여기 우리는 마우스에서 아드레날린을 분리, 조직, 그들, 섹션 고치고 면역 형광 염색 법을 수행 하는 방법을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
면역 형광 형광 색소 활용 된 항 체의 고용으로 조직에 항 원의 검출을 위한 기초가 튼튼한 기술 이며 애플 리 케이 션의 광범위 한 스펙트럼 있다. 항 원의 검출 특성화 및 여러 종류의 세포 식별 수 있습니다. 신장 위에 있는 층의 중간 엽 세포에 의해 캡슐, 부 신 동맥은 다른 embryological 기원과 두 개의 다른 조직, mesonephric 중간 mesoderm 파생 바깥쪽 피 질 고는 신경에 의해 구성 된 내 분 비 기관 크레스트 파생 내부 모 반면 catecholamines (즉, 아드레날린, 더욱)를 생산 하는 부 신 수 질 부 신 피 질 스테로이드를 (즉, mineralocorticoids, 스테로이드 제제, 성 호르몬)를 은닉 한다. 부 신 연구를 수행 하는 동안 그것은 서로 다른 기능을 가진 독특한 세포를 구별할 수 있어야 하는 것이 중요입니다. 여기 우리가 제공 하는 프로토콜 일련의 하 부 신 동맥의 세포 유형 면역 형광 염색 법을 얻기 위해 필요한 일련의 단계를 설명 하는 우리의 실험실에서 개발. 우리는 먼저 마우스 아드레날린의 해 부 현미경 고정, 처리 및 파라핀 조직을 포함 하는 periadrenal 지방 제거에 집중 한다. 우리는 다음 로타리 톰와 함께 조직 블록의 단면을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 최적의 신호를 달성 하기 위하여 일반적인 항 체 바인딩 및 autofluorescence를 최소화 하기 위해 개발 했습니다 아드레날린의 immunofluorescent 얼룩에 대 한 프로토콜 세부.
서론
Immunohistochemistry 특정 세포 분자 및 후속 얼룩 기법1활용 된 항 체 검출 하기 위하여 항 체의 사용과 조직 구성 요소를 감지 하는 기술 이다. 이 immunohistochemical 절차 요구 특정 고정 하 고 조직의 특정 항 원에 대 한 자주 실험적으로 결정 되는 처리, 조직 및 항 체 활용2. 고정은 조직과 그대로 세포 및 subcellular 구조와 식 패턴 유지의 "원래" 상태를 유지 하기 위해 중요 합니다. 추가 처리 및 절차를 포함 immunohistochemistry 포함 하는 조직학 연구에 사용 되는 얇은 조각으로 단면 조직 준비 필요 합니다.
Immunostaining 비 또는 형광 탐지를 수행할 수 있습니다. 비 검출 불용 성 컬러 제품으로 수용 성 기질을 변환 하는 효소의 활용을 필요 합니다. 이 효소 항 체 (1 차적인 항 체) 항 원 인식에 활용 될 수 있습니다, 하는 동안 (즉, 이차 항 체) 1 차적인 항 체를 인식 하는 항 체를 더 자주 활용 이다. 이 기술은 이다 매우 중요 한; 효소 반응에서 발생 하는 컬러 제품 photostable 고 영상에 대 한 명시 야 현미경만을 요구 한다. 그러나....
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프로토콜
모든 방법은 사용 하 고 미시간 대학에서의 관리 동물에 대학 위원회의 원조 아래 제도 승인 된 프로토콜에 따라 수행 했다.
1입니다. 수술을 위한 준비
- 수술 전날에 준비 4 %paraformaldehyde (PFA) 인산 염 (PBS) 버퍼링 /. 냉동된 aliquots의 경우 한 해 동을 4 ° c.에 저장 진행
참고: 4 %PFA 없습니다 이상 48 h에 대 한 안정.
주의: PFA는 독성, 피부와 눈에 접촉 하지 않도록 하 고 적절 한 용기에 처분. - 수술 당일,가 위 및 70% 에탄올 (EtOH)으로 겸 살 균 하 여 수술 도구를 준비 하 고 그들이 말리 면 종이 타월에.
- 1 x PBS와 24-잘 접시 가득 장소 (1 mL/음은 충분 한) 얼음 양동이에.
참고: Adrenals 보관 됩니다이 다 잘 문화 접시에 수술 후.
2. 부 신 해 부
- 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 하는 표준 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 죽음 (예: 잘린) 되도록 안락사의 보조 방법이 필요 합니다.
- Isoflurane 과다에 의해 안락사 호흡 중단 때까지 isoflurane....
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결과
그림 1 은 위에서 설명한 전체 프로토콜의 회로도를 나타냅니다. 아드레날린은 쥐에서 수확, 인접 한 지방 조직 해 현미경으로 제거 되 고는 부 신 다음 4% 고정 PFA. 이 단계 후 adrenals 파라핀에 포함 된 고 기관 현미경 슬라이드에 예금 된 얇은 조각으로 잘라 톰으로 구분 처리 됩니다. 섹션의 건조, 면역 형광 검사 수행 섹션 현미경에서 이미지를 만든 후에.
(그림 2A) 인접 한 지방의 제거는 추가 처리 및 부 신 땀 샘의 구분을 용이 하 게 중요 합니다. 주변의 지방 조직의 성공적인 제거는 그림 2B는 부 신 쉽게 감지 하 고 아.......
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토론
이 프로토콜 준비 함께 마우스 아드레날린의 고립과 sectioned 파라핀 끼워 넣어진 마우스 adrenals의 얼룩이 지는 방법을 설명 합니다.
우리가 테스트 하는 다른 프로토콜에 비교해,이 면역 형광 검사 프로토콜 우리의 실험실에서 사용 하는 항 체의 대부분을 위해 적당 한 입증 했다. 그러나, 특정 경우에 그것은 얼룩 결과 개선 하기 위해 일부 조정 해야 합니다. 하나의 변수를 쉽게 수정할 수 있고 테스트 고정 길이입니다. 우리 연구소에서 4%에서 부 화 PFA 변화할 수 있다 1 h에서 4 h, 다른 실험실에서 고정 시간이 12-24 h16에 확장 하는 동안. 그러나 우리의 손에서, 긴 고정 시간 증가 배경 잡음을 주도 하 고 정기적으로 우리의 연구에 사용 하는 여러 항 체에 대 한 최적의 없었다.
항 원 복구의 pH 또한 얼룩의 성공에 있는 역할을 재생할 수 있습니다. 열 유도 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 그의 도움이 제안 및 기술 지원이이 프로토콜의 설립에 대 한 닥터 모하마드 Zubair 감사합니다. 이 작품은 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신장 질병, 건강 연구 그랜트의 국가 학회 2R01-DK062027 (G.D.H)에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 세포 배양 플레이트 | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| 일회용 바늘 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| 파라포름알데히드 (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 파라플라스트 플러스 | McCormik scientific | 39502004 | 조직 임베딩용 파라핀 |
| 이 부착된 Shandon 생검 카세트 II | Thermo scientific | 1001097 | 카세트 |
| High Profile Microtome Blade | Accu-Edge | 4685 | 일회용 스테인리스 스틸 블레이드 |
| Peel-a-way 일회용 플라스틱 조직 임베딩 금형 | Polysciences Inc. | 18986 | 잘린, 22mm 정사각형 상단이 12mm 하단으로 좁아짐 |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| 자일렌 | 피셔 화학물질 | X5P1GAL | |
| 200 프루프 에탄올 | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad 거즈 패드 | 인증 안전 제조, Inc | 231-210 | 3" x 3. 멸균 라텍스 무료 거즈 패드 |
| M.O.M 키트 | Vector laboratories | BMK-2202 | 마우스 조직에서 마우스 기본 항체를 감지하기 위한 |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | 와이프 4.4 인치 x 8.4 인치 |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | 슬라이드에 그리는 펜 |
| 현미경 커버 유리 | Fisherbrand | 12-544-D | 크기: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | 시그마 | D9542 | (20 mg/mL stock으로 조제) |
| ProLong Gold antifade 시약 | 분자 프로브 | P36930 | 면역형광 |
| X-cite 시리즈 120Q | 루멘 다이나믹스 | 광원 | |
| Coolsnap Myo | 포토메트릭 | 카메라 | |
| Optiphot-2 | 니콘 | 현미경 | |
| 마이크로톰 | 미국 광학 | ||
| 조직 임베더 | 라이카 | EG1150 H | |
| 조직 프로세서 | 라이카 | ASP300S | |
| 노멀 염소 세럼 | 시그마 | G9023 | |
| 마우스 안티-TH | 밀리포어 | MAB318 | 1차 항체 |
| 토끼 안티-SF1 | Ab 단백질기술 그룹 (PTGlabs) | 맞춤형 | 기본 항체 |
| Alexa-488 Mouse IgG 염소 | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | 2차 항체 |
| Dylight-549 토끼 IgG 키운 염소 | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | 2차 항체 |
| 구연산산 무수 | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements 기초 연구 | 이미징을 위한 | Nikon |
참고문헌
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as....
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