Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei del cervello nel cervello del ratto neonatale in concomitanza con la prima alimentazione colostro. Questa tecnica permette lo studio dello stress nutritivo insufficienza nel cervello come modulata dalla segnalazione del enterocyte.
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Articolo metodologico
Valutazione Stress cellulare e l'infiammazione nei Nuclei di cervello che secerne l'ossitocina discreti nel ratto neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare i nuclei del cervello ricco di ossitocina-recettore nel cervello neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro. L'espressione di proteine note per rispondere agli stress metabolico è stato misurato in cervello-nuclei isolati mediante Western blotting. Questo è stato fatto per valutare se insufficienza metabolica indotta da stress in nutrienti nel corpo innescato lo stress di un neurone. Precedentemente abbiamo dimostrato che l'insufficienza dei nutrienti in neonati suscita lo sforzo metabolico nell'intestino. Inoltre, l'ossitocina colostro modula indicatori di risposta, l'infiammazione e l'autofagia stress cellulare nei villi dell'intestino di ratto neonato prima e dopo la prima poppata. Indicatori di proteina connessi con lo stress del reticolo endoplasmatico di segnalazione [ER chaperone immunoglobulina proteina (BiP), traduzione negli eucarioti iniziazione fattore 2A (eIF2a) ed eIF2a chinasi della chinasi di proteina R (p-PKR)], così come due infiammazione-segnalazione proteine [fattore nucleare-KB (NF-kB) e inibitore κB (IkB)], sono stati misurati nei nuclei del cervello neonato [nucleo del tratto solitario (NTS), nucleo paraventricolare (PVN), nucleo supra-ottica (figlio), corteccia (CX), nuclei del corpo striato (STR), e nucleo mediale preottica (MPO)] prima del primo feed (disinnestato da colostro) e dopo l'inizio della professione infermieristica (innescato da colostro). Espressione di BiP/GRP78 e p-eIF2a erano sovraregolati in unprimed e downregulated nel tessuto NTS innescato. NF-kB è stata mantenuta (alta) nel citoplasma CX, STR e MPO, considerando che NF-kB era più bassa e identicamente in NTS, PVN ed il figlio in entrambe le condizioni. Il collettivo BiP e p-eIF2 risultati sono coerenti con una risposta allo stress. eIf2a è stato fosforilati da chinasi dsRNA (p-PKR) nel figlio, CX, STR e MPO. Tuttavia, in NTS (e in misura minore nel PVN), eIf2a è stato fosforilato da un'altra chinasi, chinasi di nonderepressible-2 controllo generale (GCN2). I meccanismi di stress-modulanti precedentemente osservati negli enterociti neonato intestino sembrano riflettersi in alcune regioni del cervello di OTR-ricco. La NTS e PVN può utilizzare un meccanismo di fosforilazione differenti (sotto sottoalimentazione) da altre regioni ed essere refrattario all'impatto dell'insufficienza dei nutrienti. Collettivamente, questi dati suggeriscono che le risposte del cervello allo stress nutritivo insufficienza sono compensate da segnalazione da colostro-innescato enterociti.
Introduzione
In contrasto con la nostra comprensione dello sviluppo iniziale del cervello che si verificano nel corso dei giorni a settimane dopo il parto, relativamente piccolo è conosciuto circa la miriade di cambiamenti dinamici che si verificano nelle prime ore di vita in ratti. Delle sfide principali è stata la piccola dimensione del cervello del ratto neonatale e un requisito per strumenti ad alta tecnologia isolare regioni discrete del cervello o singole cellule. Studi valutano spesso gene trascrizione e traduzione di non1,2, che non dà una solida comprensione dei livelli funzionali di molecole di segnalazione attiv....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dalle commissioni di utilizzo alla Columbia University e l'istituto psichiatrico dello stato di New York e istituzionali Animal Care.
1. tessuto preparazione
- Ordine di ratte gravide temporizzate dal fornitore.
- Seguire ratti incinti temporizzati osservando loro addomi crescente nelle settimane dopo il loro arrivo e successivamente cercando cuccioli alla data di consegna prevista controllando la gabbia ogni 2 h fino a consegna inizia.
- Rimuovere cuccioli con una mano guantata di loro coda prima di loro primo feed per disinneschi cuccioli (no pancia bianco latte è apparente durante l....
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Risultati
Le bande rappresentative di immunoreactivity relativa proteina totale mostrano che ci sono nuclei di cervello con raccolto molto povera in proteine. Questo richiede l'utilizzo della tecnica automatizzata Western blot, che è altamente sensibile rispetto al canonico Western blot. Questo approccio può essere eseguito con fortyfold meno proteine per capillare rispetto a-corsia in Western blot.
Effetti differenziali di priming di colost.......
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Discussione
Una tecnica per microdissezione di discreti, nuclei del cervello di OTR-ricchi nel cervello del ratto neonatale è presentata in questa carta. È riconosciuto bene che i neuroni sono altamente specializzati, anche all'interno dei nuclei ben caratterizzati nel cervello. Questo approccio altamente riproducibile per isolare specifici nuclei di OTR-ricchi permette test di ipotesi robusto. Mediante Western blotting automatizzato, la coerenza e la riproducibilità dei risultati sono stati ulteriormente migliorate. Mentre una limi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Manon Ranger e Alexandra Schulz per la loro assistenza nella preparazione di questo protocollo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione Bradford | Bio Rad | ||
| lisi delle proteine | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES Kit per | proteine semplici | WES-Mouse 12-230 (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07) | |
| Proteina semplice | anti-topo IgG HRP | ||
| anti-fosfo-eIF2a | Tecnologia di segnalazione cellulare | SER51, 9721 | |
| mAb di topo anti-PKR | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2103 | |
| Coniglio anti-fosfo-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| Coniglio mAb anti-PKR | Tecnologia di segnalazione cellulare | 12297 | |
| mAb di coniglio anti-GAPDH | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2118 | |
| mAb di topo anti-fosfo-IKB | Tecnologia di segnalazione cellulare | 9246 | |
| mAb di topo anti-IKB | di segnalazione cellulare | 4814 | |
| Coniglio anti-BiP | Tecnologia di segnalazione cellulare | 3183 | |
| Coniglio anti GCN2 | Tecnologia di segnalazione cellulare | 3302 | |
| Coniglio anti-fosfo-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| incinta Ratti Sprague-Dawley | Charles River Laboratories | ||
| Punzone | WellTech Rapid Core o Harris Uni-Core | 0,35, 0,50, 0,75, 1,0, 1,20, 1,50 |
Riferimenti
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al.
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Ristampe e permessi
