Summary
Hier presenteren we een protocol voor de synthese en de karakterisering van nanodeeltjes (nanoceria) oxide cerium voor ROS (reactieve zuurstof soorten) opruiming in vivo, nanoceria in plantaardige weefsels door confocale microscopie en in vivo imaging monitoring van nanoceria ROS opruiming door confocale microscopie.
Abstract
Accumulatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een kenmerk van de plant abiotische stress-respons. ROS spelen een dubbelrol in planten door op te treden als signalering moleculen op een laag niveau en schadelijke moleculen op een hoog niveau. Accumulatie van ROS in gespannen planten kan beschadigen metabolieten, enzymen, lipiden en DNA, waardoor een vermindering van de plantengroei en rendement. Het vermogen van cerium oxide nanodeeltjes (nanoceria) om catalytically opruimen ROS in vivo biedt een uniek instrument te begrijpen en bioengineer plant abiotische stress tolerantie. Hier presenteren we een protocol om te synthetiseren en karakteriseren van poly (acryl) zure gecoate nanoceria (PNC) interface van de nanodeeltjes met planten via blad lamina infiltratie en controleren van hun distributie en ROS opruiming in vivo met behulp van de confocal microscopie. Huidige moleculaire tools voor het manipuleren van ROS accumulatie in planten zijn beperkt tot model soorten en moeizame transformatie methoden vereisen. Dit protocol voor in vivo opruiming ROS heeft het potentieel om te worden toegepast op wild type planten met brede bladeren en blad structuur zoals Arabidopsis thaliana.
Introduction
Cerium oxide nanodeeltjes (nanoceria) worden veel gebruikt in levende organismen, van fundamenteel onderzoek naar bioengineering, als gevolg van hun verschillende katalytische reactieve zuurstof soorten (ROS) opruiming vermogen1,2,3. Nanoceria hebben ROS opruiming capaciteiten als gevolg van een groot aantal oppervlakte zuurstof vacatures die afwisselend twee oxidatie Staten (Ce3 + en CE-4 +) 4,5,6. ROS opruimen de Ce3 + bungelende obligaties effectief terwijl de lattice stammen op nanoschaal bevorderen het herstel van deze defect sites via redox reacties7fietsen. Nanoceria zijn ook recent gebruikt voor het bestuderen van engineering-en pootgoed en functie8,9. Planten onder abiotische stress Ervaar accumulatie van ROS, oxidatieve schade aan lipiden, eiwitten en DNA10. In A. thaliana planten leidt nanoceria katalytische opruiming van ROS in vivo tot verbeterde plant fotosynthese onder hoge licht, warmte en koelen benadrukt8. Toepassing nanoceria bodememissies ook verhogingen schieten biomassa en graan opbrengst van tarwe (Triticum aestivum)11; koolzaad (Brassica napus) planten behandeld met nanoceria hebben hogere plantaardige biomassa onder zout stress12.
Nanoceria bieden bioengineers en planten biologen een nanotechnologie gebaseerde hulpprogramma abiotische stress reacties te begrijpen en te verbeteren plant abiotische stress tolerantie. Nanoceria de in vivo ROS opruiming mogelijkheden zijn onafhankelijk van plantensoorten, en de facile levering in plantaardige weefsels heeft het potentieel om de brede toepassing buiten modelorganismen inschakelen. In tegenstelling tot andere genetisch gebaseerde methoden, nanoceria vereisen geen krommen van de plant met de overexpressie van antioxidant enzymen voor hogere ROS opruiming vermogen13. Blad lamina infiltratie van nanoceria aan planten is een praktische benadering voor lab gebaseerde onderzoek.
Het algemene doel van dit protocol is voor het beschrijven van 1) de synthese en karakterisering van negatief geladen poly (acryl) zure nanoceria (PNC), 2) de levering en tracking van PNC hele blad cellen, en 3) de bewaking van de PNC ingeschakelde ROS opruiming in vivo. In dit protocol zijn negatief geladen poly (acryl) zure nanoceria (PNC) gesynthetiseerd en gekenmerkt door hun absorptiespectrum, hydrodynamische diameter en zeta potentiële. Beschrijven we een eenvoudige blad lamina infiltratie methode om te leveren PNC in plant blad weefsels. Voor in vivo imaging van nanoparticle distributie binnen mesophyl cellen, was een fluorescente kleurstof (DiI) gewend label PNC (DiI-PNC) en observeren van de nanodeeltjes via confocal fluorescentie microscopie. Tot slot, we uitleggen hoe om te controleren in vivo PNC ROS opruiming via confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het kweken van A. thaliana planten
- A. thaliana zaaien in 5 x 5 cm wegwerp potten gevuld met standaard bodem mix. 32 deze potten gestoken met een kunststof tray gevuld met water (~ 0.5 cm diepte) en breng het kunststof dienblad met de planten in een plant groei kamer.
- De groei kamer instellingen als volgt ingesteld: 200 µmol/ms fotosynthetische actieve straling (PAR), 24 ± 1 ° C dag en 21 ± 1 ° C nacht 60% vochtigheid en 14/10 h dag/nacht licht regime, respectievelijk.
- Dun elke pot te laten slechts één individuele plant na een week van kiemkracht. Let op dat de zaailingen met vergelijkbare grootte in elke pot.
- De potten water door gieten tap water rechtstreeks op de kunststof dienblad eenmaal per twee dagen. Groeien de planten voor vier weken. A. thaliana planten zijn klaar voor verder gebruik.
2. synthese en karakterisering van de PNC
- Weeg 1,08 g van cerium (III) nitraat en los het op in 2,5 mL van moleculaire biologie rang water in een conische tube van 50 mL.
- Weeg 4.5 g van poly (acryl) zuur en los het op in 5 mL van moleculaire biologie rang water in een conische tube van 50 mL.
- Vermeng deze twee oplossingen grondig van 2.000 toeren per minuut gedurende 15 minuten met behulp van een digitale vortex-mixer.
- 15 mL ammoniumhydroxide-oplossing (7,2 M) overbrengen in een bekerglas van 50 mL glas.
- Al roerend bij 500 omwentelingen per minuut, voeg het mengsel van stap 2.3 ontkleuring aan de ammoniumhydroxide-oplossing en roer bij 500 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur gedurende 24 uur in een zuurkast.
- Dek het bekerglas af met een stuk papier om te voorkomen dat het aanzienlijke verlies van oplossing tijdens de nachtelijke reactie.
- Na 24u, breng de resulterende oplossing over in een conische tube van 50 mL en Centrifugeer het bij 3900 x g gedurende 1 h om elke mogelijke puin en grote agglomeraat te verwijderen.
- Breng deze 22.5 mL van de bovenstaande oplossing in drie 15 mL 10 kDa filters en vul de rest van het filter met moleculaire rang water om een totale verdunning van 45 mL.
- Zuiveren het supernatant oplossing uit de gratis polymeren en andere reagentia met een benchtop centrifuge door toevoeging van de bovendrijvende substantie aan een 15 mL 10 kDa filter en centrifugeer bij 3900 x g gedurende 15 min. Herhaal deze stap minstens zes maal.
- Meet de extinctie van de elutievloeistof in elke cyclus met een spectrofotometer UV-VIS van 220-700 nm om ervoor te zorgen geen gratis polymeren en andere reagentia zijn aanwezig in de eindoplossing PNC.
- De verzamelde PNC oplossing rekening met de spuit 5 mL en filtreer het tegen een 20 nm porie grootte spuit filter. Het verzamelen van de gefilterde PNC-oplossing in een conische tube van 50 mL.
- Neem een verdunde definitieve PNC-oplossing in een kunststof cuvette en meet de extinctie met de UV-VIS spectrofotometer van 220-700 nm. PNC extinctie piek is op 271 nm.
- Bereken de concentratie met behulp van de wet van Beer-Lambert: A = εCL. A de extinctie van de piekwaarde voor een monster, ɛ is de molaire d'absorption acoustique van PNC (cm-1 M-1), L is de optische weglengte (cuvette, 1 cm breed bij deze methode), en C de molaire concentratie van gemeten nanodeeltjes.
- Meet de diameter van de hydrodynamische en zeta potentieel van de gesynthetiseerde PNC met behulp van een deeltje grootte en zeta potentiële analyzer (Figuur 1).
- De uiteindelijke PNC-oplossing in een koelkast (4 ° C) bewaren tot verder gebruik.
Opmerking: Raadpleeg Wu et al.. 8 voor meer gegevens over de karakterisering van de PNC-protocol.
3. het labelen van PNC met DiI fluorescente kleurstof
- Meng 0.4 mL 5 mM (58 mg/liter) PNC met 3,6 mL van de moleculaire biologie rang water in een flesje van 20 mL glas en roer bij 500 omwentelingen per minuut.
- Toevoegen van 24 µL 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine natriumperchloraat kleurstof-oplossing (DiI, 2,5 mg/mL; verdund in DMSO) in 176 µL van DMSO (dimethylsulfoxide) om de oplossing van de kleurstof DiI te maken.
- Voeg de kleurstof DiI ontkleuring aan de oplossing van de PNC, roeren bij 1000 t/min voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Breng dit resulterende mengsel in een 15 mL 10 kDa filter en vul de buis naar de top met moleculaire biologie rang water om de totale verdunde 15 mL.
- Zuiveren de DiI PNC (DiI-PNC)-oplossing van DMSO en elke mogelijke gratis DiI kleurstof het label van een benchtop centrifugeren met de 15 mL 10 kDa filter op 3900 x g gedurende 5 minuten.
- Herhaal stap 3.5 minstens vijf keer.
- Filtreer de definitieve DiI-PNC-oplossingen door een filter grootte-spuit voor 20 nm porie.
- Meet de extinctie van definitieve DiI-PNC door UV-VIS spectrofotometrie en bereken de concentratie volgens de wet van Beer-Lambert de (Figuur 2). Zie stap 2.13 voor meer details.
- Opslaan in een koelkast bij 4 ° C voor verder gebruik.
4. de infiltratie van de Plant laat met PNC
- Voeg 0,1 mL infiltratie slaan (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, aangepast door de lijst met compatibele hardware) in 0,9 mL 0,5 mM PNC of DiI-PNC oplossing en vortex. Gebruik een oplossing van 10 mM TES infiltratie buffer als een negatieve controle.
- 0,2 mL van de PNC of DiI-PNC infiltratie oplossing overbrengen in een steriele naaldloze spuit van 1 mL. Tik op om alle mogelijke luchtbellen te verwijderen.
- De plant uit de groei kamer net voor infiltratie met nanodeeltjes te vermijden mogelijk stoma sluiting onder kamer lichtomstandigheden ophalen.
- Meten voor infiltratie, de inhoud van de chlorofyl van A. thaliana bladeren met vergelijkbare grootte met behulp van een chlorofyl-meter. Meten van elk blad met drie wordt gerepliceerd (elke repliceren bestaande uit ten minste drie metingen)14. Kies dat de A. thaliana verlaat met vergelijkbare chlorofyl inhoud voor de infiltratie-experiment.
- De bladeren langzaam met de onlangs bereid PNC of DiI-PNC oplossing infiltreren door zachtjes op het puntje van de naaldloze spuit tegen de onderkant van het blad lamina (abaxial kant) te drukken en drukt de zuiger (Figuur 3A).
- Voorzichtig vegen de overtollige oplossing die op het oppervlak van blad lamina (Figuur 3B blijft) met behulp van een delicate taak wisser (Figuur 3C) en label van de plant. Gebruik nieuwe delicate taak doekjes voor elke groep van bladeren.
- Houd de geïnfiltreerde A. thaliana op de Bank voor de aanpassing van het blad en incubatie met PNC of DiI-PNC gedurende 3 uur planten.
Opmerking: Geïnfiltreerde A. thaliana planten zijn dan klaar voor verder gebruik (Figuur 3D).
5. bereiding van de monsters van de Leaf confocale microscopie
- Roll een erwt-grootte hoeveelheid observatie gel om over een straal van 1 cm (Figuur 4A) en vervolgens verspreid het totdat het is 1 mm dun op een glasplaatje (Figuur 4B).
- Gebruik een kurk borer (diameter 0,3 cm) te knippen uit een circulaire sectie in het midden van de gel van de waarneming op het glasplaatje (Figuur 4C).
- Vul de snede goed geheel met perfluorodecalin (PFD) voor dieper en beter confocal imaging resolutie in blad weefsels.
- Gebruik een kurk borer (diameter 0.2 cm) voor het verzamelen van blad schijven uit de aangepast DiI-PNC geïnfiltreerd A. thaliana planten (Figuur 4D).
- Monteren van de blad-disc in de PFD gevuld onder ogen zien de geïnfiltreerde (abaxial) kant van het blad.
- Zet een vierkante dekglaasje aan op de top van de blad-schijf en zachtjes druk op op de dia dekglaasje aan gelijkmatig te zegel met de waterput van observatie gel geen luchtbellen blijven gevangen (Figuur 4E).
6. imaging DiI-PNC in blad weefsels door confocale microscopie
- Gebruik een 40 X-objectief in een omgekeerde laser confocal microscoop scannen.
- Drop twee tot drie druppels van ddH2O op de bovenkant van de 40 X-objectief.
- Plaats de voorbereide DiI-PNC geïnfiltreerd blad voorbeelddia bovenop de omgekeerde 40 X objectieve lens.
- Zorg ervoor dat het dekglaasje aan kant, maar niet het glas schuif contact rechtstreeks met de ddH2O op de lens.
- Een gebied van belang in de steekproef onder de microscoop met laserlicht of helder veld vinden.
- Start de Microscoop software en inschakelen van de laser van Argon (vastgesteld op 20%).
- Stel het gaatje voor het verzamelen van minder dan 2 µm en een lijn-gemiddelde van 4 een optische segment.
- Afbeelding van het monster met de instellingen van de confocal microscoop: 514 nm laser excitatie (30%); Z-Stack sectie dikte: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (voor DiI-PNC imaging); PMT2: 700-800 nm (voor de weergave van de chloroplast).
- Representatieve confocal beelden van blad monsters nemen van verschillende individuen, een minimum van drie biologische repliceert.
7. beeldvorming PNC in vivo ROS opruiming door confocale microscopie
- Bereiden 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein-DIACETAAT (H2van DCFDA, een kleurstof voor het aanduiden van een algemene ROS) en 10 µM dihydroethidium (DHE, een kleurstof voor het aanduiden van superoxide anion) kleurstoffen in TES infiltratie buffer (pH 7.5) in 1,5 mL microcentrifuge buizen, afzonderlijk.
- Gebruik een kurk borer (diameter 0.2 cm) voor het verzamelen van blad schijven uit de aangepast PNC geïnfiltreerd A. thaliana planten.
- Gebruik het scherpe uiteinde van de verlostang om drie of vier gaten op de blad-schijven te versnellen kleurstof proces van het laden.
- Overdracht het blad schijven microcentrifuge buizen met H2DCFDA en DHE afzonderlijk en incubeer gedurende 30 min onder duisternis.
- Na incubatie, spoel het blad met ddH2O driemaal schijven en mount het in het glas dia met observatie gel (Zie Protocol sectie 5).
- Zet de dia op de confocal microscoop en handmatig scherpstellen op een gebied van blad mesophyl cellen. Zie Protocol afdeling 6 voor meer informatie.
- Blootstellen van de blad-schijven met de UV-A (405 nm) laser voor 3 min wilt genereren ROS en vastleggen van de wijziging van de intensiteit van het signaal van ROS in tijd-serie ("xyt") per blad schijf.
- Afbeelding van de schijf blad met instellingen van de confocal microscoop: 40 X water doelstelling; 496 nm laser excitatie; PMT1: 500-600 nm (voor DHE en DCFDA kleurstof detectie); PMT2: 700-800 nm (voor chloroplasten detectie). Gebruik een plant geïnfiltreerd met alleen infiltratie bufferoplossing als de negatieve controle.
8. PNC opruiming van H2O2in vitro
- Gedrag van de kat (katalase) mimetische activiteit van de gesynthetiseerde PNC in vitro door het volgen van de methoden in eerdere publicaties3,-8,15
- Toevoegen van 45,4 µL van 1 x TES infiltratie buffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, aangepast door HCl), PNC (60 nM, 3 µL), en H2O2 (2 µM, 1 µL) in een goed (witte ronde 96 goed bodemplaat), en meng dit voorzichtig door het pipetteren.
- Voeg 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (werken concentratie 100 µM, 0,5 µL) en mierikswortelperoxidase (HRP; werken concentratie 0.2 U/mL, 0.1 µL) in de put, zachtjes Meng het door pipetteren en Incubeer het gedurende 30 min. 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reageert met H2O2 en wordt omgezet in resorufin in aanwezigheid van HRP.
- Wikkel de plaat met aluminiumfolie om te voorkomen dat licht tijdens de incubatie.
- Het voorbereiden van een negatieve controle met behulp van reactie buffer of water ter vervanging van de H2O2.
- Met uitzondering van de stockoplossing, alle andere oplossingen bij kamertemperatuur te bereiden.
- Na de incubatie, met een afleesapparaat, controleren de absorptie bij 560 nm resorufin gebruiken voor het aanduiden van het niveau van de H2O2. Tijdinstelling regime op 0, 2, 5, 10, 20 en 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PNC synthese en karakterisering .
PNC werden gesynthetiseerd, gezuiverd en gekenmerkt volgens de methode in punt 2 van Protocol beschreven. Figuur 1 A toont de verkleuring van de oplossingen van cerium nitraat, PAA, het mengsel van cerium nitraat en PAA en PNC. Een kleurverandering van wit tot licht geel wordt gezien nadat PNC is gesynthetiseerd. Na zuivering met een 10 kDa filter, PNC werden gekenmerkt met een spectrofotometer UV-VIS. Een piek van absorptie voor PNC werd waargenomen op 271 nm (Figuur 1B). De definitieve eluens werd ook gemeten met UV-VIS om te bevestigen dat de chemische stoffen die niet hebben gereageerd werden gewassen tijdens de zuivering. De diameter van de hydrodynamische en zeta potentieel van de gesynthetiseerde PNC werden gemeten met een deeltje sizer en zeta potentiële analyzer (Figuur 1C).
PNC labelen met DiI kleurstof .
Om te bepalen van de verdeling van de nanodeeltjes in vivo, PNC waren gelabeld met een fluorescente kleurstof van DiI volgens de methode beschreven in punt 3 van Protocol. DiI kleurstof worden spontaan ingesloten binnen de PNC-coating aangezien het in de hydrofobe domeinen binnen de polymer coatings nanoceria16 kapselen kan. DiI kleurstof aan toevoeg de PNC-oplossing, een snelle kleur wordt gewijzigd in roze werd waargenomen(Figuur 2). De DiI gelabelde PNC werden dan met een 10 kDa filter gezuiverd en gekenmerkt door een UV-VIS-spectrofotometrie. Drie duidelijke pieken van absorptie voor het label PNC DiI werden waargenomen (Figuur 2B). De definitieve eluens werd gemeten door UV-VIS spectrofotometrie om te bevestigen dat de chemische stoffen die niet hebben gereageerd werden weggespoeld tijdens de zuivering.
Blad Lamina infiltratie.
PNC of DiI-PNC werden geleverd in A. thaliana blad via blad lamina infiltratie methode zoals beschreven in sectie 4 van Protocol. Blad was geïnfiltreerd op vier verschillende plekken om ervoor te zorgen dat het volledige blad gebied was geperfundeerd met PNC oplossing (Figuur 3A). Enige overige oplossing is verwijderd uit het blad oppervlak (Figuur 3B en 3 C). Het blad kleur veranderd tijdens de infiltratie van groen naar donkerder groen (Figuur 3D). De spuit was zachtjes tegen het blad gedrukt om elke fysieke schade te voorkomen.
De bereiding van de monsters van het blad voor fluorescentie microscopie.
Blad monsters waren gemonteerd op glas dia's binnen een observatie gel gemaakt goed gevuld met u Na het walsen van de erwt-grootte observatie-gel op de dia (Figuur 4A en 4B), was een goed gemaakt in het midden van de platte gel (Figuur 4C). Vervolgens, de vers bereide blad schijf werd overgeplaatst naar de waterput eerder gevuld met PFD oplossing (Figuur 4D). Een dekglaasje aan werd gebruikt voor het immobiliseren van het blad monster op de dia (Figuur 4E).
Confocale beeldvorming van DiI-PNC in vivo .
DiI-PNC geïnfiltreerd A. thaliana bladeren werden gebruikt voor het bepalen van de verdeling van DiI-PNC in blad mesophyl cellen via confocal imaging (Figuur 5A en 5B). Om te visualiseren colocalization tussen de DiI-PNC en chloroplasten, werden DiI-PNC geïnfiltreerd blad monsters opgewekt met een 514 nm laser. De uitstoot van DiI-PNC werd vastgesteld op 550-615 nm de mogelijke interferentie van chloroplast pigmenten signalen na ~ 650 nm17te voorkomen. De chlorofyl auto-fluorescentie van chloroplasten werden ontdekt van 700-800 nm. De confocal beeldvorming waren ingesteld (laser macht en gewin) om ervoor te zorgen dat er geen DiI kleurstof signalen werden ontdekt in het blad controlemonster (geïnfiltreerd met enige buffer) (Figuur 5C). De colocalization van DiI-PNC met chloroplasten in blad mesophyl cellen kan worden waargenomen door het overlaybeeld van gedetecteerde DiI-PNC en chloroplast pigment autofluorescence (Figuur 5D).
Confocale beeldvorming van PNC ROS opruiming in vivo .
PNC in 10 mM TES bufferoplossing werden geleverd in A. thaliana bladeren via het blad lamina infiltratie methode zoals beschreven in sectie 7 van Protocol. DHE (dihydroethidium) en H2DCFDA (2′, 7-dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT) fluorescente kleurstoffen worden gebruikt om te visualiseren ROS in plantaardige weefsels8,18. H2DCFDA is bekend worden geconverteerd naar fluorescerende DCF (2′, 7-dichlorofluorescein, een indicator van de mate van algemene oxidatieve stress) als gevolg van de splitsing van de acetaat-groepen door ROS19. DHE is een meer specifieke kleurstof voor superoxide anion met zijn fluorescerende product (2-hydroxyethidium) verhogen na reactie met een superoxide anion20. In vivo ROS opruiming ingeschakeld door PNC werd gecontroleerd in blad schijven meten van DHE en DCF kleurstof fluorescentie intensiteit veranderingen (cijfers 6A en 6B). PNC geïnfiltreerd blad monsters met 496 nm laser enthousiast waren. De uitstoot van DHE en DCF kleurstof werd vastgesteld op 500-600 nm de mogelijke interferentie met chloroplast auto-fluorescentie signalen te voorkomen. Pigment auto-fluorescentie van chloroplasten werden ontdekt van 700-800 nm. Na 3 minuten van UV-benadrukken, signalen de ROS kleurstof in PNC en buffer-geïnfiltreerd blad monsters werden apart gecontroleerd. Vergeleken met het neen-nanoparticle buffer besturingselement (NNP), PNC geïnfiltreerd bleek aanzienlijk minder ROS-geactiveerde fluorescerende DCF kleurstof signaal (Figuur 6A) bladeren. Vergelijkbare resultaten werden ook gevonden met de superoxide anion-geactiveerde DHE kleurstof, waar de bladeren van de PNC geïnfiltreerd had aanzienlijk minder DHE kleurstof intensiteit dan buffer geïnfiltreerd controle bladeren (Figuur 6B).
PNC CAT mimetische activiteit assay . Kwantitatieve analyse van de PNC opruiming van H2O2 werd beschreven in het Protocol sectie 8. Een daling van resorufin, waarin de H2O2 -niveau in het reactiemengsel met PNC werd waargenomen (Figuur 7), bevestigen de CAT mimetische activiteit van de gesynthetiseerde PNC.
Figuur 1 : Synthese en karakterisering van de PNC. A. verkleuring van cerium nitraat, poly acrylzuur (PAA), mengsel van cerium nitraat- en PAA, en de gesynthetiseerde PNC (PAA gecoat cerium oxide nanodeeltjes, licht geel). B. extinctie spectrum van PNC gemeten door UV-VIS spectrofotometrie. C. hydrodynamische diameter en zeta potentieel van de gesynthetiseerde PNC. Bedoel ± standaardafwijking (n = 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : PNC etikettering met DiI fluorescente kleurstof. A. PNC (lichtgeel) en DiI kleurstof gelabelde PNC oplossing (DiI-PNC, roze). B. spectrum van de extinctie DiI-PNC oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Blad lamina infiltratie van PNC of DiI-PNC. A. A. thaliana blad voor infiltratie. De oplossing binnen de spuit is DiI-PNC. B. blad met DiI-PNC geïnfiltreerd. C. de resterende schoonmaakvloeistof van het blad oppervlak met delicate taak veegt. D. gereinigd A. thaliana blad met DiI-PNC geïnfiltreerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Voorbereiding van blad voorbeelddia's. A. microscopie glasplaatje met pea grootte observatie gels. B. dia met platte observatie gels. C. Schuif met platte observatie gel met een put in het midden. D. Schuif met blad schijven in de observatie gel goed gevuld met perfluorodecalin (PFD) oplossing. E. dia met blad schijven geïmmobiliseerd door cover slip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Imaging DiI-PNC in blad mesophyl cellen via confocale microscopie. A. Leaf Monster is gemonteerd op een omgekeerde confocal microscoop met een 40 X water onderdompeling lens. B. een confocal microscoop wordt gebruikt voor imaging DiI-PNC en chloroplasten. C. Chloroplast auto-fluorescentie is opgenomen in de buffer geïnfiltreerd blad monsters zonder nanodeeltjes (NNP). D. DiI-PNC signaal en chloroplast auto-fluorescentie is beeld in DiI-PNC geïnfiltreerd blad monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Controle van de PNC ROS opruiming in planta via confocale microscopie. A. DCF fluorescente kleurstof (voor het toezicht op algemene ROS signaal) is aanzienlijk lager in de mesophyl cellen van planten van de PNC geïnfiltreerd dan buffer controle (geen nanodeeltjes, NNP). B. verminderd DHE fluorescerende kleurstof (voor monitoring superoxide anion) in mesophyl cellen van PNC geïnfiltreerd planten ten opzichte van die van controle van de buffer (NNP). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : De mimetische activiteit katalase (CAT) van PNC. In aanwezigheid van mierikswortelperoxidase, de fluorescente sonde reageert met waterstofperoxide en wordt omgezet in resorufin (extinctie 560 nm). Extinctieverhouding van resorufin, die is een indicatie van waterstof peroxide niveau, werd gecontroleerd op 560 nm. PNC toonden een CAT mimetische activiteit. Bedoel ± SE (standaard fout) (n = 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we PNC synthese, karakterisering, fluorescente kleurstof labeling en confocal beeldvorming van de nanodeeltjes in plantencellen mesophyl om hun in vivo ROS opruiming activiteit tentoon te stellen. PNC worden gesynthetiseerd uit een mengsel van cerium nitraat- en PAA oplossing in ammoniak hydroxide. PNC worden gekenmerkt door absorptie spectrophotomery en de concentratie bepaald met behulp van bier-Lamberts wet. Zeta potentiële metingen bevestigd het negatief geladen oppervlak van PNC ter verbetering van de levering aan chloroplasten8. Labelen van PNC met een fluorescente kleurstof DiI maakt in vivo imaging door confocale microscopie binnen blad mesophyl cellen waar de nanodeeltjes Toon hoge niveaus van colocalization met chloroplasten. DHE en DCF fluorescente kleurstoffen gebruikt, bevestigd wij die handeling PNC als een krachtige scavenger van superoxide anion en ROS in vivo.
De methode voor de synthese van de PNC is een eenvoudige stapsgewijze procedure die genereert cerium oxide nanodeeltjes met gecontroleerde grootte, negatieve lading en ROS opruiming vermogens16. Andere methoden, zoals thermische hydrolyse, vereisen hoge temperaturen en dure scheikunde apparatuur21,22. De synthese en de karakterisering van de PNC is een goedkope methode uitgevoerd met gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Het hoeft niet een steile het leren kromme vergeleken met moleculaire methoden in planten op basis van overexpressie van een anti-oxidant enzym, zoals SOD, APXen CAT, voor de opruiming van ROS soort(en) in model systemen23. PNC is een robuuste, in water oplosbare ROS katalytische scavenger waarvoor niet moeizaam klonen en transformatie methoden die afhankelijk van de plantaardige genetische werkwillig en beschikbare moleculaire toolkit zijn.
Een cruciale stap in dit protocol is de spuit gebaseerde infiltratie van blad mesophyl cellen met PNC. Infiltratie van nanodeeltjes in levende planten moet voorzichtig gebeuren Voorkom fysieke schade aan de blad-24. Dus, zoals in Protocol stap 4 van de methoden, duw voorzichtig tegen het oppervlak van het blad met de spuit om scheuren of prikken het abaxial blad oppervlak te voorkomen. Het is beter om te infiltreren van het abaxial oppervlak van A. thaliana blad, omdat het heeft een dichtheid van de hogere stomatal dan de adaxial oppervlakte25,-26. Bovendien, een gebufferde oplossing van PNC of DiI-PNC binnen het bereik van fysiologische pH (~ pH 7.5) tijdens blad lamina infiltratie moet worden gebruikt. Een andere belangrijke stap in dit protocol is om de juiste concentratie van de PNC van toepassing op de bestudeerde plant weefsel. In dit protocol was 50 mg/L PNC niet giftig voor A. thaliana bladeren terwijl het toelaten van katalytische PNC ROS opruiming. Sommige beperkingen van de huidige methode voor het bezorgen van nanoparticle zijn 1) niet van toepassing voor plantensoorten met dikke en wasachtige nagelriemen of lage stomatal dichtheden, 2) niet schaalbaar zijn voor toepassingen op het gebied, 3) de hoge kosten van een confocale microscopie systeem om te controleren in vivo nanoparticle distributie en ROS opruiming.
Dit protocol blijkt de toepassing van ROS opruiming PNC voor studeren en abiotische stress tolerantie in de planten te verbeteren door middel van een facile methode van blad lamina infiltratie. ROS accumulatie gaat gepaard met abiotische benadrukt in planten, die op zijn beurt vermindert de fotosynthese van de planten, groei, en8,27,28opleveren. Plantaardige genetische modificaties methoden voor ROS manipulatie in vivo zijn vaak beperkt tot het model van plantensoorten, terwijl PNC ROS-opruiming heeft het potentieel om te worden toegepast op verschillende wild type plantensoorten. Blad lamina infiltratie is een praktische onderzoeksmethode te verhogen ROS opruiming in blad weefsels voor inzicht en engineering plant abiotische stress tolerantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Californië, Riverside en USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw, Hatch project 1009710 J.P.G. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder Grant No. 1817363 aan J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
