Мы представляем генома инженерных рабочих процессов для создания новых моделей в пробирке для инфекции ВИЧ-1, что итог proviral интеграции на отдельных участках генома. Нападения на журналистов ВИЧ производный облегчается манипуляция ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной, участкам генома. Предоставляются подробные протоколы для одной ячейки клонов поколения, скрининг и правильной ориентации проверки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Основанный ТРИФОСФАТЫ Cas9 генома инженерии для создания модели Jurkat репортер для инфекции ВИЧ-1 с выбранной Proviral интеграции сайтов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) не случайно интегрирует его proviral ДНК генома клетки хоста на текущих сайтах и геномных горячих точках. Здесь мы представляем подробный протокол для поколения роман в пробирке моделей для ВИЧ-инфекции с выбранной геномной интеграции сайтов с использованием генома, основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техника. С помощью этого метода репортер последовательность выбора могут быть интегрированы в целенаправленной, выбранной геномной локус, отражающие клинически значимых интеграции сайтов.
В протоколе описаны дизайн ВИЧ производные репортер и выбор целевого сайта и gRNA последовательности. Ориентации вектора с гомологии оружия построен и transfected в клетки Jurkat T. Репортер последовательность ориентирован на выбранный сайт геномной гомологичная рекомбинация, при содействии Cas9-опосредованной двухручьевой перерыв на целевом сайте. Клоны одной ячейки создаются и экранируется проточной цитометрии и ПЦР для ориентации событий. Выбранный клоны затем расширяется, и правильной ориентации подтверждена ПЦР, последовательности и Южный blotting. Проанализированы потенциальные пробить события ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной генома техники.
Используя этот протокол, Роман клетки культуры системы, модель ВИЧ-инфекции в клинически значимых интеграции сайты могут быть созданы. Хотя поколение одной ячейки клонов и проверка правильного репортер последовательность интеграции является длительным, результирующий клоновых линий являются мощными инструментами, функционально анализировать выбор сайта proviral интеграции.
Введение
Интеграция proviral ДНК в геноме хоста после инфекции является важным шагом в жизненном цикле вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). После интеграции ВИЧ сохраняется путем установления задержку в долгоживущих подмножеств клеток CD4 + T например CD4 + Т-клеток памяти. Интеграции ВИЧ, по-видимому, не случайные1,2. Ряд очагов геномной с периодически комплексной proviral ДНК была обнаружена в нескольких исследованиях через последовательность интеграции сайтов в остро и хронически инфицированных лиц2,3,4 ,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Ориентация стратегии для генома инженерных и ориентации дизайн вектор (ТВ)
Примечание: Первый шаг генома техники включает в себя подбор и создание необходимых инструментов для ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной ориентации. Выбор геномной интеграции сайта локус, выбор типа клеток для ориентации и дизайн ВИЧ производные репортер для интеграции должно предшествовать этот шаг. Этот протокол описывает ориентации минимальной репортер ВИЧ-LTR_tdTomato_BGH-PA в Jurkat клетки-мишени. На рисунке 1изображена схема рабочего процесса на основе ТРИФОСФАТЫ-Cas9 ориентации, поколение, отбора и проверки клоновых л....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этот представитель эксперимента мы выбрали для минимальной ВИЧ-1-производные репортер, состоящий из ЛТР, tdTomato кодирования последовательность и последовательность поля сигнала для двух локусов в Интрон 5 гена BACH217. Локусов для ориентации были выбраны по близости к опубликованным периодических интеграции сайтов найдены в различных исследованиях на первичный Т-клетки от ВИЧ инфицированных пациентов2,4.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем протокол для создания ВИЧ-1-производные Jurkat репортер модели с выбранной proviral интеграции сайтов применения ТРИФОСФАТЫ-Cas9-основанные геном инженерии.
Несколько точек протокола требуют пристального внимания на этапе планирования. Во-первых, локус направлены должны быть выбраны тщательно, как некоторые локусов может быть проще, чем другие цели (например, в зависимости от статуса хроматина региона и целевого объекта последовательности сам). Повторяющихся последо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим Бритта Weseloh и Bettina Абель для оказания технической помощи. Мы также благодарим Арне Düsedau и Яна Hennesen (поток цитометрии технологическая платформа, Генриха Pette Institut) для технической поддержки.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | вектор для экспрессии SpCas9 и гРНК |
| pMK | GeneArt | вектор экспрессии млекопитающих для клонирования | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | у млекопитающих для клонирования |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | фермент рестрикции |
| NEBuilder Hifi DNA Набор для клонирования | сборки New England Biolabs | E5520S | Набор для клонирования матрицы |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | ДНК-полимераза с корректурной активностью используется для амплификации групп гомологии (шаг 1.2.2.2), верификации сайта интеграции и последовательности репортера (шаги 3.3.3 и 3.3.5), генерации геномного зонда для Южного блоттинга (шаг 3.4.1.5) и анализа нецелевых событий (шаг 3.5.4) |
| 96-луночный планшет для культуры тканей (круглое дно) | TPP | 92097 | планшеты для культуры тканей для разбавления |
| Phusion высокоточная ДНК-полимераза | New England Biolabs | M0530 L | ДНК-полимераза, используемая для обнаружения событий нацеливания (шаг 2.4.2) и генерации репортер-специфичного зонда для Южного блоттинга (шаг 3.4.1.4) |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Диметилсульфоксид | D9170 диметилсульфоксид D9170 | в качестве ПЦР добавка |
| Раствор хлорида магния (MgCl2) New | England Biolabs | B9021S | MgCl2 в качестве ПЦР-добавки |
| Смесь раствора дезоксинуклеотида (dNTP) New | England Biolabs | N0447S | dNTP смесь с 10 мМ каждого нт для ПЦР-реакций |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | готовая к применению смесь для ПЦР для скрининга ПЦР (шаг 3.2.11) |
| QIAamp Мини-набор для выделения | Qiagen | 51106 | выделения и очистки ДНК |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Набор для очистки ПЦР |
| RPMI 1640 без глутамина | Lonza | BE12-167F | Среда для клеточной культуры |
| Фетальная бычья сыворотка Южная Африка Charge | PAN | Biotech P123002 | добавка для |
| клеточной культурыL-глутамин | Biochrom | K 0282 | среда для клеточных культур |
| Пенициллин/Стрептомицин 10.000 Ед/мл/ 10.000 и микро; г/мл | Биохром | А 2212 | среда для клеточных культур |
| добавка Gibco Opti-MEM Пониженная сывороточная среда | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | среда для клеточных культур с пониженной концентрацией сыворотки, оптимизированная для трансфекции |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | реагент для трансфекции |
| форбол 12-миристат 13-ацетат | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | клеточная культура реагент |
| Иономицин | Сигма-Олдрич | I0634-1MG | реактив для клеточной культуры |
| Фильтрующий блок с приводом от шприца, мембрана PES, 0,22 &; m | Millex | SLGP033RB | фильтрующая установка для стерильной фильтрации |
| Heracell 150i инкубатор | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | для культуры тканей |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | положительно заряженная нейлоновая мембрана для блоттинга ДНК и РНК |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | УФ-сшиватель |
| High Prime | Набор Roche | 11585592001 | для мечения ДНК радиоактивным dCTP с использованием случайных олигонуклеотидов в качестве праймеров |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | хроматограф спин-колонки для очистки меченой ДНК |
Ссылки
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
