כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד את המוח גרעינים במוח עכברוש neonatal בשיתוף עם האכלה קולוסטרום הראשון. טכניקה זו מאפשרת המחקר של אי ספיקה מזין הלחץ במוח מווסת על ידי enterocyte איתות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת מתח סלולארית, דלקת דיסקרטית מפריש אוקסיטוצין המוח גרעינים בחולדה Neonatal לפני ואחרי האכלה קולוסטרום הראשון
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד אוקסיטוצין-קולטן במוח עשיר גרעינים במוח neonatal לפני ואחרי האכלה קולוסטרום הראשון. הביטוי של חלבונים ידוע להגיב על מתח מטבולית נמדדה בהמוח-גרעינים מבודד באמצעות סופג המערבי. זה נעשה כדי להעריך אם חילוף החומרים מפגינות מזין אי ספיקה בגוף עורר מתח עצביים. בעבר הראו כי אי ספיקה התזונתי ב neonates מעורר מתח מטבולית בבטן. יתר על כן, אוקסיטוצין קולוסטרום ממיקרו סמני תגובת דלקת, autophagy מתח סלולארית villi בטן עכברוש היילוד לפני ואחרי ההזנה הראשונה. איתות סמני חלבונים הקשורים עם הלחץ רשתית תוך-פלזמית [אר המלווה מחייב בנוגדנים חלבון (ביפ), תרגום האיקריוטים חניכה גורם 2A (eIF2a), ו eIF2a קינאז קינאז R (p-PKR)], כמו גם שני דלקת איתות חלבונים [הפקטור הגרעיני-κB (NF-kB) ולא מעכב κB (IkB)], נמדדו ב גרעינים במוח היילוד [גרעין של דרכי בודד (NTS), הגרעין paraventricular (PVN), הגרעין העל-אופטיים (הבן), קליפת המוח (CX), גרעינים סטריאטום (STR), ו גרעין preoptic המדיאלי (MPO)] לפני השידור הראשון (unprimed על ידי קולוסטרום) ואחרי תחילת ההנקה (טענתי על ידי קולוסטרום). ביטוי של ביפ/GRP78 ו- p-eIF2a היו upregulated ב unprimed downregulated ברקמות NTS כאשר הבחינה. NF-kB נשמר (גבוהה) CX, STR ו- MPO הציטופלסמה, ואילו NF-kB היה נמוך ב- NTS, PVN, והבן לא השתנה בתוך שני התנאים. ביפ קולקטיבית של p-eIF2 ממצאים עקביים עם תגובת הלחץ. eIf2a היה phosphorylated על ידי dsRNA קינאז תלוי (p-PKR) הבן, CX, STR ו MPO. עם זאת, את NTS (ולא פחותה ב- PVN), eIf2a היה phosphorylated על ידי אחר קינאז, בקרה כלליים nonderepressible-2 קינאז (GCN2). מנגנוני הכוח ויסות מתח שנצפתה בעבר בטן היילוד enterocytes מופיעים כדי לבצע שיקוף של אזורים מסוימים במוח OTR-עשיר. NTS PVN עשויה לנצל את מנגנון זירחון שונים (תחת מחסור תזונתי) מאזורים אחרים, להיות עקשן ההשפעה של מחסור של מזון. באופן קולקטיבי, נתונים אלה עולה כי המוח תגובות סטרס אי-ספיקת מסתם מזין יוסטו על-ידי איתות מן קולוסטרום-איפה זה מונח enterocytes.
מבוא
בניגוד ההבנה שלנו של התפתחות המוח מוקדם המתרחשים במהלך ימים לשבועות לאחר לידה, יחסית מעט מאוד ידוע על עצום של שינויים דינמיים המתרחשים השעות הראשונות של החיים אצל חולדות. אתגר מפתח כבר גודל קטן של המוח עכברוש neonatal, דרישה עבור ההיי-טק כלים לבודד אזורים במוח דיסקרטית או תאים בודדים. מחקרים להעריך לעיתים קרובות ג'ין תמלול ותרגום לא1,2, אשר לא נותן הבנה מוצקה של רמות פונקציונלי של מולקולות איתות מופעל. אחרים לבחון את הביטוי תוך שימוש אימונוהיסטוכימיה לאזורים במוח הפניה, אשר אינה מאפשרת כימות של רמות הביטוי3. אף מחקר לתאריך בחן את הפעלת איתות מסלולים הקשורים קולוסטרום הראשון של חולדות לה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות באוניברסיטת קולומביה, מכון פסיכיאטרי של מדינת ניו יורק.
1. רקמות הכנה
- סדר חולדות הרות מתוזמן מן הספק.
- בצע מתוזמן חולדות בהריון על ידי התבוננות שלהם הבטן הגדלה השבועות לאחר הגעתם, לאחר מכן מחפש הגורים על תאריך המסירה הצפוי באמצעות בדיקת הכלוב כל שעתיים עד הלידה מתחילה.
- להסיר את הגורים עם יד בכפפה על ידי הזנב שלהם לפני המזון הראשון עבור הגורים unprimed (אין בטן חלב לבן הוא לכאורה בעת הצגת הבטן) או לאחר ההזנה הראשונה עבור הגורים כאשר הבחינה (ובשלב בטן לבנה יהיה גלוי על הבטן שלהם) כפי שמתואר את timeli ne (איור S1).
הערה: ההזנה קולוסטרום ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הלהקות נציג של immunoreactivity ביחס חלבון הכולל להראות כי קיימים גרעינים במוח עם חלבון שנקטפו נמוך מאוד. פעולה זו דורשת שימוש הטכניקה תספיג אוטומטיות, אשר היא רגישה מאוד בהשוואה את תספיג הקנוני. גישה זו ניתן להפעיל עם פחות fortyfold חלבון לכל נימי בהשוואה לכל-השביל בין שהכלים המערבי.
השפעות דיפרנציאלית לראשוניות קולוסטרום על רמות ביפ גרעינים במוח
הילתית חלקים של המוח עכב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקה עבור microdissection של בדידה, OTR-עשיר המוח גרעינים במוח neonatal העכברוש מוצג בעיתון הזה. הוא מוכר היטב כי הנוירונים הם מאוד מיוחדים, אפילו בתוך הגרעינים מאופיין היטב במוח. זו גישה מאוד לשחזור לבודד את הגרעינים OTR-עשיר מסוים מאפשרת בדיקת השערות חזקים. באמצעות סופג המערבי אוטומטיות, העקביות והעבודה הפארמצבטית של התוצאות היו עוד יותר משופר. בעוד הגבלה של טכניקה זו נשאר השתנות ניקוב המוח צנוע; טכניקה זו מייצגת מקדמה מעל תא בודד, כל המוח או המוח פרוסה גישות. גישות תא בודד הם מורכב על-ידי מתן יריות הצמד מוגבלת מאוד........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים תודה מאנון הפקחים אלכסנדרה שולץ לסיוע שלהם בהכנת פרוטוקול זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת ברדפורד | ראד | ||
| חלבון ערכת ליזה | חלבון פשוט | CBS403 | Bicine / CHAPS |
| ערכות WES | חלבון פשוט | WES-Mouse 12-230 ערכת מאסטר (PS-MK15), ערכת מאסטר WES-Rabbit 12-230 (PS-MK14), WES 12-230 kDa סה"כ ערכת מאסטר חלבון (PS-TP07) | |
| אנטי עכבר IgG HRP מצומד | חלבון ארנב פשוט | ||
| טכנולוגיית איתות תאים נגד פוספו-eIF2a | SER51, 9721 | ||
| עכבר mAb אנטי-PKR | טכנולוגיית איתות תאים | 2103 | |
| ארנב אנטי-פוספו-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| ארנב mAb אנטי-PKR | טכנולוגיית איתות תאים | 12297 | |
| ארנב mAb אנטי-GAPDH | טכנולוגיית איתות תאים | 2118 | |
| עכבר mAb אנטי-פוספו-IKB | טכנולוגיית איתות תאים | 9246 | |
| עכבר mAb אנטי-IKB | טכנולוגיית איתות תאים | 4814 | |
| ארנב אנטי-BiP | טכנולוגיית איתות תאים | 3183 | |
| ארנב אנטי GCN2 | טכנולוגיית איתות תאים | 3302 | |
| ארנב mAb אנטי-פוספו-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| בהריון חולדות Sprague-Dawley מעבדות | צ'ארלס ריבר | ||
| מכשיר אגרוף | WellTech Rapid Core או Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
מקורות
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
