Здесь мы представляем протокол изолировать ядер головного мозга в мозге новорожденных крыс в сочетании с первого кормления молозивом. Эта техника позволяет исследование питательной недостаточности стресса в головном мозге, модулированные энтероцитах сигнализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка клеточного стресса и воспаления в дискретных окситоцина секретирующих ядрах головного мозга новорожденных крыс до и после первого кормления молозивом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цель настоящего Протокола заключается в изоляции окситоцина рецепторов ядер богатые мозга в мозге новорожденных до и после первого кормления молозивом. Экспрессию белков, известно реагировать метаболического стресса была измерена в мозг ядер изолятов, используя Западный blotting. Это было сделано для оценки ли метаболический стресс индуцированного питательной недостаточности в организме срабатывает нейрональных стресс. Ранее мы показали, что питательной недостаточности у новорожденных вызывает метаболический стресс в кишечнике. Кроме того молозиво окситоцин модулирует клеточного стресса ответ, воспаления и autophagy маркеров в кишечнике Вилли новорожденных крыс до и после первого канала. Сигнализации белковых маркеров, связанные со стрессом эндоплазматического ретикулума [ER сопровождающий иммуноглобулина белок (BiP), 2а фактор инициации эукариотических перевод (eIF2a) и eIF2a киназы протеина R (p-PKR)], а также два воспаление сигнализации белков [ядерный фактор κB (NF-kB) и ингибитор κB (IkB)], были измерены в ядрах головного мозга новорожденного [ядро одиночного тракта (НТС), паравентрикулярного ядра (ПВН), выше оптические ядро (сын), коры (CX), стриатума ядер (STR), и медиальный preoptic ядро (МПО)] до первого канала (безгрунтовых, молозиво) и после начала кормления (грунтовать молозиво). Выражение BiP/GRP78 и p-eIF2a были upregulated в безгрунтовых и downregulated в загрунтовать НТС ткани. NF-kB сохраняется (высокий) в цитоплазме CX, STR и MPO, тогда как NF-kB был ниже и неизменным в НТС, PVN и сын в обоих условий. Коллективные Бип и p-eIF2 выводы согласуются с реакции на стресс. eIf2a был фосфорилированных dsRNA зависимые киназы (p-PKR) в сына, CX, STR и MPO. Однако в НТС (и в меньшей степени в ПВН), eIf2a был фосфорилированных на другой киназы, общего управления nonderepressible-2 киназы (GCN2). Стресс модулирующих механизмов, ранее наблюдали в кишечник новорожденного enterocytes, по-видимому, отражаться в некоторых регионах мозга OTR-богатые люди. НТС и ПВН могут использовать разные фосфорилирование механизм (под дефицит питательных веществ) из других регионов и огнеупорных воздействия питательной недостаточности. Вместе эти данные свидетельствует о том, что ответы мозга на стресс питательной недостаточности компенсируются сигнализации от молозиво загрунтовать enterocytes.
Введение
В отличие от нашего понимания раннего развития мозга, происходят в течение дней до недели после родов, относительно мало известно о множества динамических изменений, происходящих в первые часы жизни крыс. Ключевой задачей был небольшой размер мозга новорожденных крыс и требование для высокотехнологичных инструментов изолировать дискретные мозга или одиночных клеток. Исследования часто оценки гена транскрипции и трансляции не1,2, который не дает твердое понимание функциональных уровней активированного сигнальных молекул. Другие рассмотреть выражение с использованием иммуногистохимия регионов мозга ссылку, котор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование был одобрен институциональный уход животных и использование комитетами в Колумбийском университете и в Нью-Йорке психиатрических государственный институт.
1. Подготовка тканей
- Приказ приурочен беременных крыс от поставщика.
- Следуйте приурочен беременных крыс путем наблюдения за их животы растущую в недели после их прибытия и впоследствии ищите щенков на ожидаемой даты поставки, проверив клетке каждые 2 ч до начала поставки.
- Удалить щенков с перчатке их хвост до их первого канала для безгрунтовых щенков (не живот белый молоко проявляется при просмотре живота) или после первого корм для загрунтов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представитель полос иммунореактивности относительно общего белка показывают, что мозг ядер с очень низким заготовленной белка. Это требует использования автоматизированных иммуноблоттинга техника, которая очень чувствительна по сравнению с канонической западную помарку. Этот подход может работать с fortyfold меньше белка на капиллярные, по сравнению с за Лейн в западной помарки.
Дифференциального воздействия молозиво грунтовки на B.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Техника для microdissection дискретного, OTR-богатые ядер головного мозга в мозге новорожденных крыс представлена в настоящем документе. Общепризнано, что нейроны являются узкоспециализированными, даже в хорошо изученных ядер в головном мозге. Этот высоко воспроизводимый подход к изоляции определенных OTR-богатые ядер позволяет тестирование надежный гипотезы. Использование автоматизированных Западный blotting, были улучшить согласованность и воспроизводимость результатов. Ограничением этой методики остается скромным мозг.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы благодарят Manon Рейнджер и Александра Шульц за их помощь в подготовке настоящего Протокола.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Bradford solution | Bio Rad | ||
| Набор для лизиса белка | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES kit Protein | simple | WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07) | |
| антимышиный конъюгат IgG HRP Protein | simple | ||
| Rabbit антифосфо-eIF2a | Клеточная сигнальная технология | SER51, 9721 | |
| мышиный mAb анти-PKR | Клеточная сигнализация | технология 2103 | |
| кролик антифосфо-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| кролик mAb анти-PKR | клеточная сигнализация | технология 12297 | |
| кролик mAb анти-GAPDH | клеточная сигнализация | 2118 | |
| мышиный mAb антифосфо-IKB | Клеточная сигнальная технология | 9246 | |
| мышиный mAb анти-IKB | клеточная сигнальная технология | 4814 | |
| кролик анти-BiP | клеточная сигнальная технология | 3183 | |
| кролик анти-GCN2 | клеточная сигнальная технология | 3302 | |
| кролик mAb антифосфо-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| беременный Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | ||
| Punch device | WellTech Rapid Core или Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
Ссылки
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
