Summary
ここ生体内で、生体内および共焦点顕微鏡による植物組織のイメージング nanoceria 清掃合成と ROS (活性酸素種) のセリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) の特性のプロトコルを提案します。nanoceria ROS は、共焦点顕微鏡による清掃を監視します。
Abstract
活性酸素種 (ROS) の蓄積は、非生物的ストレスに対する反応の特徴です。ROS は、低レベルでの分子のシグナル伝達と高いレベルでの分子の損傷として植物デュアル役割を果たします。重点を置かれた植物における活性酸素の蓄積は、代謝、酵素、脂質、および植物生育・収量の減少を引き起こす DNA を損傷することが。触媒生体内で活性酸素を消去するセリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) の能力を理解するユニークなツールと強酸工場非生物的ストレス耐性を提供します。ここでは、合成しポリ (アクリル) 酸コーティング nanoceria (PNC) を特徴付ける、植物葉葉身浸潤によるナノ粒子をインタ フェースし、その分布と活性酸素が生体内で共焦点を使用して清掃を監視するためのプロトコルを提案します。顕微鏡検査。ROS 集積植物の操作のため現在の分子ツールはモデル種に限定され、面倒な変換方法を必要とします。体内ROS が清掃のためこのプロトコルには、広い葉とシロイヌナズナのような葉の構造を持つ野生型植物に適用される可能性があります。
Introduction
セリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) は、バイオ エンジニア リング、清掃能力1,2,3異なる触媒活性酸素種 (ROS) のために基礎的研究から、生物で活躍しています。Nanoceria 清掃能力を交互に 2 つ酸化状態 (Ce3 + Ce4 +) 4,5,6表面酸素空孔の数が多いためロスがあります。Ce の3 +ダングリングボンドは、ナノスケールでの格子ひずみが酸化還元反応7をサイクリングを介してこれらの欠陥サイトの再生を促進しながら効果的に ROS を清掃します。Nanoceria はまた最近使用された勉強のと工学植物機能8,9。非生物的ストレス下の植物は、活性酸素、脂質、蛋白質および DNA10への酸化ダメージの蓄積を経験します。シロイヌナズナ植物で高い光・熱・低温応力8の下で改良された植物の光合成につながる体内ROS の nanoceria 触媒の清掃します。土壌もコムギ (Triticum aestivum)11; 増加撮影バイオマスと子実収量に適用する nanoceriananoceria で治療 (ナタネ) のカノーラ植物塩ストレス12の下でより高い植物バイオマスがあります。
Nanoceria は、バイオ エンジニア リングを提供し、植物の生物学者非生物的ストレス反応を理解し、工場の非生物的ストレス耐性を高めるナノテクノロジー ベースのツール。Nanoceria の生体内ROS 清掃機能は植物種の独立して植物組織に安易な配信モデル有機体の外の幅広いアプリケーションを有効にする可能性があります。他の遺伝子ベースのメソッドとは異なり、nanoceria では清掃能力13高い ROS の抗酸化酵素の発現と植物の行を生成する必要はありません。植物に nanoceria の葉葉身浸潤は、研究室での研究のための実用的なアプローチです。
1) 合成負荷電ポリ (アクリル) 酸 nanoceria (PNC) の評価、2) 配信とリーフ セル全体 PNC の追跡との PNC が有効な ROS 清掃の 3) の監視を記述するこのプロトコルの全体的な目標は、します。vivo。このプロトコルでは、負荷電ポリ (アクリル) 酸 nanoceria (PNC) が合成、吸収スペクトル、流体力学的直径とゼータ電位が特徴します。葉植物に PNC を提供する単純な葉葉身溶浸法について述べる。葉肉細胞内で分布をナノ粒子の生体内イメージングのため蛍光染料 (DiI) は PNC (DiI PNC) にラベルを付けるし、共焦点蛍光顕微鏡によるナノ粒子の観察に使用されました。最後に、我々 は生体内でPNC ROS は、共焦点顕微鏡による清掃を監視する方法を説明します。
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Protocol
1. aの植物の成長
- 標準的な土壌ミックス 5 cm x 5 cm 使い捨て鉢シロイヌナズナ種子をまきます。これらのポットの 32 を入れ水で満たされたプラスチック製のトレイ (〜 0.5 cm) と植物育成装置に植物とプラスチック製のトレイを転送。
- 次のように成長の部屋の設定: 200 µmol/ms 光合成有効放射 (PAR)、24 ± 1 ° C の日と 21 ± 1 ° C 夜、湿度 60%、14/10 h 昼/夜光政権、それぞれ。
- 発芽から 1 週間後 1 つだけの個々 の植物を残してそれぞれのポットを薄い。各ポットに同じようなサイズを持つ実生植物を保つために注意してください。
- 水は 2 日に一度プラスチック製のトレイに直接水道水を注いで鍋。4 週間以内に植物を育てます。シロイヌナズナ植物はそれ以上の使用の準備ができています。
2 PNC の合成とキャラクタリゼーション
- 硝酸セリウム (III) の 1.08 g の重量を量るし、分子生物学グレード水 50 mL の円錐管に 2.5 mL に溶かします。
- ポリ (アクリル) 酸の 4.5 グラムの重量を量るし、分子生物学グレード水 50 mL の円錐管に 5 mL に溶かします。
- デジタル渦のミキサーを使用して 15 分の 2,000 rpm で徹底的にこれらの 2 つのソリューションをミックスします。
- 水酸化アンモニウム溶液 (7.2 M) 15 mL を 50 mL のガラス製ビーカーに転送します。
- を 500 rpm で攪拌しながら水酸化アンモニウム溶液に滴下ステップ 2.3 から混合物を追加し、発煙のフード 24 時間室温で 500 rpm で攪拌します。
- 一晩反応中に解決策の大幅な損失を避けるために紙の部分でビーカーをカバーします。
- 24 h 後得られた溶液を 50 mL の円錐管に転送し、可能な破片と大きな塊を削除する 1 時間 3,900 × g で遠心。
- 3 15 mL 10 kDa フィルターにこの 22.5 mL の上澄み溶液を移すし、合計 45 mL の希釈を行う分子グレード水フィルターの残りを埋めます。
- 無料ポリマーから水相を浄化し、ベンチトップ遠心 15 mL 10 kDa フィルター 3,900 × g で 15 分間遠心し、上清を追加することによって、その他の試薬は、少なくとも 6 回この手順を繰り返します。
- 無料ポリマーがないように 220-700 nm の紫外可視分光光度計の各サイクルで溶離液の吸光度を測定、その他の試薬が PNC の最終的な解決策であります。
- 5 mL シリンジに収集した PNC ソリューションを取るし、20 nm 孔サイズのシリンジ フィルターに対してフィルター処理します。50 mL の円錐管にフィルタ リングの PNC ソリューションを収集します。
- プラスチック キュベットで最終 PNC 薄めたと 220-700 nm の紫外可視分光光度計での吸光度を測定します。PNC 吸光度のピークは、271 nm。
- ビール-ランバートの法則を使用してその濃度を計算する: A = εCL。A はある特定のサンプルのピーク値の吸光度、ɛ PNC (cm-1 M-1) のモルの吸収係数はある、L は光路長 (このメソッドで 1 cm キュベット幅) および C は測定されたナノ粒子のモル濃度。
- 流体力学的直径とアナライザーを使用して、粒子サイズとゼータ電位 (図 1) 合成 PNC のゼータ電位を測定します。
- さらに使用するまで冷蔵庫 (4 ° C) で最終の PNC ソリューションを格納します。
注: は、呉らを参照してください。8 PNC の特性の詳細についてはプロトコルです。
3. DiI 蛍光染料との PNC のラベリング
- グレード水 20 mL ガラス瓶の分子生物学の 3.6 ml 5 mM (58 mg/L) PNC の 0.4 mL を混合し、500 rpm で攪拌します。
- 24 μ L 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸色素溶液を追加 (DiI、2.5 mg/mL の DMSO の希薄) 176 μ L DMSO (ジメチルスルホキシド) DiI 色素希釈するのに。
- PNC 溶液、周囲温度で 1 分間 1,000 rpm で攪拌する滴下 DiI 染料を追加します。
- 15 mL 10 kDa フィルターにこの得られた混合物を転送し、合計の希釈をする分子生物学グレード水で上に管を埋める 15 mL。
- ベンチトップ遠心分離によって DMSO や可能な無料 DiI 染料から PNC (DiI PNC) ソリューションを付け 5 分 3,900 × g で 15 mL 10 kDa フィルター DiI を浄化します。
- ステップ 3.5 を少なくとも 5 回繰り返します。
- 20 nm 孔サイズのシリンジ フィルターを通して DiI PNC 解をフィルターします。
- 紫外可視吸光光度法による最終 DiI PNC の吸光度を測定し、ビール ランベルトの法則 (図 2) によるとその濃度を計算します。詳細については、ステップ 2.13 を参照してください。
- それ以上の使用のための 4 ° C で冷蔵庫で保管してください。
4. 植物の浸透の PNC と葉します。
- 浸潤の 0.1 mL を追加し 0.9 mL 0.5 mM PNC または DiI PNC ソリューションと渦にそれ (100 mM TES は、100 mM の MgCl2、pH 7.5、HCl で調整) をバッファーします。ネガティブ コントロールとして 10 mM TES 浸潤バッファーのソリューションを使用します。
- PNC または DiI PNC 浸潤液 0.2 mL を 1 mL の滅菌無針注射器に転送します。可能な限り空気の泡を削除するをタップします。
- 直前に部屋の光条件下で可能な気孔の閉鎖を避けるためにナノ粒子を浸透成長室から工場を取得します。
- 浸潤前に葉緑素計を用いた同様のサイズとシロイヌナズナの葉のクロロフィル含量を測定します。測定の各葉 3 つのレプリケート (複製が少なくとも 3 つの測定から成る各)14。シロイヌナズナの葉ようなクロロフィル量と浸透実験を選択します。
- 葉の葉身 (中位) の底面に対して無針注射器の先端を軽く押す最近準備 PNC または DiI PNC ソリューションでゆっくりと葉に潜入し、ピストン (図 3A) を低下させます。
- 優しく繊細なタスク ワイパー (図 3C) を使用して葉葉身 (図 3B) の表面に残っている余分なソリューションを拭き取るし、植物にラベルを付けます。葉のグループごとに新しい繊細な作業のおしりふきを使用します。
- 浸透したシロイヌナズナの葉への適応と 3 h の PNC または DiI PNC と孵化のベンチに植物を維持します。
注: 浸透したシロイヌナズナの植物は、さらに使用 (図 3D) の準備されます。
5. 共焦点の顕微鏡検査のための葉のサンプルの準備
- ロール観測量エンドウ豆サイズ 1 cm 半径 (図 4A) に関するへのゲルし、1 mm 薄いガラス スライド (図 4B) それまで広げています。
- コルクの穴あけ器を使用 (直径 0.3 cm) スライド ガラス (図 4C) 観察ゲルの中央に円形断面をカットします。
- 葉の組織のより深くより良い共焦点イメージング解像度 perfluorodecalin (PFD) も完全にカットを入力します。
- コルクの穴あけ器を使用 (直径 0.2 cm) 適応 DiI PNC からリーフ ディスクを収集するシロイヌナズナ植物 (図 4D) に潜入します。
- いっぱい PFD のリーフ ディスクをマウントします。葉の浸潤 (裏面) 側を表向きにします。
- リーフ ディスク上に正方形 coverslip を入れて軽く押して、スライド上に均等に、観測ゲルの井戸とそれを封印し、気泡に閉じ込められた (図 4E) 残っていないか確認します。
6. 共焦点顕微鏡による葉の組織の DiI PNC のイメージング
- 倒立レーザーを共焦点顕微鏡で 40 倍の対物レンズを使用します。
- 2 ~ 3 滴 ddH2O 40 X 対物レンズの上にドロップします。
- 倒立 40 × 対物レンズの上に準備された DiI PNC 潜入葉サンプル スライドを配置します。
- Coverslip 側がないレンズに ddH2O と直接の接触をスライド ガラスであることを確認します。
- レーザー光と明るいフィールド顕微鏡下でサンプルの興味の領域を見つけます。
- 顕微鏡のソフトウェアを起動し、(20% で設定) アルゴン レーザーをオンにします。
- 2 μ m と 4 のラインの平均よりも小さい光学的スライスを収集するためにピンホールを設定します。
- 共焦点顕微鏡の設定でサンプル画像: 514 nm レーザ励起 (30%)Z スタック セクション厚さ: 2 μ m;PMT1: 550 615 nm (DiI PNC 用);PMT2: 700-800 nm (葉緑体用)。
- 異なる個体が、3 つの生物学的複製の最小値からの葉のサンプルの代表の共焦点画像を取る。
7. PNC体内ROS 清掃共焦点顕微鏡によるイメージング
- 準備 25 の μ M 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein セルロースジ アセテート (H2DCFDA、一般的な ROS を示す色素) と 10 μ M dihydroethidium (dhe は、スーパーオキシドアニオンを示す色素) 1.5 mL 遠心チューブに TES 浸潤バッファー (pH 7.5) の染料別に。
- コルクの穴あけ器を使用 (直径 0.2 cm) の葉を収集する適応の PNC からディスク潜入シロイヌナズナ植物。
- 染料のローディング プロセスを加速するためのリーフ ディスク 3 に 4 穴を作るためには、鉗子の先端の鋭利なを使用します。
- 転送葉別途が DCFDA と DHE が H2マイクロ遠心チューブ用にディスクし、暗闇の中で 30 分間インキュベートします。
- インキュベーション後、リーフ ディスク ddH2O 3 回リンスと観察とスライド ガラスにマウント ゲル (プロトコルのセクション 5 を参照)。
- 共焦点顕微鏡のスライドを置くし、葉肉細胞の領域に手動で焦点を当てます。詳細については、プロトコルのセクション 6 を参照してください。
- UV にリーフ ディスクを公開 (405 nm) レーザー ROS を生成し、リーフ ディスクごとの時系列 (「xyt」) に ROS の信号強度の変化を記録する 3 分間。
- リーフ ディスク共焦点顕微鏡の設定を画像: 40 X 水目的;496 nm レーザー励起;PMT1: 500-600 nm (DHE と検出するため DCFDA 染料);PMT2: 700-800 nm (葉緑体を検知します。ネガティブ コントロールとしてのみ浸潤緩衝液を浸透させた植物を使用します。
8. PNC 清掃の H2O2体外
- 以前の出版物3,8,15の方法に従うことによって生体外で合成 PNC の猫 (カタラーゼ) 模倣活動を行う
- 追加 45.4 μ L 1 x TES 浸潤のバッファー (10 mM 10 mM MgCl2、TES pH 7.5、HCl で調整)、PNC (60 nM、3 μ L) と H2O2 (2 μ M、1 μ L) (白丸底 96 ウェル プレート)、井戸の中へと軽くピペッティングで混ぜます。
- 追加 10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine (作業濃度 100 μ M、0.5 μ L) と西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP; 作業濃度 0.2 U/mL、0.1 μ L) 同様に軽くピペッティングで混ぜるし、30 分 10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine の孵化H2O2と反応し、HRP の存在下でアセチルレゾルフィンに変換されます。
- 孵化の間に光を避けるためにアルミ箔でプレートをラップします。
- H2O2を置換する反応バッファーか水を用いたネガティブ コントロールを準備します。
- 原液を除いて周囲温度で他のすべてのソリューションを準備します。
- プレート リーダーで、孵化後 560 で吸光度を監視 H2O2のレベルを示すためらを使用する nm。0、2、5、10、20、および 30 分に時間体制を設定します。
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Representative Results
PNC の合成とキャラクタリゼーション.
PNC 合成、精製し、次のプロトコル セクション 2 で説明されているメソッドの特徴します。図 1Aは、硝酸セリウム、PAA、PNC と PAA、硝酸セリウムの混合物溶液の呈色反応を示しています。白から淡い黄色の色の変化は、PNC は合成後に見られています。10 kDa フィルターで浄化後、PNC は紫外可視分光光度計で特徴付けられました。PNC の吸光度のピークが観測された 271 nm (図 1B)。最終的な溶離液は紫外-可視非反応した化学物質が浄化洗浄したことを確認するためにも測定しました。流体力学的直径と合成の PNC のゼータ電位は、粒子 sizer とゼータ電位分析 (図 1C) を測定しました。
PNC は DiI 染付ラベリング.
生体内でナノ粒子の分布を決定するには、PNC は DiI の蛍光染料のプロトコル セクション 3 で説明する方法を次で付けられました。疎水性領域を nanoceria16のポリマー コーティングの中にカプセル化できるので DiI 色素が自発的に PNC コーティング内で埋め込まれます。DiI 色素を PNC ソリューションに追加すると、急激な色の変化ピンクが観察された (図 2A)。DiI 標識 PNC が 10 kDa フィルターで精製し、紫外可視吸光光度法によって特徴付けられます。PNC をラベル DiI の吸光度の明確なピークがみ (図 2B)。最終的な溶離液は、非反応した化学物質は浄化中洗浄したを確認する紫外可視吸光光度法により測定しました。
葉の葉身の浸潤。
PNC あるいは DiI PNC がプロトコルのセクション 4 で説明するよう葉葉身浸透法によるシロイヌナズナ葉に引き渡されました。葉における葉面積は PNC ソリューション (図 3A) で灌流を確保するための 4 つの別の箇所で浸透していた。残った溶液は、葉の表面 (図 3B 3 C) から削除されました。葉の色は緑から暗い緑 (図 3D) の浸透中に変更します。注射器は、任意の物理的な損傷を避けるために葉に対して優しく押されました。
蛍光顕微鏡用葉サンプル準備。
葉のサンプルはいつもでもいっぱい作った観察ゲル内のガラス スライドに搭載されていたスライド (図 4Aおよび4 b) のエンドウ豆サイズ観察ゲルをころがた後フラット ゲル (図 4C) の真ん中に井戸をしました。その後、作りたてのリーフ ディスクは以前 PFD ソリューション (図 4D) でいっぱいよくに移った。観察は、スライド (図 4E) の葉サンプルを固定していました。
DiI PNC 体内の共焦点レーザー顕微鏡.
DiI PNC 潜入シロイヌナズナ葉は共焦点画像 (図 5A 5 b) を用いて葉肉細胞の DiI PNC の分布を決定するために使用されました。DiI PNC と葉緑体の間の共存を可視化、DiI PNC 潜入の葉のサンプルは 514 nm レーザと興奮していた。DiI PNC の放出は、550 615 nm 〜 650 nm17後葉緑体色素信号の可能な干渉を避けるために設定されました。葉緑体からクロロフィルの自家蛍光が 700-800 nm から検出されました。共焦点イメージング設定は、(レーザー パワーとゲイン) (唯一のバッファーと浸透する) コントロールの葉のサンプル内 DiI 色素信号が検出されなかったかどうかを確認するに設定されていた (図 5C)。葉肉細胞の葉緑体をもつ DiI PNC の共存は、検出された DiI PNC と葉緑体の色素の蛍光 (図 5D) のオーバーレイ イメージが観察できます。
清掃 PNC ROS の共焦点レーザー顕微鏡生体内で.
PNC 10 mM TES 緩衝液は、プロトコルのセクション 7 で説明したよう葉葉身浸透法によるシロイヌナズナ葉に渡されました。Dhe は (dihydroethidium) と H2(2 ', 7 ' dichlorodihydrofluorescein ジアセテート) DCFDA 蛍光染料は植物組織8,18で ROS を視覚化する使用されます。H2DCFDA 知られている蛍光 DCF (2 ', 7 ' ジクロルフルオレッセンの一般的な酸化ストレス度の指標) に変換する酢酸グループの胸の谷間のため ROS19。DHE はより特定の染料スーパーオキシドの陰イオンの蛍光製品 (2-hydroxyethidium) を持つ20スーパーオキシド陰イオンとの反応時に増加します。生体内でDhe は、DCF 色素蛍光強度の変化を測定 (図 6A および 6B) リーフ ディスクで監視された ROS 清掃 PNC で有効になります。PNC には、サンプルが 496 nm レーザーで興奮していた葉が潜入しています。Dhe は、DCF 色素の排出は、葉緑体自動蛍光信号と可能な干渉を避けるために 500-600 nm に設定されました。葉緑体から色素自己蛍光が 700-800 nm から検出されました。UV の 3 分のストレス ROS 染料の葉のサンプルは個別に監視された PNC とバッファー - 潜入に通知されます。PNC は、いいえナノ粒子バッファー コントロール (NNP) と比較して、著しく少ない ROS アクティブ蛍光 DCF 色素信号 (図 6A) を示したを浸透させた。同様の結果も、スーパーオキシド陰イオン活性化 dhe は色素を浸透 PNC 葉がバッファー浸透制御葉 (図 6B) よりは大幅に少ない dhe は染料の強度を持っていた発見されました。
PNC 猫擬態作業の試金.PNC は H2O2の清掃の試金はプロトコル セクション 8 で説明しました。(図 7) を認めた PNC を含む反応混合物で H2O2レベルを示すら減少合成 PNC の猫の模倣活動を確認します。
図 1: PNC の合成とキャラクタリゼーション。A. 着色硝酸セリウム、ポリアクリル酸 (PAA)、硝酸セリウムと、PAA の混合物との合成 PNC (コーティング PAA セリウム酸化物ナノ粒子、淡黄色)。B. 吸光度スペクトル PNC 紫外可視吸光光度法で測定しました。C. 流体直径とゼータ合成 PNC の潜在的な。平均 ± 標準誤差 (n = 4)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: PNC DiI 蛍光色素をラベルします。A. PNC (うす黄色)、DiI は色素標識 PNC 溶液 (DiI PNC、ピンク) です。B. 吸光度スペクトル DiI PNC ソリューション。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 葉の PNC または DiI PNC のラミナ浸潤します。A.シロイヌナズナ葉浸潤する前に。シリンジ内溶液が DiI PNC です。B. 葉 DiI PNC を浸透させた。C. 洗浄繊細な作業と葉面から残りの液をワイプします。D. は、DiI PNC を浸透させたシロイヌナズナ葉を掃除しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 葉サンプル スライドの準備。A. 顕微鏡スライド グラス エンドウ豆サイズ観察ゲル。B. スライド フラット観察のジェル。C. は、真ん中に井戸を有するフラット観察ゲル、スライドさせます。D. は、perfluorodecalin (PFD) 液でいっぱいよく観察ゲルのリーフ ディスク、スライドさせます。E. スライド カバー スリップによって固定化されたリーフ ディスク。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 共焦点顕微鏡による細胞のイメージング DiI-PNC 葉肉で。A. 葉のサンプルは、40 X 水浸漬レンズを有する倒立顕微鏡にマウントされます。B. 共焦点顕微鏡は、DiI PNC と葉緑体をイメージングに使用されます。C. 葉緑体自動蛍光ナノ粒子 (NNP) なし潜入バッファー葉サンプルで記録されます。D. DiI PNC 信号および葉緑体自動蛍光浸透 DiI PNC の葉のサンプルでイメージを作成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: PNC ROS planta の共焦点顕微鏡による清掃を監視します。A. DCF (一般的な ROS 信号の監視) 用蛍光染料は、バッファー コントロール (ないナノ粒子、NNP) より PNC 浸透植物の葉肉細胞有意に低いです。B. 減少 dhe は蛍光染料のバッファー コントロール (NNP) に対する浸透 PNC 植物の葉肉細胞 (スーパーオキシドアニオンを監視) のため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: PNC のカタラーゼ (CAT) 模倣活動。西洋わさびペルオキシダーゼ存在下で蛍光プローブは過酸化水素と反応し、ら (吸光度 560 nm) に変換されます。ら過酸化水素レベルの指標である吸光度モニター 560 nm。PNC は、猫の模倣活動を示した。± SE (標準エラー出力) を意味する (n = 4)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、PNC 合成、キャラクタリゼーション、蛍光色素標識、および体内ROS 清掃活動を展示する植物葉肉細胞中のナノ粒子の共焦点レーザー顕微鏡について説明します。PNC は硝酸セリウムと PAA 溶液水酸化アンモニウムの混合物から合成されます。PNC は吸収 spectrophotomery とビール アンティーク法を用いて濃度によって特徴付けられます。ゼータ電位測定は、葉緑体8への配信に向けた PNC の負荷電の表面を確認しました。ナノ粒子が葉緑体をもつ共存の高レベルを示す葉肉細胞内共焦点顕微鏡による生体内イメージングを有効に DiI の蛍光染料との PNC の分類します。Dhe は、DCF の蛍光染料を使用すると、活性酸素と体内の活性酸素の強力なスカベン ジャーとして PNC 法を確認しました。
PNC を合成する方法は、コントロールのサイズ、負電荷と清掃機能16ROS とセリウム酸化物ナノ粒子を生成する単純なステップごとの手順です。高温、高価な化学装置21,22熱加水分解など、他の方法が必要です。合成と PNC の評価は、一般的な実験装置で実行される低コスト方法です。モデル システム23で活性酸素種を消去、抗酸化酵素、例えば、 SOD, APXと猫の過剰発現に基づく植物分子法と比較して急な学習曲線は必要ありません。PNC は、堅牢な水溶性活性酸素触媒スカベン ジャー骨の折れる複製を必要としない、植物の遺伝的少ないと利用可能な分子ツールキットに依存している変換方法です。
このプロトコルの重要なステップ PNC と葉肉細胞の注射器ベースの浸透であります。生きている植物にナノ粒子の浸透は、葉24に物理的な損傷を避けるためにゆっくり行ってください。したがって、プロトコル メソッドのステップ 4 のようにゆっくり葉の表面に対して注射器で引き裂くや葉の背軸面を穿刺を避けるために。それは、、向軸性の表面の2526より高い気孔密度を持っているので、シロイヌナズナの葉の切断面から潜入することをお勧めします。さらに、生理学的 pH 範囲内で PNC または DiI PNC のバッファー溶液 (~ pH 7.5) 葉葉身の浸透中に使用する必要があります。このプロトコルでもう一つの重要なステップは、研究された植物組織に PNC の適切な濃度を適用することです。このプロトコルで 50 mg/L の PNC がシロイヌナズナ葉に有毒である触媒 PNC ROS 清掃を可能にしながらできませんでした。現在のナノ粒子配信方法のいくつかの制限 1) には該当しない厚さやワックスのキューティクルを有する植物または低気孔密度 2) 分野、3) 監視する共焦点顕微鏡システムの高コストでアプリケーションの拡張性生体内でナノ粒子分布と ROS の清掃します。
このプロトコルは、ROS 清掃 PNC の勉強と葉葉身浸潤の安易なメソッドを介して植物の非生物的ストレス耐性の向上のアプリケーションを示します。ROS 集積は、ターンでは植物の光合成、成長が減少し、8、27,28をもたらす植物の環境ストレスを伴います。ROS 操作体内の植物遺伝の修正方法は、多様な野生植物種に適用される可能性がある PNC ROS 清掃しながらモデルを植物に限定。葉葉身の浸潤は、ROS の理解と工学プラント非生物的ストレス耐性のため葉の組織の清掃を増やす実践的研究方法です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事に支えられたカリフォルニア大学、リバーサイドおよび米国農務省国立食品研究所、農学部ハッチ プロジェクト 1009710 J.P.G.この材料は、J.P.G. に許可第 1817363 の下での国立科学財団によってサポートされる作業に基づいてください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
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