שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula
במאמר זה
סיכום
תקציר
Schrenkiella parvula הוא extremophyte הותאם מושם והאביוטיים שונים, כולל לחצים רעילות יון מרובים. למרות באיכות גבוהה גנומית המשאבים הזמינים כדי ללמוד איך הצמחים להתאים הסביבה מדגיש, ערכו כמודל גנומיקה תפקודית, כלי הגביל היעדרה של מערכת שינוי ריאלי. ב פרוטוקול זה, אנחנו לדווח על איך ליצור יציבה הטרנסגניים ס parvula קווים באמצעות שיטת פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium. לשנות את פרוטוקול טרנספורמציה המשמש לבנה א עבור התכונות הייחודיות של S. parvula, כגון של הרגל פריחה ייווצרו ותוכן שעווה epicuticular גבוהה על עלים. בקצרה, ס parvula זרעים היו מרובדת ב 4 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים לפני השתילה. הצמחים גדלו ב- photoperiod אור 14 h ואת כהה 10שע 130 µmol מ'-2s-1 עוצמת אור, ב- 22 ° C עד 24 ° C. 8-9 צמחים בת שבוע עם התפרחות מרובות נבחרו לשינוי. התפרחות אלה היו טבולים ב פתרון חדירה של Agrobacterium tumefaciens GV3101, נושאת את פלסמיד pMP90RK . ביצענו שני סיבובים של פרח טובלים במרווח של 3-4 שבועות כדי להגביר את היעילות טרנספורמציה. הזרעים T1 היו נאספים, יבשים במשך ארבעה שבועות במיכל עם desiccants לפני הנביטה עבור המועמד מסך טרנספורמציה קווים. התנגדות באסטה שימש למסך T1 צמחים. ריססנו את הפתרון באסטה שלוש פעמים במרווח של שלושה ימים, החל מ- שני צמחים בת שבוע כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות. מבחן טיפה באסטה בוצעה ב ששרדו צמחים בודדים כדי לזהות נכון transformants חיובי. היעילות השינוי היה 0.033%, מניב 3-4 הצמחים הטרנסגניים לכל 10,000 זרעים T1 מופצות.
מבוא
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הצמיחה ואת הקמת קווי הטרנסגניים יציבה עבור דגם extremophyte Schrenkiella parvula. הזמינות של מערכת יעילה השינוי מהווה סימן היכר של כל דגם גנטי רב תכליתי. צמחים לשגשג בסביבות קיצוניות, התייחס כמו extremophytes, לספק משאב קריטי להבנת צמח עיבודים מושם סביבתיים. Schrenkiella parvula (לשעבר Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) הוא אחד דגם extremophyte כזה, עם הרחבת משאבי גנומית1,2,3,4,5. עם זאת, השינוי פרוטוקולים לא עדיין דווחו עבור ס parv....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צימוח
-
עיקור זרע (אופציונלי)
- להכין 50% מלבין מזוקק פעמיים מים (ddH2O) עם 1 או 2 טיפות של חומר ניקוי ללא יונית (ראה טבלה של חומרים) צינור 50 מ ל. היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון.
הערה: עדיף לבצע עיקור זרע בזרימה שכבתית ארון עם משטח סטיריליים UV למשך 15 דקות. - להוסיף את הפתרון אקונומיקה ~ 100-200 ס parvula זרעים צינור 1.5 מ ל. לערבב היטב ולתת את הצינור לשבת במשך 5 דקות.
- להסיר את המלבין הצינור ולהוסיף 70% אתנול. לשטוף את הזרעים על-ידי pipetting מספר פעמים ולאחר מכן להסיר מיד את הפתרון אתנול.
- לשטוף את הזרעים במים סטיריליים כדי ....
- להכין 50% מלבין מזוקק פעמיים מים (ddH2O) עם 1 או 2 טיפות של חומר ניקוי ללא יונית (ראה טבלה של חומרים) צינור 50 מ ל. היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פיתחנו פרוטוקול טרנספורמציה המאפשרת קציר של T0 זרעים בתוך 150 ימים, באמצעות שיטה פרחוני-מח ש שונה מזו עבור לבנה א. איור 1 מציג סיכום של ציר זמן, ס parvula צמחים המייצגים את הבמה אופטימלית עבור ביצוע השינוי דרך פרחוני-מח ש. בחרנו ס parvula צמחים עם פרחים 70 –80 בתפרחות מרובים ב- 60-80 ימים לאחר נביטה כמו השלב היעד לשינוי. מספר קטן של פרחים פתוחים או מופרית קיימים siliques בשלב זה הוסרו לפני החדירה של tumefaciens א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מצב פיזיולוגי של הצמח משפיע באופן משמעותי את היעילות של טרנספורמציה25. שימוש בצמחים בריא וחסון לשינוי היא דרישה מרכזית לשינוי מוצלח ב ס parvula. מים או צמחים הדגיש האור יהיה פחות פרחים לעומת הצמחים בריא אידיאלי עבור טרנספורמציה (איור 1, במרכז החלונית). Parvula ס יכול לגדול על עוצמת האור פחות מ-130 µmol m s-2 -1, אבל הצמחים נוטים להיות frailer; צמחים כאלו יוביל יותר בוטלה פרחים בעקבות פרחוני-מח ש. ס parvula נוטה לבטל טבו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרס הלאומית למדע MCB 1616827.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 ויטמינים | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO | G1019 | Gamborg' s Vitamin |
| Solution Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | מציין DRIERITE 6 mesh |
| וקטור יעד לטרנספורמציה של צמחים | TAIR | :6531113857 | pKGWFS7 |
| קובטת אלקטרופורציה | ארה"ב Scientific | 9104-5050 | קובטת אלקטרופורציה, מכסה עגול, פער של 0.2 ס"מ |
| מעבדות BIO-RAD, הרקולס, קליפורניה | 1652100 | MicroPulser Electroporator | |
| חרוזי דשן | Osmocote Garden, Marysville, OH | N / A | Osmocote מזון צמחי לשחרור חכם פרח & |
| ערכת מיצוי ג'ל | iNtRON Biotechnology, בוסטון, MA | 17289 | MEGAquick-spin ערכת טיהור DNA של שבר כולל |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) קוטל עשבים (BASTA) | Bayer מדעי הסביבה, Montvale, NJ | N/A | Finale קוטל עשבים |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | תערובת מלח הבסיס השונה של Hoagland |
| N6-benzylaminopurine (BA) | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO | B3274 | 6-תמיסת בנזילמינופורין |
| NaCl | סיגמא-אלריך | S7653 | נתרן כלורי |
| חומר ניקוי לא יוני | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| ערכת בידוד פלסמיד | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | ערכות פלסמיד Zyppy |
| ערכת תערובת אנזים רקומבינאז Life | Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II תערובת אנזים |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO | R3501-1G | Rifampicin, אבקה, ≥ 97% (HPLC) |
| חממת טלטול | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakeers |
| תערובת אדמה | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| צינורות חרוטיים סטריליים 50 מ"ל | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 מ"ל צינורות בורג חרוטיים, קופולימר, מתלים, |
| סוכרוז | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | סוכרוז, |
| תמיסת פעילי שטח | זרעי Lehle, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| ערכת שיבוט מבוססת טופואיזומראז | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | ערכת שיבוט pENTR/D-TOPO, עם זריקה אחת TOP10 מוכשר כימית E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, תמצית שמרים BD Biosciences |
| VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | תמצית שמרי בקטו BD, BD Biosciences |
מקורות
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241(2012).
- Whited, J. The ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
