비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Esam S.B. Salem; Kazutoshi Murakami; Toshimasa Takahashi; Elise Bernhard; Vishnupriya Borra; Mridula Bethi; Takahisa Nakamura

doi:10.3791/58323

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방법 논문

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

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DOI:

10.3791/58323

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2018년 10월 23일

Esam S.B. Salem^*¹^,² , Kazutoshi Murakami^*² , Toshimasa Takahashi² , Elise Bernhard² , Vishnupriya Borra² , Mridula Bethi² , Takahisa Nakamura²^,³^,⁴

¹Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, ²Division of Endocrinology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ⁴Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

초록

Hepatocytes 간 parenchymal 세포 고 합성 및 조직의 에너지 항상성에 필수적인 단백질의 분 비를 포함 한 여러 대사 기능을 갖습니다. 기본 hepatocytes murine 간에서 고립 된 간에서 발생 하는 변경 또는 기능 속성을 이해 하는 귀중 한 생물 도구를 구성 합니다. 여기 우리는 2 단계 콜라 관류 기법을 수행 하 여 기본 마우스 hepatocytes의 문화와 격리 하는 방법을 설명 하 고 단백질 대사 조사에 대 한 그들의 사용을 토론. 성인 마우스의 간은 순차적으로 에틸렌 글리콜-두번째 tetraacetic 산 (EGTA)와 콜라, hepatocytes 밀도 그라데이션 버퍼의 다음 끼얹는다. 이러한 격리 hepatocytes 문화 접시에 가능한 고 hepatocytes의 부여 특성의 대부분을 유지 한다. 이러한 hepatocytes 단백질 대사 비 방사성 시 약으로 초기 단백질 합성 등의 평가 대 한 사용할 수 있습니다. 우리는 격리 hepatocytes 쉽게 제어 하 고 구성 하는 단백질 합성 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응을 이용 하 여 에너지 대사에 연결의 높은 품질과 볼륨 안정성을 보여 탐지 방법 그리고 서쪽 더 럽 히 분석입니다. 따라서,이 방법은 간 초기 단백질 합성에 에너지 항상성 연결을 조사 하는 데 유용 합니다. 다음 프로토콜 재료와 높은-품질 기본 마우스 hepatocytes의 격리 및 초기 단백질 합성의 검출을 위한 방법을 설명합니다.

서론

단백질 중요 한 영양 요소 이며 인체의 건조 중량의 약 50%는 여러 생물 학적 특성과 기능¹단백질으로 구성 되어 있습니다. 따라서, 단백질 합성은 대부분 에너지 소모 이벤트 중 하나 이며 단백질 대사에 변경 매우 개발과 관련 된 대사 질환²^,^,³⁴를 포함 하 여 질병의. 총 에너지 소비⁵^,⁶의 약 20-30%는 간 단백질 생 합성을 차지 하 고. 또한, 단백질 기능 뿐만 아니라 수동 또는 빌딩 블록 또한 활성 신호를 중재 요인 하지만 간 침으로 또는 extracellularly⁷조직 물질 대사 조절 한다. 혈 청 알 부 민, 합성 고 간 및 플라즈마⁸에서 가장 풍부한 단백질 분 비의 감소 된 수준 2 형 당뇨병 개발⁹^,¹⁰^, 의 위험을 증가 하는 예를 들어,