metodo di isolamento potrebbe essere un metodo alternativo che è adatto per l'isolamento di EV, specialmente per piccoli volumi di campioni biologici.
Introduzione
Gli esosomi sono il più piccolo sottoinsieme di EVs, 50 – 200 nanometro di diametro ed hanno funzioni biologiche attraverso una gamma diversificata di segnalazione processi1,2,3,4,5. Regolano l'omeostasi cellulare e tissutale soprattutto facilitando la comunicazione intercellulare attraverso molecole di carico quali lipidi, proteine e acidi nucleici6,7,8,9 . Un passo fondamentale ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
L'utilizzazione degli animali e tutte le procedure di animali sono state approvate dai comitati di uso (IACUC) al Cedars-Sinai Medical Center (CSMC) e istituzionali Animal Care.
1. murino lavaggio broncoalveolare fluido (BALF) raccolta e preparazione
- Collezione di BALF
- Eutanasia topi con un cocktail di ketamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) seguita da dislocazione cervicale per via intraperitoneale.
- Inserire un angiocatheter 22 G nella trachea. Collegare una siringa da insulina contenente 1 mL (mL) di soluzione salina tampone di fosfato di Dulbecco sterile ghiacciata (DPBS) e instillare 1 mL di DBPS in entra....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Abbiamo effettuato EV isolamento da mouse BALF utilizzando metodi di isolamento UFC e UC-DGC nello stesso giorno. Il metodo UFC richiesto circa 2,5-3 h, mentre la tecnica di UC-DGC richiesto 8 h tempo di elaborazione. Questo non include buffer e tempo di preparazione del reagente. Dovrebbe essere notato che alcune altre attività potesse essere eseguita durante i periodi lunghi di centrifugazione. Tuttavia, l'intera procedura è durato quasi un giorno intero per la tecnica di isolamento UC-.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Negli ultimi decenni, gli scienziati hanno dipanato i significati del SVE in omeostasi cellulare. Ancora più importante, EVs svolgono un ruolo importante in molti processi di malattia modulando le celle vicine e lontane a loro carico bioattivi molecole1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro è supportato da sovvenzioni NHLBI/NIH HL103868 (a P.C.) e HL137076 (a P.C.), la sovvenzione di associazione cuore americano (a P.C.) e Samuel Oschin completa Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (a P.C.). Vorremmo esprimere il nostro grande apprezzamento per l'Istituto del cuore di Smidt al Cedars-Sinai Medical Center che ci fornisce una macchina Nanosight per EV nanoparticle tracking analysis.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | |||
| Filtri centrifughi Amicon Ultra-15 Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Saccarosio | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Gradiente di densità medio |
| ketamina | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xilazina | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Siringa 1 mL | Siringa BD, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | Siringa BD, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Provette per centrifuga 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Provette per centrifuga 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Saggio delle proteine dell'acido bicinconico (BCA) | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Anticorpo TSG101 anti-topo di coniglio | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Anticorpo PE-CD63 anti-topo di ratto | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| IgG anti-coniglio, anticorpi legati a HRP | Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Agente riducente (Bolt) | |||
| 10x Tampone di lisi (Bolt) | Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus gel di acrilammide | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 mini pile di nitrocellulosa | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Reagente per il rilevamento di anticorpi HRP chemiluminescenti HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Provette per ultracentrifuga 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Provette per ultracentrifuga 38,5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Filtri per Siringhe 0,2 & micro; m pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Amburgo, | Germania-Ultracentrifuge | |
| Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight | |||
| (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK-Per | misurare la distribuzione granulometrica e Citometro | |
| a flusso MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, | Germania-iBlot | |
| Apparecchio di trasferimento | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad | ||
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 |
Riferimenti
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of B....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
