Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding

Summary

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen in combinatie met het eerste biest voeden. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van nutriënten insufficiëntie stress in de hersenen zoals gemoduleerd door enterocyte signalering.

Abstract

Het doel van dit protocol is te isoleren van oxytocine-receptor rijke hersenen kernen in de neonatale hersenen vóór en na de eerste biest voeding. De expressie van eiwitten bekend om te reageren op een metabole stress werd gemeten in de hersenen-kernen isolaten gebruikend het westelijke bevlekken. Dit werd gedaan om te beoordelen of metabole stress-geïnduceerde nutriënten insufficiëntie in het lichaam neuronale stress veroorzaakt. Wij hebben eerder aangetoond dat nutriënten insufficiëntie in pasgeborenen metabole stress in de darm lokt. Bovendien, biest oxytocine moduleert cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markeringen in pasgeboren rat gut villi vóór en na de eerste diervoeders. Signalering eiwitten markeringen die is gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress [ER chaperon bindend immunoglobuline-proteïne (BiP), eukaryote vertaling initiatie factor 2A (eIF2a), en eIF2a kinase proteïne kinase R (p-PKR)], evenals twee ontsteking-signalering eiwitten [nucleaire factor-recombination (NF-kB) en remmer recombination (IkB)], werden gemeten in pasgeboren hersenen kernen [kern van de eenzame tractus (NTS) paraventricular nucleus (PVN), supra-optische kern (zoon), cortex (CX), striatum kernen (STR), en mediale preoptic nucleus (MPO)] vóór de eerste feed (unprimed door biest) en na het begin van de verpleegkunde (primer door biest). Uitdrukking van BiP/GRP78 en p-eIF2a waren upregulated in unprimed en werden in primer NTS weefsel. NF-kB werd behouden (hoog) in het cytoplasma CX, STR en MPO overwegende dat NF-kB lager en ongewijzigd in NTS, PVN en zoon in beide voorwaarden was. De collectieve BiP en p-eIF2 bevindingen zijn consistent met een stress-respons. eIf2a was in de zoon, CX, STR en MPO phosphorylated door dsRNA afhankelijk kinase (p-PKR). Echter was in de NTS (en in mindere mate in de PVN), eIf2a phosphorylated door een ander kinase, algemene controle nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mechanismen eerder waargenomen in pasgeboren darm enterocyten lijken te worden weerspiegeld in bepaalde hersengebieden OTR-rijk. De NTS en de PVN kan gebruik maken van een mechanisme van de verschillende fosforylatie (onder voedingsstoffen tekort) vanuit andere gebieden en worden vuurvaste aan de gevolgen van nutriënten insufficiëntie. Collectief, suggereren deze gegevens dat hersenen reacties op nutriënten insufficiëntie stress worden gecompenseerd door signalering van enterocyten biest-primer.

Introduction

In tegenstelling tot ons begrip van de vroege ontwikkeling van de hersenen die zich voordoen in de loop van dagen-naar-weken postpartum, is relatief weinig bekend over de talloze dynamische veranderingen die zich voordoen in de eerste uren van het leven bij ratten. Een belangrijke uitdaging is het kleine formaat van de neonatale rat hersenen en een eis van high-tech hulpmiddelen te isoleren van de afzonderlijke hersengebieden of afzonderlijke cellen. Studies schatten vaak gene transcriptie en niet vertaling^1,2, dat een stevige begrip van functionaliteitsniveaus van geactiveerde signalering moleculen niet geeft....

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik comités op Columbia University en de New York State psychiatrische Institute.

1. de weefsels voorbereiding

1. Getimede zwangere ratten bij de leverancier bestellen.
2. Volg getimede zwangere ratten door het observeren van hun groeiende buikjes in de weken na hun aankomst en vervolgens op zoek naar pups op de verwachte leverdatum door de inspectie van de kooi elke 2 h tot levering begint.
3. Pups met een gehandschoende hand verwijderen door hun staart vóór hun eerste Voer voor unprimed pups (geen witte melk buik is herkenbaar bij het bekijken van ....

Results

De representatieve bands van immunoreactivity ten opzichte van de totale proteïne blijkt dat er hersenen kernen met zeer lage geoogste eiwit. Dit vereist het gebruik van de geautomatiseerde westelijke vlek-techniek, die zeer gevoelige in vergelijking met de canonieke westelijke vlek. Deze aanpak kan worden uitgevoerd met fortyfold minder eiwit per capillair ten opzichte van de per-baan in Western blots.

Differentiele effecten van b.......

Discussion

Een techniek voor microdissection van discrete, OTR-rijke kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen wordt gepresenteerd in deze white paper. Het is goed herkend dat neuronen zijn zeer gespecialiseerd, zelfs binnen goed gekarakteriseerd kernen in de hersenen. Deze zeer reproduceerbaar aanpak te isoleren van de specifieke OTR-rijke kernen stelt gebruikers robuuste hypothese te testen. Met behulp van geautomatiseerde westelijke bevlekken, werden de samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten verder verbe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50