Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) dei ROS (specie reattive dell'ossigeno) lo scavenging in vivo, nanoceria imaging nei tessuti vegetali e microscopia confocale in vivo monitoraggio di nanoceria ROS scavenging mediante microscopia confocale.
Abstract
L'accumulo di ossigeno reattivo specie (ROS) è un marchio di garanzia di risposta piante a stress abiotici. ROS giocano un duplice ruolo nelle piante agendo come molecole a bassi livelli di segnalazione e molecole ad alti livelli dannosi. Accumulo di ROS in piante stressati può danneggiare metaboliti, enzimi, lipidi e DNA, causando una riduzione della crescita delle piante e la resa. La capacità di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) di pulire cataliticamente ROS in vivo fornisce un unico strumento per comprendere e bioingegnere pianta stress abiotici tolleranza. Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare e caratterizzare poli (acrilico) acido nanoceria rivestito (PNC), le nanoparticelle con piante tramite infiltrazione della lamina foglia di interfaccia e monitorare la loro distribuzione e ROS lo scavenging in vivo mediante confocale microscopia. Corrente strumenti molecolari per la manipolazione di accumulo di ROS nelle piante sono limitati a specie modello e richiedono metodi di trasformazione laboriosa. Questo protocollo per in vivo lo scavenging ROS ha il potenziale per essere applicato a tipo selvaggio piante con foglie larghe e struttura foglia come Arabidopsis thaliana.
Introduction
Nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) sono ampiamente usate negli organismi viventi, dalla ricerca di base alla bioingegneria, dovuto la loro specie distinte catalitica reattive dell'ossigeno (ROS) lo scavenging capacità1,2,3. Nanoceria avere ROS scavenging capacità a causa di un gran numero di posti vacanti di superficie ossigeno che si alternano tra due ossidazione stati (Ce3 + e Ce4 +) 4,5,6. I legami pendenti Ce3 + puliscono efficacemente ROS mentre i ceppi della grata su nanoscala promuovono la rigenerazione di questi siti difetto via redox che ciclano reazioni7. Nanoceria sono stati recentemente utilizzati anche per lo studio e ingegneria impianto funzione8,9. Piante sotto stress abiotici verificano accumulo di ROS, causando il danno ossidativo dei lipidi, proteine e DNA10. In impianti di a. thaliana , nanoceria catalitica scavenging dei ROS in vivo conduce alla fotosintesi delle piante migliorate sotto alta luce, calore e agghiacciante sottolinea8. Nanoceria l'applicazione al suolo anche aumenti sparare resa biomassa e grano di frumento (Triticum aestivum)11; piante di colza (Brassica napus) trattate con nanoceria hanno maggiore biomassa vegetale sotto stress sale12.
Nanoceria offrire bioingegneri e pianta biologi uno strumento basato su nanotecnologie per comprendere le risposte di stress abiotici e migliorare la tolleranza di pianta stress abiotici. In vivo ROS scavenging funzionalità di Nanoceria sono indipendenti di specie vegetali, e la consegna facile nei tessuti vegetali ha il potenziale per consentire ampia applicazione all'esterno di organismi modello. A differenza di altri metodi basati su geneticamente, nanoceria non richiedono generatrici che pianta con la sovraespressione di enzimi antiossidanti per maggiore ROS scavenging capacità13. Infiltrazione della lamina foglia di nanoceria alle piante è un approccio pratico per ricerche di laboratorio.
L'obiettivo generale del presente protocollo è per descrivere 1) la sintesi e caratterizzazione di carica negativa poli (acrilico) acido nanoceria (PNC), 2) la consegna e il rilevamento di PNC in tutto cellule di foglia e 3) il monitoraggio del PNC-attivata ROS scavenging in vivo. In questo protocollo, caricate negativamente poli (acrilico) acido nanoceria (PNC) vengono sintetizzati e caratterizzati da loro spettro di assorbimento, diametro idrodinamico e potenziale zeta. Descriviamo un metodo di infiltrazione della lamina semplice foglia per consegnare PNC in pianta tessuti fogliari. Per l'imaging in vivo della distribuzione delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo, un colorante fluorescente (DiI) è stato utilizzato per etichettare PNC (DiI-PNC) e osservare le nanoparticelle tramite microscopia a fluorescenza confocale. Infine, spieghiamo come monitorare in vivo PNC ROS scavenging attraverso microscopia confocale.
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Protocol
1. coltivazione di piante di a. thaliana
- Seminare i semi di a. thaliana in vasi monouso 5 cm x 5 cm, riempito con miscela di suolo standard. Mettere 32 di questi vasi in un vassoio di plastica riempito con acqua (~ 0,5 cm di profondità) e trasferire il vassoio di plastica con le piante in una camera di crescita della pianta.
- Impostare la crescita camera impostazioni come segue: 200 µmol/ms radiazione fotosintetica attiva (PAR), 24 ± 1 ° C giorno e notte di ± 1 ° C 21, 60% di umidità e regime di luce giorno/notte 14/10 h, rispettivamente.
- Sottile ogni pentola per lasciare solo un singolo impianto dopo una settimana di germinazione. Prendere nota per mantenere le piantine con dimensioni simili in ogni pentola.
- Acqua i vasi versando dell'acqua di rubinetto direttamente sul vassoio di plastica una volta ogni due giorni. Coltivare le piante per quattro settimane. A. thaliana piante sono pronte per un ulteriore uso.
2. sintesi e caratterizzazione di PNC
- Pesare 1,08 g di nitrato di cerio (III) e dissolverlo in 2,5 mL di acqua di grado di biologia molecolare in una provetta conica da 50 mL.
- Pesare 4,5 g di acido poli (acrilico) e scioglierla in 5 mL di acqua di grado di biologia molecolare in una provetta conica da 50 mL.
- Mescolare le due soluzioni accuratamente a 2.000 rpm per 15 min usando un miscelatore vortex digital.
- Trasferimento di 15 mL di soluzione di idrossido di ammonio (7,2 M) in un becher di vetro di 50 mL.
- Mescolando a 500 giri/min, aggiungere la miscela da Step 2.3 goccia a goccia la soluzione di idrossido di ammonio e mescolare a 500 giri/min a temperatura ambiente per 24 ore in una cappa aspirante.
- Coprire il becher con un pezzo di carta per evitare la perdita sostanziale di soluzione durante la reazione durante la notte.
- Dopo 24 h, trasferire la soluzione risultante in una provetta conica da 50 mL e centrifugare esso a 3.900 x g per 1 h rimuovere eventuali residui possibili e grandi agglomerati.
- Trasferire questo 22,5 mL della soluzione surnatante in tre filtri di kDa 15 mL 10 e riempire il resto del filtro con acqua grado molecolare per fare una diluizione totale di 45 mL.
- Purificare il supernatante da polimeri gratis e altri reagenti con una centrifuga da banco aggiungendo il surnatante di un filtro di 15ml 10 kDa e centrifugare a 3.900 x g per 15 min. Ripetere questo passaggio almeno sei volte.
- Misurare l'assorbanza di eluente in ogni ciclo con uno spettrofotometro UV-VIS da 220-700 nm per non garantire polimeri gratis e altri reagenti sono presenti nella soluzione finale PNC.
- Prelevare la soluzione PNC raccolta nella siringa da 5 mL e filtrarlo contro un 20 nm siringa filtrante di porosità. Raccogliere la soluzione filtrata PNC in una provetta conica da 50 mL.
- Prendere una soluzione diluita di PNC finale in una cuvetta di plastica e misurare l'assorbanza con lo spettrofotometro UV-VIS da 220-700 nm. Picco di assorbanza PNC è a 271 nm.
- Calcolare la sua concentrazione utilizzando la legge di Lambert-Beer: A = εCL. A è l'assorbanza del valore di picco per un dato campione, ɛ è il coefficiente di assorbimento molare di PNC (cm-1 M-1), L è la lunghezza del cammino ottico (larghezza cuvette, 1cm in questo metodo), e C è la concentrazione molare di nanoparticelle misurate.
- Misurare il diametro idrodinamico e potenziale zeta del PNC sintetizzato utilizzando una particella dimensione e zeta potenziale analyzer (Figura 1).
- Conservare la soluzione finale di PNC in frigorifero (4 ° C) fino al successivo utilizzo.
Nota: Fare riferimento a Wu et al. 8 per ulteriori dettagli di protocollo sulla caratterizzazione di PNC.
3. etichettatura PNC con colorante fluorescente DiI
- Mescolare 0,4 mL di 5 mM (58 mg/L) PNC con 3,6 mL di biologia molecolare acqua di grado in un flaconcino di vetro da 20 mL e mescolare a 500 giri/min.
- Aggiungere 24 µ l 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine soluzione di perclorato colorante (DiI, 2,5 mg/mL; diluito in DMSO) in 176 µ l di DMSO (dimetilsolfossido) per rendere la soluzione di colorante DiI.
- Aggiungere il colorante DiI goccia a goccia la soluzione PNC, mescolando a 1.000 giri/min per 1 min a temperatura ambiente.
- Trasferire la miscela risultante in un filtro di kDa 15 mL 10 e riempire il tubo verso l'alto con acqua di grado di biologia molecolare per rendere la diluizione totale 15 mL.
- Purificare i DiI etichettati soluzione PNC (DiI-PNC) da DMSO e qualsiasi possibile libero DiI tintura da una centrifugazione di benchtop con il filtro di kDa 15 mL 10 a 3.900 x g per 5 min.
- Ripetere passo 3.5 almeno cinque volte.
- Filtrare le soluzioni DiI-PNC finale attraverso una siringa filtro dimensione di poro 20 nm.
- Misurare l'assorbanza di finale DiI-PNC mediante spettrofotometria UV-VIS e calcolare la sua concentrazione secondo la legge di Lambert-Beer (Figura 2). Per ulteriori informazioni, vedere passaggio 2.13.
- Conservare in frigorifero a 4 ° C per un ulteriore uso.
4. infiltrazione di pianta lascia con PNC
- Aggiungere 0,1 mL di infiltrazione (100mm TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, regolata da HCl) del buffer in 0,9 mL di soluzione PNC o DiI-PNC di 0,5 mM e vortice si. Utilizzare una soluzione di tampone 10 mM TES infiltrazione come controllo negativo.
- Trasferire 0,2 mL di soluzione di infiltrazione PNC o DiI-PNC a una siringa senza ago sterile da 1 mL. Toccare per rimuovere eventuali bolle d'aria possibile.
- Recuperare la pianta dalla camera di crescita poco prima di infiltrazione con nanoparticelle per evitare possibili stomi chiusura in condizioni di luce di camera.
- Prima di infiltrazione, è possibile misurare il contenuto di clorofilla da foglie di a. thaliana con dimensioni simili utilizzando un misuratore di clorofilla. Misurare ogni foglia con tre repliche (ogni replica che consiste di almeno tre misurazioni)14. Scegliere che fogli di a. thaliana con simile contenuto di clorofilla per l'esperimento di infiltrazione.
- Si infiltrano le foglie lentamente con la soluzione preparata di PNC o DiI-PNC premendo delicatamente la punta della siringa senza ago contro il fondo della lamina foglia (abbagliai lato) e premere il pistone (Figura 3A).
- Delicatamente pulire fuori la soluzione in eccesso che rimane sulla superficie della lamina foglia (Figura 3B) utilizzando un pulitore delicato compito (Figura 3C) e l'etichetta della pianta. Utilizzare nuovo delicato compito salviette per ogni gruppo di foglie.
- Tenere l' infiltrato a. thaliana piante in panchina per l'adattamento di foglia e incubazione con PNC o DiI-PNC per 3 h.
Nota: Infiltrati a. thaliana piante sono quindi pronti per un ulteriore uso (Figura 3D).
5. preparazione dei campioni di foglia per microscopia confocale
- Rotolo è un pisello di dimensioni quantità di osservazione del gel per circa un raggio di 1 cm (Figura 4A) e poi stenderlo fino a 1 mm sottile su un vetrino (Figura 4B).
- Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,3 cm) per tagliare una sezione circolare al centro del gel osservazione su vetrino (Figura 4C).
- Riempire il taglio ben interamente con perfluorodecalina (PFD) per la risoluzione di imaging più profonda e meglio confocale nei tessuti fogliari.
- Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,2 cm) per raccogliere foglia dischi dall'adattato DiI-PNC infiltrato a. thaliana pianteD(Figura 4).
- Montare il disco di foglia in PFD riempito bene; affrontare l'infiltrato (abbagliai) lato della foglia.
- Mettere un coprioggetto quadrato sopra il disco di foglia e premere delicatamente il vetrino coprioggetti diapositiva in modo uniforme a sigillare con il pozzo del gel di osservazione e garantire che bolle d'aria non rimangano intrappolati (Figura 4E).
6. imaging DiI-PNC nei tessuti fogliari di microscopia confocale
- Utilizzare un obiettivo obiettivo 40 X in un laser invertito microscopio confocale a scansione.
- Goccia di due a tre gocce di ddH2O nella parte superiore della lente dell'obiettivo X 40.
- Posizionare il vetrino preparato di DiI-PNC infiltrato foglia campione in cima l'invertito 40x lente obiettiva.
- Assicurarsi che il lato del vetrino coprioggetto ma non il vetro in contatto direttamente con il ddH2O di scivolare sulla lente.
- Trovare un'area di interesse nel campione al microscopio con luce laser o campo luminoso.
- Avviare il software di microscopio e accendere il laser di Argon (fissato al 20%).
- Impostare il foro stenopeico per raccogliere una fetta ottico a meno di 2 µm e una media di linea di 4.
- Immagine per il campione con le impostazioni al microscopio confocale: eccitazione di 514 nm laser (30%); Spessore della sezione Z-Stack: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (per l'imaging di DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (per l'imaging del cloroplasto).
- Prendere immagini confocal rappresentativi di campioni di foglia da individui differenti, un minimo di tre replicati biologici.
7. imaging PNC in vivo ROS Scavenging mediante microscopia confocale
- Preparare 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, un colorante per indicare un generale ROS) e 10 µM diidroetidio (DHE, un colorante per indicare l'anione superossido) coloranti nel buffer di infiltrazione di TES (pH 7,5) in provette microcentrifuga da 1,5 mL, separatamente.
- Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,2 cm) per raccogliere foglia dischi dal PNC adattato infiltrato piante di a. thaliana .
- Utilizzare la punta tagliente delle pinze per fare tre o quattro fori sui dischi foglia per accelerare il processo di caricamento di tintura.
- Trasferimento la foglia dischi per microcentrifuga con H2DCFDA e DHE separatamente ed incubare per 30 min sotto buio.
- Dopo l'incubazione, sciacquare la foglia dischi con ddH2O tre volte e Monte nel bicchiere scivolare con osservazione gel (Vedi protocollo sezione 5).
- Mettere il vetrino sul microscopio confocale e mettere a fuoco manualmente a un'area di celle mesofillo foglia. Per dettagli, vedere la sezione protocollo 6.
- Esporre i dischi di foglia per i raggi UV-A (405 nm) laser per 3 min generare ROS e registrare il cambiamento di intensità del segnale ROS in serie temporali ("xyt") per disco foglia.
- Il disco di foglia con impostazioni di microscopio confocale immagine: 40 X acqua obiettivo; eccitazione di laser 496 nm; PMT1: 500-600 nm (per DHE e DCFDA tintura rilevamento); PMT2: 700-800 nm (per il rilevamento di cloroplasti). Utilizzare un impianto infiltrato con solo soluzione tampone di infiltrazione come controllo negativo.
8. PNC Scavenging di H2O2in vitro
- Condurre le attività mimetica CAT (catalasi) sintetizzato PNC in vitro di seguendo i metodi in precedenti pubblicazioni3,8,15
- Aggiungere 45,4 µ l di 1 x TES infiltrazione tampone (10 mM TES, 10mm MgCl2, pH 7.5, regolata da HCl), PNC (60 nM, 3 µ l) e H2O2 (2 µM, 1 µ l) in un pozzo (piastra di fondo tondo bianco 96 bene) e mescolare delicatamente pipettando.
- Aggiungere 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine (lavoro concentrazione 100 µM, 0,5 µ l) e perossidasi di rafano (HRP; concentrazione di lavoro 0.2 U/mL, 0,1 µ l) nel pozzo, delicatamente mescolare pipettando e incubare per 30 min. 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine reagisce con H2O2 e viene convertito in Resorufina in presenza di HRP.
- Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce durante l'incubazione.
- Preparare un controllo negativo con tampone di reazione o acqua per sostituire H2O2.
- Fatta eccezione per la soluzione di riserva, preparare tutte le altre soluzioni a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, con un lettore di piastra, monitorare l'assorbanza a 560 nm a utilizzare Resorufina per indicare il livello di H2O2. Regime di tempo impostato a 0, 2, 5, 10, 20 e 30 min.
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Representative Results
Caratterizzazione e sintesi PNC .
PNC sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati seguendo il metodo descritto nel protocollo sezione 2. Figura 1 A Mostra la colorazione delle soluzioni di nitrato di cerio, PAA, la miscela di nitrato di cerio e PAA e PNC. Un cambiamento di colore da bianco a giallo chiaro è visto dopo PNC è sintetizzato. Dopo la purificazione con un filtro 10 kDa, PNC sono state caratterizzate con uno spettrofotometro UV-VIS. Un picco di assorbanza per PNC è stato osservato a 271 nm (Figura 1B). L'eluente finale inoltre è stata misurata con UV-VIS per confermare che le sostanze chimiche non reagiti sono state lavate durante la purificazione. Il diametro idrodinamico e potenziale zeta del PNC sintetizzato sono stati misurati con una particella sizer e zeta potenziale analyzer (Figura 1C).
PNC etichettatura con DiI tintura .
Per determinare la distribuzione delle nanoparticelle in vivo, PNC sono stati etichettati con un colorante fluorescente DiI seguendo il metodo descritto nel protocollo sezione 3. Tintura di DiI incorpora all'interno il rivestimento PNC spontaneamente poiché esso può incapsulare in domini idrofobici all'interno i rivestimenti polimerici di nanoceria16. Dopo l'aggiunta di colorante DiI per la soluzione PNC, un colore rapido cambia a rosa è stato osservato (Figura 2A). I DiI con etichetta PNC erano poi purificato con un filtro 10 kDa e caratterizzate da una spettrofotometria UV-VIS. Chiare tre picchi di assorbanza per i DiI etichettato PNC sono stati osservati (Figura 2B). L'eluente finale è stata misurata mediante spettrofotometria UV-VIS per confermare che le sostanze chimiche non reagiti erano sbiadite durante la purificazione.
Infiltrazione della Lamina di foglia.
PNC o DiI-PNC sono stati consegnati in a. thaliana anta tramite metodo di infiltrazione della lamina foglia come descritto nel protocollo sezione 4. Foglia si è infiltrato in quattro punti diversi per garantire che la zona di foglia intera è stata irrorata con la soluzione PNC (Figura 3A). Eventuali residui di soluzione è stato rimosso dalla superficie del foglio (Figura 3B e 3 C). Il colore delle foglie modificato durante l'infiltrazione da verde a verde più scuro (Figura 3D). La siringa è stata premuta delicatamente contro la foglia per evitare danni fisici.
Preparazione del campione di foglia per microscopia di fluorescenza.
Campioni di foglia sono stati montati sulle lastre di vetro all'interno di un gel di osservazione fatta ben riempito con PFD. Dopo la laminazione il pisello dimensione gel di osservazione sulla diapositiva (Figura 4A e 4B), è stato effettuato un pozzo al centro del piatto gel (Figura 4C). Quindi, il disco di foglia appena preparata è stato trasferito al pozzo precedentemente riempito con soluzione PFD (Figura 4D). Un vetrino coprioggetto è stato utilizzato per immobilizzare il campione di foglia sulla diapositiva (Figura 4E).
Formazione immagine confocal di DiI-PNC in vivo .
Foglie di a. thaliana DiI-PNC infiltrati sono stati utilizzati per determinare la distribuzione dei DiI-PNC in cellule del mesofillo di foglia tramite imaging confocale (Figura 5A e n. 5B). Per visualizzare la colocalizzazione tra i DiI-PNC e cloroplasti, campioni di foglia di DiI-PNC infiltrati erano eccitati con un laser di nanometro 514. L'emissione di DiI-PNC è stata impostata a 550-615 nm per evitare le possibili interferenze del cloroplasto pigmenti segnali dopo ~ 650 nm17. Auto-fluorescenza della clorofilla da cloroplasti sono stati rilevati da 700-800 nm. Le impostazioni di imaging confocale sono state impostate (potenza laser e guadagno) per assicurarsi che nessun segnali di tintura DiI sono stati rilevati nel campione controllo foglia (infiltrato con unico buffer) (Figura 5C). La colocalizzazione di DiI-PNC con cloroplasti nelle cellule del mesofillo di foglia può essere osservato dall'immagine di sovrapposizione di rilevato DiI-PNC e cloroplasto pigmento autofluorescenza(Figura 5).
Formazione immagine confocal di PNC ROS lo scavenging in vivo .
PNC in soluzione tampone TES di 10mm sono stati trasportati in foglie di a. thaliana tramite il metodo di infiltrazione della lamina foglia come descritto nel protocollo sezione 7. DHE (diidroetidio) e tinture fluorescenti di H2DCFDA (2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetato) vengono utilizzate per visualizzare ROS in pianta tessuti8,18. H2DCFDA è conosciuto per essere convertito in DCF fluorescente (2 ', 7 '-diclorofluorescina, un indicatore del grado di stress ossidativo generale) a causa della scissione dei gruppi acetato da ROS19. DHE è una tintura più specifica per superossido anione avendo suo prodotto fluorescente (2-hydroxyethidium) aumenta su reazione con anione superossido20. In vivo ROS scavenging abilitato di PNC è stato monitorato in dischi di foglia misura DHE e DCF tintura fluorescenza intensità cambiamenti (figure 6A e 6B). PNC infiltrato foglia campioni erano eccitati con 496 nm del laser. L'emissione di tintura DHE e DCF è stata impostata a 500-600 nm per evitare possibili interferenze con segnali di auto-fluorescenza del cloroplasto. Pigmento auto-fluorescenza da cloroplasti sono stati rilevati da 700-800 nm. Dopo 3 minuti di UV stress, la tintura ROS segnali in PNC e tampone-infiltrato campioni di foglia sono stati controllati separatamente. Rispetto al controllo buffer no-nanoparticelle (NNP), PNC infiltrato foglie hanno mostrati significativamente meno ROS-attivato segnale di tintura fluorescente DCF (Figura 6A). Risultati simili sono stati trovati anche con il colorante DHE attivato di anione superossido, dove foglie PNC infiltrato avevano significativamente meno intensità di tintura DHE di buffer infiltrato foglie di controllo (Figura 6B).
Analisi di attività mimetica PNC CAT . Dosaggio di PNC scavenging di H2O2 è stato descritto nel protocollo sezione 8. Una diminuzione di Resorufina che indica il livello di H2O2 nella miscela di reazione contenente PNC è stato osservato (Figura 7), conferma dell'attività mimetica di CAT del PNC sintetizzato.
Figura 1 : Sintesi e caratterizzazione di PNC. R. colorazione di nitrato di cerio, poli acido acrilico (PAA), miscela di nitrato di cerio e PAA e il PNC sintetizzato (nanoparticelle di ossido di cerio PAA rivestito, giallo chiaro). B. spettro di assorbanza di di PNC misurata mediante spettrofotometria UV-VIS. C. Hydrodynamic diametro e zeta potenziale del PNC sintetizzato. Media ± errore standard (n = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : PNC etichettatura con colorante fluorescente DiI. R. PNC (giallo chiaro) e DiI tingere etichettati soluzione PNC (DiI-PNC, rosa). B. spettro di assorbanza della soluzione DiI-PNC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Foglia di infiltrazione della lamina di PNC o DiI-PNC. A. a. thaliana foglia prima infiltrazione. La soluzione nella siringa è DiI-PNC. B. foglia infiltrato con DiI-PNC. C. la soluzione rimanente dalla superficie della foglia con delicato compito salviettine detergenti. D. pulire foglia di a. thaliana infiltrato con DiI-PNC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Preparazione dei vetrini campione foglia. Vetrino di r. microscopia con gel di osservazione dimensione pisello. B. far scorrere con gel di osservazione piatto. C. far scorrere con gel di osservazione piatto avendo un pozzo al centro. D. far scorrere con dischi di foglia nel gel osservazione ben riempito con soluzione di perfluorodecalina (PFD). E. far scorrere con dischi di foglia immobilizzati da vetrini coprioggetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Imaging DiI-PNC nel mesofillo foglia cellule tramite microscopia confocal. Esempio di r. foglia è montato su un microscopio confocale invertito con una 40 X lente di immersione in acqua. B. un microscopio confocale è utilizzato per l'imaging di DiI-PNC e cloroplasti. C. cloroplasto auto-fluorescenza è registrato nei campioni di tampone infiltrato foglia senza nanoparticelle (NNP). D. DiI-PNC segnale e cloroplasto auto-fluorescenza è imaged in campioni di foglia di DiI-PNC infiltrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Monitoraggio PNC ROS lo scavenging in planta tramite microscopia confocal. Il colorante fluorescente r. DCF (per il monitoraggio generale ROS segnale) è significativamente più basso nelle cellule del mesofillo delle piante PNC infiltrato rispetto controllo buffer (senza nanoparticelle, NNP). Tintura di B. ridotto DHE fluorescente (per il monitoraggio dell'anione superossido) nelle cellule del mesofillo delle piante PNC infiltrato rispetto a quello del controllo buffer (NNP). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Attività mimetica della catalasi (CAT) di PNC. In presenza di perossidasi di rafano, la sonda fluorescente reagisce con il perossido di idrogeno e viene convertita in Resorufina (assorbanza 560 nm). Assorbanza di Resorufina, che è indicativo di livelli di perossido di idrogeno, è stata controllata a 560 nm. PNC ha mostrato un'attività mimetica di CAT. Media ± SE (errore standard) (n = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, descriviamo PNC sintesi, caratterizzazione, colorante fluorescente etichettatura e la formazione immagine confocal delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo di pianta per esibire la loro attività lavaggio in vivo ROS. PNC sono sintetizzati da una miscela di nitrato di cerio e PAA soluzione in idrossido di ammonio. PNC sono caratterizzati da spectrophotomery di assorbimento e la concentrazione determinata usando la legge di Lambert-Beer. Misure di potenziale Zeta ha confermato la superficie carica negativa del PNC per migliorare la consegna a cloroplasti8. Etichettatura di PNC con un colorante fluorescente DiI permette l'imaging in vivo mediante microscopia confocale all'interno delle cellule del mesofillo foglia dove le nanoparticelle mostrano alti livelli di colocalizzazione con cloroplasti. Usando le tinture fluorescenti DHE e DCF, abbiamo confermato quello atto PNC come un potente scavenger di anione superossido e ROS in vivo.
Il metodo per la sintesi di PNC è una semplice procedura graduale che genera nanoparticelle di ossido di cerio con dimensione controllata, carica negativa e ROS scavenging funzionalità16. Altri metodi, quali idrolisi termica, richiedono alte temperature e chimica costose attrezzature21,22. Sintesi e caratterizzazione di PNC è un metodo di basso costo eseguito con attrezzature di laboratorio comuni. Non richiede una curva di apprendimento ripida rispetto ai metodi molecolari in impianti basati su sovraespressione di un enzima antiossidante, per esempio, SOD, APXe CAT, per lo scavenging specie ROS in sistemi modello23. PNC è un robusto, solubile in acqua ROS scavenger catalitico che non richiederanno la clonazione laborioso e metodi di trasformazione che dipendono trattabilità genetica della pianta e toolkit molecolari disponibili.
Un passaggio fondamentale in questo protocollo è l'infiltrazione delle cellule del mesofillo di foglia con PNC basati su siringa. Infiltrazione di nanoparticelle nelle piante vive dovrebbe essere fatto delicatamente per evitare danni fisici al foglio24. Così, come nel protocollo n. 4 passo dei metodi, spingere delicatamente contro la superficie della foglia con la siringa per evitare strappi o perforare la superficie fogliare abbagliai. È meglio per infiltrarsi dalla superficie della foglia di a. thaliana abbagliai dal momento che ha la più alta densità stomatica che la superficie adassiale25,26. Inoltre, una soluzione tamponata di PNC o DiI-PNC all'interno della gamma di pH fisiologico (~ pH 7.5) deve essere usato durante l'infiltrazione della lamina di foglia. Un altro passo fondamentale in questo protocollo è quello di applicare la concentrazione appropriata di PNC al tessuto vegetale studiata. In questo protocollo, 50 mg/L di PNC non era tossico alla foglie di a. thaliana consentendo catalitica PNC ROS lo scavenging. Alcune limitazioni del metodo di consegna delle nanoparticelle corrente 1) non sono applicabili per piantare specie che hanno le cuticole spesse e cerose o bassa densità stomatica, 2) non scalabile per applicazioni nel campo, 3) l'alto costo di un sistema di microscopia confocale per monitorare in vivo di nanoparticelle distribuzione e ROS scavenging.
Questo protocollo viene illustrata l'applicazione di ROS scavenging PNC per studiare e migliorare la tolleranza a stress abiotici nelle piante attraverso un facile metodo di infiltrazione della lamina foglia. Accumulo di ROS è accompagnato da stress abiotici nelle piante, che a sua volta riduce la fotosintesi della pianta, crescita e resa8,27,28. Metodi di modificazioni genetiche vegetali per manipolazione ROS in vivo sono spesso limitati a piantare specie modello mentre PNC ROS-lavaggio ha il potenziale per essere applicato a specie di piante di vario tipo selvaggio. Infiltrazione della lamina foglia è un metodo di ricerca pratica per aumentare ROS scavenging nei tessuti fogliari per la comprensione e la tolleranza di stress abiotici pianta di ingegneria.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla University of California, Riverside e USDA National Institute of Food e agricoltura, progetto portello 1009710 a J.P.G. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant n. 1817363 per J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
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