ICP0 subisce la traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l'uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell'infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellula infettata proteine 0 (ICP0) del virus herpes simplex 1 (HSV-1) sono una proteina di inizio immediata contenente un'anello-tipo E3 ubiquitina ligasi. È responsabile della degradazione proteasomica di fattori restrittivi ospite e l'attivazione successiva gene virale. ICP0 contiene una sequenza canonica localizzazione nucleare (NLS). Entra nel nucleo immediatamente dopo la sintesi de novo ed esegue le sue funzioni di difesa anti-ospite principalmente nel nucleo. Tuttavia, più tardi nell'infezione, ICP0 si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Presumibilmente ICP0 traslocazione consente ICP0 di modulare le sue funzioni secondo sue sedi subcellulari alle fasi di infezione diversa. Al fine di delineare la funzione biologica e il meccanismo di regolazione della traslocazione nucleare--citoplasmico ICP0, abbiamo modificato un metodo di microscopia immunofluorescente per monitorare il traffico di ICP0 durante l'infezione HSV-1. Questo protocollo coinvolge macchiatura immunofluorescente, microscopio confocale imaging e nucleare vs citoplasmico analisi di distribuzione. L'obiettivo del presente protocollo è quello di adattare le immagini confocal di stato stazionario prese a un corso di tempo in una documentazione quantitativa del movimento ICP0 in tutta l'infezione litica. Proponiamo che questo metodo può essere generalizzato per analizzare quantitativamente nucleare vs localizzazione citoplasmatica di altre proteine virali o cellulare senza coinvolgere la tecnologia di imaging dal vivo.
Introduzione
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) provoca una vasta gamma di lievi a gravi malattie erpetiche compreso herpes labiale, herpes genitale, cheratite stromal ed encefalite. Una volta infettato, il virus stabilisce un'infezione latente permanente in neuroni dei gangli. In alcuni casi, il virus può essere riattivato da vari motivi quali febbre, stress e soppressione immune1, conducente all'infezione di herpes ricorrente. Proteina della cellula infettata 0 (ICP0) è un regolatore chiave di virale cruciale per l'infezione HSV-1 sia litica e latente. Esso transattiva a valle virus geni tramite contrastando l'host difese antivirale intrinseca/innate....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. cellula semina e infezione da Virus
- A 20 – 24 h prima dell'infezione del virus, seme 5 x 104 di fibroblasti di polmone embrionale umano (HEL) o altre cellule per essere esaminato in una diapositiva di 4 pozzetti 11 mm sfalsati in crescita medio (di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% fetale bovino siero (FBS)). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2).
Nota: Ogni bene dovrebbe avere confluency di 70-80% delle cellule al momento dell'infezione. - Il giorno successivo, è necessario rimuovere il mezzo di crescita e infettare le cellule con virus in Medium-199 in una gamma di 4 – 10....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per comprendere le basi molecolari e le funzioni biologiche della ICP0 tratta durante l'infezione HSV-1, utilizziamo un metodo di microscopia immunofluorescente per analizzare la distribuzione subcellulare ICP0 alle fasi di infezione diversa. La figura 1 Mostra le cellule rappresentante con distintivo ICP0 localizzazione come il progredire dell'infezione. Per quantificare la traslocazione nucleare--citoplasmico di ICP0, analizziamo ICP0 distribuzione rispetto.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo è stato usato per studiare la traslocazione nucleare--citoplasmico di HSV-1 ICP0. ICP0 subisce subcellulare traffico durante l'infezione di HSV-1 (Figura 1). Probabilmente, ICP0 interagisce con varie vie di cellule per svolgere funzioni diverse in luoghi diversi. In questo modo ICP0 a mettere a punto le sue multiple funzioni nel braccio di ferro con ospite umano13. Tuttavia, come ICP0 coordina le funzioni multiple in modo spaziale e temporale non è s.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il sostegno finanziario da una sovvenzione di NIH (RO1AI118992) assegnata a Haidong Gu. Ringraziamo la struttura microscopia, Imaging & Core Cytometry risorse (MICR) presso la Wayne State University per il supporto tecnico.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule e virus | |||
| Fibroblasti polmonari embrionali umani (cellule HEL) | Dr. Thomas E. Shenk (Università di Princeton) | Le cellule HEL sono state coltivate in DMEM integrate con il 10% di FBS | |
| HSV-1 virale Stock (Ceppo F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm sfalsato vetrino | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| Soluzione di paraformaldeide al 16% (c/v) Senza metanolo | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Reagenti Fisher | BP151-1C0 | |
| Siero bovino Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Siero di cavallo | Sigma | H1270 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagente | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagente | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagente | BP332-500 | |
| Tampone bloccante (PBS con 1% BSA e 5% di siero di cavallo) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Anticorpo Rabiit Anti-ICP0 | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-IgG monoclonale di topo | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-capra anti-coniglio IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-capra anti-topo IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mezzo di montaggio con DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipetta | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Smalto per unghie | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Microscopio confocale | Software confocale Leica SP8 | ||
| Leica LAS X Suite | |||
| Software Excel | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubatore | Thermo Scientific | Codice d'ordine 51026282 |
Riferimenti
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Li....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
