Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка влияния нейропротекторной Glycyrrhizae Radix et корневище извлечь с помощью переходных средней мозговой артерии окклюзии мыши модели

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58454

⸱

9 декабря 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Korean Medicine, Pusan National University, 2College of Medicine, Dongguk University, 3Kyunghee Naseul Korean Medicine Clinic

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы изменить существующий экспериментальный метод для получения более воспроизводимые результаты, путем создания модели мыши средней мозговой артерии окклюзии (СМАо). Пероральное введение Glycyrrhizae Radix et корневища (GR) метанола экстракт (GRex), после инсульта индукции, значительно сократили объем всего миокарда по сравнению с необработанными контрольной группы.

Аннотация

Ишемии, следуют реперфузии мозгового кровообращения после инсульта приводит к смерти нервных клеток и потере ткани головного мозга. Наиболее часто используемых животных модель для изучения инсульта является средней мозговой артерии окклюзии (СМАо). Предыдущих исследований сообщили различные инфаркте размеры даже когда же экспериментальных животных был использован в аналогичных СМАо условиях. Поэтому мы разработали более экспериментальный метод для устранения этого несоответствия. Мышей были подвергнуты СМАо с помощью нити как непроходимость материал для имитации условий человека инсульта и накаливания толщину был оптимизирован для создать более громкости воспроизводимый миокарда. Мышей, получавших с метанолом экстракт Glycyrrhizae Radix et корневища (GRex) после инсульта индукции показан объем значительно снизилась общая миокарда и увеличение количества живых клеток по отношению к группе управления необработанными. Это изменение экспериментальный протокол успешно и можно воспроизвести продемонстрировано благотворное влияние GRex на ишемического инсульта.

Введение

Повреждения головного мозга, вызванные ишемии и реперфузии мозгового кровотока приводит к смерти клетки нерва и потере ткани головного мозга. Этот тип повреждения головного мозга продолжает увеличиваться с распространением цереброваскулярных заболеваний из-за распространения таких метаболических заболеваний, как ожирение, гипертензия и сахарный диабет1,2. Абсолютное количество пожилых больных с инсультом резко возросло во всем мире, и стоимость медицинского обслуживания для этих пациентов, которые часто остаются с долгосрочной инвалидности, является тяжелым бременем общества. Таким образом вторичной инвалидности должны быть смягчены как можно больше уменьшить экономическое бремя1,2.

Наиболее часто используемые грызунов модель ишемии миокарда является средней мозговой артерии (MCA) окклюзии (СМАо), в котором MCA закрыта с силиконовой оболочкой хирургические сшивающие накаливания блокировать поток крови, вызывая ишемического инсульта3, 4. с помощью нити как непроходимость материал позволяет контролировать время окклюзии и постоянство, манипулируя продолжительность интра просветный накаливания вставки.

Предыдущие исследования показали, что даже когда же грызунов СМАо модель используется, общий объем ишемии миокарда колеблется от экспериментов, вызывая низкая воспроизводимость результатов исследований. Чтобы улучшить воспроизводимости, мы оптимизировали Толщина нити мяты, используемых в эксперименте. Результаты предварительного исследования церебрального ишемического периода и индуцированных миокарда, показал ишемического период дольше, чем 60 мин позволила регионе объемные повреждения ткани мозга наблюдается и количественно.

Glycyrrhizae Radix et корневище (GR), также известный как солодка, состоит из сушеных корней и корневищ солодки uralensis и glabra г. Он был использован в китайских и корейских традиционной медицины для различных целей, включая в качестве пищевой добавки и лечебных5,6,7.

В предыдущем исследовании8, предварительной обработки с GR метанола экстракт (GRex) показан эффект анти apoptotic СМАо мышей в том числе значительные предотвращения снижения экспрессии белков B-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2) и Bcl очень большой (Bcl-xL). Это исследование было проведено для улучшения воспроизводимость традиционной модели мыши СМАо путем оценки ее эффективности в определении, если после инфаркта лечение с GRex эффективно сократить объем инфаркте СМАо индуцированной мозгового повреждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных были утверждены Комитетом по этике Пусанского национального университета (номер официального утверждения, ПНУ-2016-1087). На рисунке 1показан графический обзор этого исследования.

1. Подготовка и администрирование GRex

Примечание: Гр, использованных в данном исследовании был приобретен у коммерческих фармацевтической компании.

  1. 200 g гр в 2000 мл метанола и проинкубируйте 5 дней при комнатной температуре (25 ° C).
  2. Смесь с помощью фильтр-бумаги с толщина 0,26 мм и 5 мкм поры фильтра, а затем удалить супернатант. Добавлять 1000 мл метанола GR остатков и фильтровать снова.
  3. Объединить два supernatants, процеживают через фильтровальную бумагу, сосредоточиться в вакууме и затем freeze-dry остатков для производства GRex.
  4. Распустить GRex в диметилсульфоксида (ДМСО), разбавить 0,9% физиологического раствора и процеживают через фильтр шприц 0,45 мкм. Затем настройте конечная концентрация ДМСО < 5%.
  5. Администрировать GRex (300 мг/кг массы тела) 1 час после реперфузии СМАо через пероральная затравка. Администрировать ДМСО, разбавленных в физиологического раствора (10 мл/кг массы тела) только к обычной группы и группы управления, соответственно.
    Примечание: Концентрация GRex, используемых в этом эксперименте был определен согласно концентрации, которая была активна через наши предыдущие исследования8.

2. мыши модель СМАо

  1. Использование самцов мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель и весом 22-25 г. обеспечить всех животных с свободный доступ к стандартным Чоу и воды и дом их в среде с контролируемой температурой (22 ± 1 ° C) и 12 h свет/темно цикла.
    1. Разделите мышей на группы по шесть мышей каждый, которые должны состоять из Шам работает нормальный, контроля и лечения групп GRex.
    2. Выполнять СМАо хирургии (модификация метода Koizumi et al. 9) на элемент управления и GRex лечения групп с помощью стерео микроскопа.
  2. Побудить ингаляционной анестезии в мышей, с помощью изофлюрановая 2% 70% N2O и O 30%2. Анестезия считается достаточным, когда мышь перестает механических раздражитель, применительно к его хвост. Поддерживать температуру тела мышей на 36,5 ± 0,5 ° C, с помощью тела, температура Холдинг одеяло подключен к термометр.
  3. Удалить все волосы на груди и шеи мышей после бритья следуют использования удаления волос крем, дезинфекция хирургические сайт кожи с скраб Бетадин, чередующихся с алкоголем за два раза, а затем сделать надрез примерно 2 см длиной, с хирургической лезвие в центре шеи. Тщательно изолируйте левую общую сонную артерию (LCCA), Внешние сонной артерии и ветви внутренней сонной артерии от окружающих соединительной ткани.
  4. Перевязать наружной сонной артерии и общей сонной артерии с шовного (4-0 Шелковый шов, половина Хитч узел), временно блокировать поток крови в внутренней сонной артерии во время операции.
  5. Вставьте кремния покрытием нейлон шовные (Мононить 8-0, 11 мм) через внутренней сонной артерии на происхождение левой MCA. Отрегулировать толщину кремния покрытием частью накаливания к ряду 0,10-0,12 мм.
  6. Измерьте сокращение относительной мозгового кровотока (rCBF) в MCA, с помощью лазерного доплеровского расходомера. СМАо будет подтверждено, когда rCBF поддерживается в < 20% значения состояния покоя во время всего периода ишемического.
  7. Исправить вставленной нити в кровеносный сосуд для 2 h, пока закрыта мозговой артерии, а затем аккуратно снять накаливания для восстановления кровотока на 22 h реперфузии. Шовные коже по шитье на 5 мест (3-0 Шелковый шов, две половины hitches узел) и позволить каждой мыши, чтобы пробудить от анестезии.
  8. В нормальной группе операция Шам следуя той же процедуре выше (до 2.4), за следующим исключением. Перевязать общей сонной артерии и шовные резаная мышц и кожи.

3. Измерение объема ткани поврежденных мозга

  1. После эвтаназии мышей для измерения повреждения головного мозга с CO2 ингаляции акцизных мыши мозги 24 ч после начала СМАо, используя Ножницы хирургические Ирис и угловой щипцами.
    1. После удаления головы с помощью ножниц, сделайте надрез в коже средней линии головы перевернуть кожу от черепа.
    2. Разорвать теменной кости с угловым щипцами, отшелушивающим Дура вопрос в то же время, а затем изолировать мозг тщательно от черепа.
  2. Вырезать подакцизным ткань в разделы (толщиной 1 мм) с помощью матрицы мозга мыши и затем пятна в разделах 17 мин в раствор 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (TTC).
  3. Исправьте в подразделах формалина 10% для по крайней мере 2 часа и затем сфотографировать их с помощью цифровой камеры. TTC будет соблюдаться пятно жизнеспособных ткани красный, в то время как некротические областях будет белым.
  4. Анализа и количественной оценки Церебральный инфаркт площадь каждой секции с помощью ImageJ.

4. гематоксилином и эозином (H & E) и количество кресил фиолетовое окрашивание Гистологические срезы

  1. Усыпить мышей для гистологического исследования, CO2 ингаляции и perfuse их transcardially с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS), а затем 10 мл 4% параформальдегида (PFA). Изолировать мозг, используя ту же процедуру, как и выше (3.1) и погружать мозга в 10 мл 30% сахарозы на ночь.
  2. Внедрить мозговой ткани оптимального раскроя температуры (OCT) соединения и coronally нарезать его секции толщиной 15 мкм с помощью криостата. Смонтируйте разделы на стеклянных вставках, следуют окрашивание с гематоксилином и эозином (H & E) или количество кресил фиолетовый.
  3. Погружайте стекла слайды в 80% этанола за 1 мин, после окрашивания в растворе гематоксилином за 5 мин.
    1. Дважды Dip слайды кислоты 1% алкоголя, погрузиться в насыщенных лития карбонат решение для 30 сек, промыть проточной водой для 30 s, а затем изображение в раствор эозина для 30 s.
    2. Промойте слайды в водопроводной воде, Замочите в 95% и абсолютного этанола последовательно.
    3. Просушите слайды, очистить их в ксилоле по крайней мере 10 минут, а затем смонтировать coverslips, с помощью установки среднего.
  4. Место стекла слайды на слайде теплее, по крайней мере 1 h, следуют погружения в 50% этанола, разбавляют метилхлороформа на ночь.
    1. Пятно слайды с 0.1% количество кресил фиолетовый для 10 минут в духовке 40 ° C сухой.
    2. Погружать в 95% этаноле для 30 минут, а затем обезвоживает в абсолютного этанола, в 2 раза.
    3. Снимите 2 раза в ксилоле на 5 минут, а затем смонтировать с монтажа средних после воздушной сушки.
  5. С помощью микроскопа, наблюдать гистологические изменения, которые произошли после СМАо индуцированной черепно-мозговой травмы.

5. Статистический анализ

  1. Экспресс результаты эксперимента как средства ± стандартное отклонение и определения статистической значимости между группами с помощью односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) следуют Тьюки должность Специального анализа с помощью программного обеспечения для анализа данных.
  2. Установите статистическую значимость в p-значение < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В группе Шам работает нормально не Церебральный инфаркт наблюдается, тогда как в контрольной группе, наблюдается сравнительно широкий спектр поврежденных областей. В мышах управляемых 300 мг/кг GRex в группе СМАо модель, статистически значимое снижение в поврежденной области наблюдается (рис. 2).

Гистологические изменения исследованы путем пятнать ишемии мозга секции с H & E или количество креси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

С распространением метаболических заболеваний, таких как хронические гипертония, сахарный диабет, гиперлипидемия, которые являются основными факторами риска развития инсульта инсульта профилактики и лечения стали важной областью медицинских исследований12, 13. дефицит языка и движение после инсульта сильно коррелирует с степень повреждения мозга ткани14 и привести к плохой качества жизни пациентов и их семей15. Важн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Не применимо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Glycyrrhizae Radix et RhizomaGwangmyoung Pharmaceuticals Co., КореяGlycyrrhizae Radix et Rhizoma
Качественная фильтровальная бумагаAdvantecФильтровальная бумага No 2Качественная фильтровальная бумага
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD8418-250MLДиметилсульфоксид (ДМСО)
Шприцевой фильтр (0,45 &; m)SigmaCLS431220Шприцевой фильтр (0,45 & микро; m)
СтереомикроскопLeicaM50Стереомикроскоп
СтереомикроскопNikonSMZ745Стереомикроскоп
Лазерный допплеровскийинструмент Мур ИнструментmoorVMS-LDFЛазерный допплеровский
кронштейн для анестезии Настольный кронштейн с N2O и Система расходомера O2Harvard Appratus34-1352Настольный кронштейн для анестезии с N2O и Система расходомера O2
Система гомеотермического мониторингаHarvard Appratus55-7020Система гомеотермического мониторинга
Цифровая камераCanonEos-M2Цифровая камера
CryostatLeicaCM3050SМикроскоп Cryostat Carl
ZeissZeiss AxioМикроскоп
данныхSystat Software Inc.SigmaPlot версия 12Анализ
данных Анализ данныхNIHImage ImageJАнализ данных
Мышиная диетаDoo Yeol BiotechСтандартная диета для грызуновМышиная диета
ИзофлуранJOONGWAEA02104781Изофлуран
ИзофлуранTROIKAAISOTROY 100Изофлуран
Шелковый шовный материал (4-0 Черный шелк) AILEESK47510Шелковый шовный материал (4-0 Черный шелк) 
Шелковый шовный материал (3-0 Белый шелк) Baekjae57Шелковый шовный материал (3-0 Белый шелк) 
Нейлоновый шовный материал (мононить 8-0) AILEENB825Нейлоновый шовный материал (8-0 мононить) 
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (TTC)SigmaT8877-25G2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (TTC)
Формалин (раствор формальдегида)JUNSEI69360-1263 20KGФормалин (раствор формальдегида)
Гематоксилин (Harris Hematoxylin)YD DiagnosticsEasyStainHematoxylin (Harris Hematoxylin)
Эозин (1% раствор эозина Y)MUTO PURE CHEMICALS3200-2Эозин (1% раствор эозина Y)
Крезил фиолет (ацетат)SigmaC5042-10GКрезил фиалка (ацетат)
Параформальдегид Sigma-AldrichP6148-1KGПараформальдегид 
СахарозаJUNSEI31365-0350 1 кгСахароза
Оптимальная температура резания (OCT) компаундScigen4583Оптимальная температура резки (OCT) Компаунд
Дискирующий ножFine Science Tools10055-12Секционный нож
#4 ЩипцыFine Science Tools11241-30#4 Щипцы
#5 ПинцетыFine Science Tools11254-20#5 Щипцы
# 6 ЩипцыFine Science Tools11260-20# 6 Щипцы
# 7 Тонкие щипцыFine Science Tools11274-20# 7 Тонкие щипцы
Хирургические ножницыFine Science Tools14001-12Хирургические ножницы
Extra Fine BonnKnifes Fine Science Tools14084-08Extra Fine Bonn Knifes
Moria Pascheff-Wolff Spring НожницыИзящные научные инструменты15371-92Пружинные ножницы Moria Pascheff-Wolff
Сосуд Расширяющий щипецТонкие научные инструменты18153-11Сосуд Расширяющий щипцы
Анализ

Ссылки

  1. Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
  2. Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
  3. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Article in Handbook of Clinical Neurology. 92, 43-66 (2009).
  4. Kim, D. Animal Models of Stroke. Brain and Neurorehabilitation. 4 (1), 1-11 (2011).
  5. Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
  6. Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
  7. Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
  8. Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
  9. Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  10. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  11. Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
  12. Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
  13. Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
  14. Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
  15. Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329(2016).
  16. Feuerstein, G. Z., Wang, X. Animal models of stroke. Molecular Medicine Today. 6 (3), 133-135 (2000).
  17. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
  18. Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  19. O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W. History of animal models of stroke. International Journal of Stroke. 6 (1), 77-78 (2011).
  20. Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
  21. Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 81 (18), 1654-1669 (2015).
  22. Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экстракт корня солодкианализ объема инфарктапротокол окрашивания TTCметод окрашивания гематоксилином и эозиномокрашивание крезиловым фиолетовымлазерная допплеровская флоуметриясекционирование тканей мозгавведение через зонд в желудок
Оценка влияния нейропротекторной Glycyrrhizae Radix et корневище извлечь с помощью переходных средней мозговой артерии окклюзии мыши модели
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.