Summary
Hier beschrijven we een methode om te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren en hun drie belangrijkste sub compartimenten (envelop, stroma en thylakoiden), met behulp van een combinatie van differentiële centrifugations, continue Percoll verlopen, en discontinue sacharose verlopen. De methode is waardevol voor subplastidial en subcellular localisatie van eiwitten door immunoblotting en proteomics.
Abstract
Chloroplasten zijn belangrijke componenten van plantaardige cellen. Dergelijke plastiden vervullen vele cruciale functies, zoals de assimilatie van koolstof, zwavel en stikstof, evenals de synthese van essentiële metabolieten. Deze organellen bestaan uit de volgende drie belangrijke sub compartimenten. De envelop, gekenmerkt door twee membranen, omringt het organel en de mededeling van de Plastide met andere compartimenten van de cel regelt. Het stroma is de oplosbare fase van de chloroplast en de belangrijkste site waar kooldioxide wordt omgezet in koolhydraten. Het membraan thylakoïde is het interne membraan netwerk bestaande uit grana (platte gecomprimeerde zakjes) en lamellen (minder dichte structuren), plaats waar oxygene fotosynthese plaatsvindt. Dit protocol beschrijft stap voor stap-procedures die nodig zijn voor de zuivering, met behulp van differentiële centrifugations en Percoll verlopen, van intact chloroplasten van Arabidopsisen hun fractionering, met behulp van sacharose verlopen, in drie sub compartimenten (dat wil zeggen, envelop, stroma en thylakoiden). Dit protocol biedt ook instructies over hoe om te beoordelen van de zuiverheid van deze fracties met behulp van markeringen gekoppeld aan de verschillende chloroplast sub compartimenten. De hier beschreven methode is waardevol voor de lokalisatie van de subplastidial van eiwitten met behulp van immunoblotting, maar ook voor subcellular subplastidial proteomics en andere studies.
Introduction
Chloroplasten zijn belangrijke componenten van plantaardige cellen. Zij afkomstig zijn van een cyanobacteriën voorouder dat heeft ondergaan een Protista en uiteindelijk geëvolueerd als een organel tijdens evolutie1,2. Deze organellen bevatten drie belangrijkste compartimenten (Figuur 1). De envelop systeem bestaat uit een binnenste en een buitenste membranen rondom het organel. Dit systeem van de dubbele membraan bevat verschillende enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van lipiden en pigmenten en is vooral gewijd aan de controle van de communicatie tussen plastiden en het cytosol. Het bevat verschillende vervoerssystemen waarmee de import van nucleaire-gecodeerd eiwitten, en de uitwisseling van ionen en metabolieten tussen het cytosol en de chloroplast dus reguleren van essentiële metabole functies van de plant cel3,4 . De stroma, de oplosbare fase van de chloroplast, bevat enzymen van de cyclus van Calvin (CO2 assimilatie), de synthese van verschillende metabolieten met inbegrip van de machines van de transcriptie en vertaling van de Plastide, aminozuren en vitaminen. Het membraan thylakoïde is een grote schaal georganiseerde interne membraan-netwerk waar de lichte fase van fotosynthese plaatsvindt. Chloroplasten zijn daarmee de plaats waar de essentiële stofwisselingsroutes5voorkomen.
Om te ontcijferen nieuwe regulerende mechanismen waarmee de dynamiek van chloroplast en fysiologie, is definiëren de sub-plastidial lokalisatie van chloroplast eiwitten dus kritisch ter ondersteuning van gerichte studies gericht op eiwitten functies beter te begrijpen in model organismen6. Om toegang te krijgen tot de lokalisatie van de echte subplastidial van deze proteïnen, is het dus essentieel om te beginnen uit zeer zuivere subplastidial breuken (envelop membranen, stroma en thylakoiden). In deze context is het doel van het huidige protocol te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren met behulp van differentiële centrifugations en continu Percoll verlopen en fractionate hen met behulp van discontinue sacharose verlopen, in drie sub compartimenten (dat wil zeggen, envelop, stroma en thylakoiden). De hier beschreven methode bevat ook instructies voor het beoordelen van de zuiverheid van gezuiverde sub-organellar fracties met behulp van markeringen gekoppeld aan de verschillende chloroplast sub compartimenten. Dit protocol is waardevol voor subplastidial lokalisatie van eiwitten met behulp van immunoblotting en voor verdere analyse van gezuiverde fracties met behulp van spectrometrie van de massa (MS)-op basis van proteomic studies.
Protocol
1. bereiding van Buffers, stamoplossingen en kleurovergangen
- Voorbereiden van de onderstaande voorraadoplossingen die kunnen worden opgeslagen tot 6 maanden bij 4 ° C.
- Bereiden 1 L van Tricine buffer (1 M, pH 8.4) en Tricine buffer (1 M, pH 7,6). Breng de pH door de toevoeging van KOH pellets.
- Bereiden 1 L ethyleendiamminetetra zuur (EDTA, 0.5 M, pH 8) en 3-(N-morpholino) propaan sulfonzuur (MOPS) buffer (1 M, pH 7,8). Breng de pH door toevoeging van NaOH pellets.
- 50 mL MgCl2 (1 M) voor te bereiden.
- Bereiden van 50 mL protease remmers oplossingen: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF ingesteld in isopropanol, 100 mM), benzamidine hydrochloride hydraat (100 mM), en ε-capronzuur aminozuur (50 mM).
Opmerking: Hoewel PMSF en capronzuur aminozuur stabiel in oplossing voor maanden bij 4 ° C, moet de benzamidine oplossing worden opgeslagen bij-20 ° C.
- Voorbereiding van de volgende oplossingen de dag voor het experiment en opslaan van alle oplossingen bij 4 ° C.
- Bereiden van 4 L voor het slijpen van middellange pH 8.4 met Tricine-KOH (20 mM, pH 8.4) sorbitol (0.4 M), EDTA (10 mM, pH 8) en NaHCO3 (10 mM). Breng de pH door toevoeging van NaOH pellets. Voeg bovien serumalbumine (BSA) op 0,1% (g/v) net voor gebruik en meng goed.
- 500 mL medium (2 x) pH 7,6 met Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6) te wassen voorbereiden sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) en EDTA (2,5 mM). Breng de pH door toevoeging van NaOH pellets. Verdun deze oplossing na bereiding van Percoll kleurovergang oplossing te verkrijgen wassen medium (1 x).
- Voorbereiden van kleurovergang Percoll 200 mL chloroplast zuivering door het mengen van Percoll met wassen medium (2 x) op een gelijk volume te krijgen van een definitieve oplossing op 50% (v/v) Percoll / 0.4 M sorbitol.
- 50 mL van de oplossingen van sacharose voorbereiden door chloroplast fractionering door het mengen van verschillende concentraties van saccharose (0,3 M, 0,6 M en 0.93 M), MOPS (10 mM, pH 7,8) en MgCl2 (4 mM).
- Voorbereiding van de volgende verlopen en buffers voor het begin van het experiment.
- Bereiden van zes buizen van Percoll verlopen (elk met daarin 30 mL van een 50% Percoll / 0.4 M sorbitol) door middel van centrifugeren bij 38,700 x g gedurende 55 min bij 4 ° C. De rem weren ter voorkoming van de vermenging van de hellingen. Na het centrifugeren, slaan de buizen met de voorgevormde verlopen in een koude kamer tot gebruik.
- Bereiden van vier buizen van sacharose verlopen, met elk verloop gevormd door de drie volgende sacharose lagen: 3 mL 0.93 M, 2,5 mL 0,6 M en 2 mL 0,3 M sacharose. Zorgvuldig overlay elke laag, gebruik een peristaltische pomp met 0.93 M onderaan beginnen en eindigen met 0,3 M boven.
- Voorbereiding 50 mL hypotone voedingsbodem voor lysis van de chloroplast met MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, ingesteld in isopropanol), benzamidine hydrochloride hydraat (1 mM) en ε-capronzuur aminozuur (0.5 mM). De buffer bewaren in de ijskast tot gebruik.
- 50 mL membraan buffer met MOPS (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), benzamidine hydrochloride hydraat (1 mM) en ε-capronzuur aminozuur (0.5 mM) te wassen voorbereiden. De buffer bewaren in de ijskast tot gebruik.
2. groei en oogsten van Arabidopsis bladeren
- Voor de groei van Arabidopsis planten, voorbereiden 4 grote kunststof pannen (een totale oppervlakte van 0,5 tot 1 m2) van Arabidopsis planten door het zaaien van 30 mg van zaden in elke pan. Arabidopsis planten groeien voor 5 weken op 12 uur licht cyclus bij 23 ° C (dag) / 18 ° C (nacht) met een lichtsterkte van 150 μM m-2 s-1.
- Incubeer de planten in een donkere en koude kamer (4 ° C) 's nachts voorafgaand aan het experiment (om de hoeveelheid zetmeel korrels in chloroplasten).
- Weeg vooraf een bekerglas van 1 L en plaats het dan op ijs voordat u begint met het verzamelen van materiaal van het blad.
- Oogst Arabidopsis bladeren door het vermijden van de bodem (compost). Opnieuw Weeg het bekerglas en het weefsel gewicht.
Opmerking: 400 tot 500 g van blad materiaal verwachting uit vier pannen. - Meng bladeren in een koude kamer met 2 L voor het slijpen van de buffer (toevoegen BSA vóór gebruik) drie keer / 2 s telkens in een mixer op hoge snelheid.
- Filteren van het homogenaat in een koude kamer met 4 lagen van mousseline en één laag van nylon blutex. Knijp zachtjes de homogenaat bladeren binnen de mousseline/nylon blutex uitpakken van alle van de vloeistof.
- Herstellen van het resterende weefsel in de Beker van de blender voor een tweede extractie. Herhaal stap 2.5 en 2.6 met behulp van 2 L voor het slijpen van middellange en nieuwe 4-5 lagen van mousseline (in een koude kamer).
3. de zuivering van ruwe chloroplasten met behulp van differentiële centrifugeren
- Even distribueren van het extract van de ruwe cel in zes flessen van 500 mL en plaatst de flessen op ijs voordat centrifugeren. Centrifugeer gedurende 2 min zodra de maximumsnelheid (2,070 x g) is bereikt (maximale acceleratie en rem op, 4 ° C).
- Verwijder voorzichtig het supernatant.
- Gecombineerd het resterende supernatant met behulp van een waterpomp en houd de korrels met geconcentreerde ruwe chloroplasten op ijs.
- Zachtjes resuspendeer pellets door het toevoegen van een minimale hoeveelheid wassen medium (1 x) (eindvolume van de gecombineerde chloroplast schorsingen = 36 mL) met behulp van een penseel of een gebogen kunststof spatel. Gebruik een pipet 10 mL toevoegen 3 mL medium in elke fles te wassen.
Opmerking: Gebruik geen Pipetteer met zeer fijne tips om te voorkomen dat de breuk van chloroplasten. Als alternatief, snijd het blauw topje van een pipet met een scheermesje voor het genereren van een groter gat. - Het verzamelen van de geresuspendeerde chloroplasten in één buis met behulp van een pipet 10 mL. Meng voorzichtig door het omkeren van de buis om te verkrijgen van een homogene suspensie vóór het laden op Percoll verlopen.
4. zuivering van Intact chloroplasten op continu Percoll helling
- Langzaam laden 6 mL van de chloroplast vering op de top van elk van de zes Percoll verlopen met behulp van een pipet 10 mL om te voorkomen dat de breuk van chloroplasten.
- De verlopen voor 10 min 4 ° C met behulp van een swingende-emmer-rotor 13,300 x g centrifugeren.
Opmerking: De versnelling moet traag, en de rem moet worden losgekoppeld (rem af of langzame vertraging) ter voorkoming van de vermenging van de Percoll verlopen. - De bovenste fase waarin gebroken chloroplasten en intacte mitochondria met behulp van een waterpomp gecombineerd, en vervolgens ophalen intact chloroplasten aanwezig in de lagere fase (de brede band van donkergroen) met een pipet 10 mL. Wees voorzichtig niet om kernen en cel puin (gevonden op de bodem van de buis) gecombineerd met de intact chloroplasten (figuur 2A).
- Verdun 3-4-voudige de intact chloroplast vering met wassen buffer (1 x). Centrifugeer gedurende 2 min zodra de maximumsnelheid (2,070 x g, 4 ° C) wordt bereikt (maximale acceleratie en rem op).
- Zorgvuldig Verwijder het supernatant.
- Volledig het resterende supernatant gecombineerd met een waterpomp en houden de pellet van geconcentreerde intact chloroplasten op ijs.
- Voordat de lysis van de chloroplast, houden een aliquoot deel van intact chloroplast breuk in ongeveer 1 mL medium (1 x) voor verdere analyses met behulp van elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) en het westelijke bevlekken te wassen. Houd een kleine hoeveelheid van deze intact chloroplasten voor bepaling van de eiwitconcentratie. Bewaar de intact chloroplast breuk in vloeibare stikstof voor verdere experimenten.
5. lysis van Intact chloroplasten met behulp van een hypotone Buffer en zuivering van Chloroplast sub compartimenten op discontinue sacharose gradiënten
- Lyse de gezuiverde intact chloroplasten door resuspending van de pellet in hypotone medium dat proteaseinhibitors (het eindvolume mag niet meer dan 12 mL) bevat.
Opmerking: Vanaf deze stap, het gebruik van Pipetteer met fijne uiteinden van de (blauwe) is mogelijk omdat intactheid van chloroplasten niet meer noodzakelijk is (pipetteren chloroplasten omhoog en omlaag zolang pellet is niet volledig geresuspendeerde). Arabidopsis chloroplasten zijn zeer broos (vergeleken met pea chloroplasten, bijvoorbeeld) en hun lysis is vrijwel onmiddellijk na incubatie in hypotone medium. - Langzaam laden 3 mL van de lysed chloroplasten op de bovenkant van elke voorgevormde sacharose verlopen gebruik een peristaltische pomp.
- Ultracentrifuge de verlopen voor 1 h (70.000 x g 4 ° C). Evenwicht paren van buizen met hypotone middellange buffer vóór centrifugeren.
- Zorgvuldig de oplosbare stromale eiwitten herstellen door de bovenste fase van het verloop (3 mL van elk verloop) pipetteren (figuur 2B). Neem een aliquoot gedeelte voor bepaling van eiwit concentratie7. Bewaar de stroma in vloeibare stikstof voor verdere experimenten.
- De resterende bovenste fase van elk verloop gecombineerd tot de gele band met behulp van een waterpomp.
- De gele band (de envelop) ophalen met een pipet (ongeveer 1 mL van elk verloop). Zwembad de enveloppen in één buis.
- Verwijder de resterende fase van elk verloop tot de thylakoïde pellet met behulp van een waterpomp.
6. wassen en concentratie van thylakoïde en envelop membraan systemen
- Resuspendeer de thylakoïde pellets (groene korrels) in een minimale hoeveelheid (2 mL) membraan buffer (1 x) (met proteaseinhibitors) wassen.
- Verdun de envelop en thylakoïde schorsingen 3-4-voudige in membraan wassen medium (volume van 10 ml) en ultracentrifuge voor 1 h (110.000 x g 4 ° C). Evenwicht paren van buizen met membraan wassen buffer vóór centrifugeren.
- Zorgvuldig gecombineerd het supernatant met behulp van een waterpomp.
- Voeg ongeveer 100 µL van membraan wassen buffer (met proteaseinhibitors) om de envelop pellet. Neem een aliquoot gedeelte voor bepaling van eiwit concentratie7. De voorbereiding van de membraan gezuiverde envelop opslaan in vloeibare stikstof.
- Resuspendeer de pellet ze in 3 mL membraan buffer (met proteaseinhibitors) wassen. Neem een aliquoot gedeelte voor bepaling van eiwit concentratie7. Winkel thylakoïde membraan breuk in vloeibare stikstof.
Representative Results
Opeenvolgende stappen van de procedure resulteert in gezuiverde chloroplast en hun sub compartimenten zijn hervat in Figuur 2. Het verloop van de Percoll (figuur 2A) kunt onderscheiden intact chloroplasten van gebroken chloroplast en mitochondriën (begin van het verloop) of kernen en cel puin (onderin het verloop). Na de breuk van de organellen Percoll-gezuiverd dankzij een osmotische schok, worden de resulterende breuken gescheiden op een helling van sacharose (figuur 2B). Het stroma (oplosbare deel van de chloroplast) is drijvend aan de oppervlakte van het verloop van sacharose. De lichte envelop membraan blaasjes worden teruggevorderd als een discrete gele band op het raakvlak van 0,6/0,93 M sacharose. De zwaarste thylakoïde membranen blaasjes zijn geconcentreerd op de onderkant van de buis. Na herstel, wassen en concentratie van de twee membraan breuken, eiwitten zijn gekwantificeerd en de samenstelling van alle vier fracties wordt geanalyseerd op een SDS-pagina (figuur 2C). De rijstroken worden geladen op basis van gelijke eiwit (20 µg voor elke gezuiverde fractie). Wetende dat chloroplasten slechts 1% van de envelop eiwitten en 50% van de eiwitten uit het stroma of uit de thylakoiden bevatten, dit heeft de neiging te overschatten kruisbesmetting van gezuiverde envelop preparaten met andere chloroplast sub compartimenten. Deze methode maakt echter te detecteren minieme hoeveelheden van eiwitten cross-besmetting van de Fractie van de envelop. Markeringen van elk compartiment (dat wil zeggen, overvloedige eiwitten) zijn zeer behulpzaam bij het evalueren van de kruisbesmetting van de fracties. Inderdaad, de thylakoïde en envelop membraan breuken wordt verwacht dat het zeer lage bedragen van de grote subeenheid van RuBisCO (RBCL), de meest voorkomende eiwit uit de stroma (50 kDa) bevatten. Gebroken chloroplasten kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van intact chloroplast als gevolg van het verlies van deze stromale eiwit8. Het oogsten van de complexe eiwitten (LHCP) licht zijn 25-kDa overvloedige thylakoïde onderdelen die moeten nauwelijks envelop membranen9(minder dan 3%) te besmetten. Tot slot de fosfaat-Monosacharide-fosfaat translocator (TPT) is een 30-kDa proteïne dat is alleen zichtbaar in de Fractie van de gezuiverde envelop als gevolg van de sterke verrijking (dat wil zeggen, 50 tot 100 x) in de Fractie van de envelop in vergelijking met hele chloroplast extracten. Met behulp van de methode beschreven hier, chloroplast sub compartimenten zijn over het algemeen slecht Kruis verontreinigde zoals bevestigd met behulp van de western-blot analyses (figuur 2D) afhankelijk van antilichamen gericht tegen bekende markers van alle drie sub compartimenten: de oplosbaar ketol-zuur reductoisomerase (KARI) uit de stroma, de chloroplast envelop koper ATPase (HMA1), en het licht oogsten van complexe eiwitten (LHCP) van de membranen thylakoïde. Kruisbesmetting van de drie sub compartimenten kan worden gekwantificeerd aan de hand van zowel immunoblotting en massa spectrometrie analyses9. Terwijl de stroma meestal niet wordt verontreinigd door envelop of thylakoïde breuken, de gezuiverde envelop breuken 3% thylakoïde eiwitten bevatten en tot 10% van de eiwitten uit het stroma. Eiwitten uit de stroma slecht besmetten de thylakoïde membranen (minder dan 1%), maar ze bevatten tot 3% van de envelop membraaneiwitten. Meer dan met een cruciale rol bij het identificeren van de locatie van de echte subplastidial van chloroplast eiwitten, de huidige methode dus beperkt ook verkeerde conclusies over de lokalisatie van de subplastidial van eiwitten die voortvloeien uit cross verontreinigingen.
Figuur 1: representatieve stelsel van chloroplast sub compartimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: zuivering van intact chloroplasten en hun drie belangrijkste sub vakken met behulp van Percoll en sacharose verlopen. A. Percoll kleurovergang waarmee een scheiding van gebroken en intact chloroplasten. B. verloop van de Sucrose waarmee een scheiding van de stroma, envelop en thylakoïde breuken. C. vertegenwoordiger SDS-PAGE van eiwitten uit intact chloroplasten en hun drie belangrijkste sub compartimenten waardoor te visualiseren overvloedige markeringen van elk sub compartiment. Elke rijstrook bevat 10 µg van eiwitten. Moleculair gewicht Markeringen: RBCL, grote subeenheid van RuBisCO (marker voor de stroma); TPT, fosfaat/Monosacharide-fosfaat translocator (marker voor de envelop); LHCP, lichte oogsten van complexe eiwitten (marker voor de thylakoïde). D. Western-blot experimenten waardoor detecteren van specifieke markers (met behulp van specifieke antilichamen) van elk sub compartiment: de chloroplast envelop koperen ATPase HMA110, het licht oogsten van complexe eiwitten LHCP uit de thylakoïde membranen11, en de ketol-zuur-reductoisomerase KARI van het stroma-9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit artikel is bedoeld voor detail van het stap voor stap-protocol gebruikt voor het zuiveren van chloroplasten (en hun sub compartimenten) van Arabidopsis thaliana. Sinds de beschikbaarheid van het volledige genoom bijna twee decennia geleden, met grote collecties van insertiemutanten ter beschikking gesteld van de Gemeenschap, Arabidopsis nu algemeen aanvaard wordt als een model plant. Echter terwijl deze plant perfect voor genetische benaderingen aangepast was, plantaardige wetenschappers nodig aan te passen van biochemische en fysiologische tools om dit nieuwe model. Protocollen toestaan om te zuiveren van fotosynthetische actieve chloroplasten uit bladeren van gevestigde biochemische modellen zoals spinazie12 of pea13 dus moest worden aangepast. De eerste methode beschrijven van zuivering van Arabidopsis chloroplasten werd gepubliceerd in 199814, net voor de release van het Arabidopsis genoom. Enkele jaren later, eenvoudige methoden voor het isoleren van Arabidopsis chloroplasten compatibel met studies gericht op het analyseren van in vitro invoer van proteïnen in gezuiverde organellen aangebracht beschikbaar15,16. Echter, deze methoden niet in staat om het combineren van de hoge mate van zuiverheid en behoud van fotosynthetische activiteit van de gezuiverde chloroplasten. Meer recentelijk werd17, een snelle methode opgericht, die is gebaseerd op het gebruik van Percoll verlopen en maakt het mogelijk om bijna 90% van het gemeten in de startende bladeren van Arabidopsis fotosynthese te behouden.
Het protocol hier beschreven staat voor het zuiveren van Arabidopsis chloroplasten op een uitstekend niveau van zuiverheid. Inderdaad, immunologische opsporing van contaminanten in andere cel compartimenten aangetoond dat de gezuiverde organellen verstoken van mitochondriale zijn en plasmamembraan markeringen9,10. Dit protocol was ook efficiënt te zuiveren chloroplasten van verschillende Arabidopsis geneeskrachtig18, zoals Columbia (Col) of Wassilewskija (WS), dat wil zeggen, de geneeskrachtig die werden gebruikt voor genoom of uitgedrukt tags (ESTs) volgorde rangschikken projecten maar ook aan T-DNA insertiemutanten Arabidopsiste genereren. Met andere woorden, als proteomics studies worden uitgevoerd moeten, is het huidige protocol compatibel met deze twee referentie geneeskrachtig van Arabidopsis. Tot slot, de opbrengst van chloroplasten met behulp van dit protocol is vergelijkbaar met degene die zijn verkregen bij het starten van spinazie of pea bladeren (dat wil zeggen, 3%, gemeten vanaf het gehalte aan chlorofyl in de Percoll-gezuiverd chloroplast in vergelijking met de totale chlorofyl bedrag aanwezig bij het starten van bladeren). In termen van eiwitten is de opbrengst dicht bij 50 mg chloroplast eiwitten, wanneer organellen zijn gezuiverd van 500 g van 5-week-oude Arabidopsis bladeren.
Tot zo'n goede opbrengst (en chloroplast integriteit), een moet echter bijzondere aandacht besteden aan verschillende stappen bij het gebruik van dit protocol. De chloroplast Arabidopsis is een uiterst kwetsbare structuur (dit is niet het geval voor pea chloroplasten, bijvoorbeeld). Bijzondere aandacht is dus nodig om te voorkomen dat grootschalige breuk van de organellen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Het aantal en de grootte van zetmeel korrels aanwezig is in chloroplasten zijn kritisch voor de bereiding van intact chloroplasten. Inderdaad, chloroplasten met grote zetmeel graan zal over het algemeen worden verbroken tijdens eerste differentiële centrifugations stappen willen concentreren van de ruwe chloroplast breuken12. Daarom moeten de planten 's nachts worden bewaard in een donkere en koude kamer (4 ° C) voordat het experiment, de hoeveelheid zetmeel te beperken.
Nieuwe gebruikers van het huidige protocol zou geneigd zijn te starten vanaf grotere hoeveelheden materiaal van het blad (grote rozetten van oude Arabidopsis planten met grotere bladeren) proberen te verbeteren van het herstel van gezuiverde chloroplasten. Echter, in onze handen, vanaf jonge bladeren (5-week-oude) is het beste compromis opbrengst, zuiverheid, en integriteit van de gezuiverde organellen te combineren. Inderdaad, ook oude bladeren zijn hoogverrijkt in fenolische verbindingen die een negatieve impact hebben op chloroplast integriteit19te zien waren.
Ten slotte, de stap van de eerste extractie (het fijnstampen van het weefsel) is een andere belangrijke stap. De overvloeimodus proces moet beperkt blijven tot enkele seconden. Zoals hierboven vermeld, zou nieuwe gebruikers geneigd zijn te gebruiken met langere mengen, dus verwacht te sterk verbeteren van het rendement van gezuiverde organellen. Als langere mengen effectief releases meer materiaal van bladeren, lijkt echter dat het aandeel van gebroken chloroplasten snel in het ruwe cel extract verhoogt. Verdere zuivering stappen (scheiding op Percoll hellingen) zijn sterk beïnvloed als gevolg van deze hoge verhouding van gebroken aan intact chloroplasten in het medium, en de opbrengst van de zuivering is onverwacht lager.
Beschikbaarheid van specifieke protocollen voor het zuiveren van organellen hebben een aantal hoge-doorvoer proteomics gebaseerde experimenten te worden uitgevoerd op monsters die zijn chloroplast toegestaan. Deze gegevens werden gemaakt beschikbaar in verschillende openbare databanken6, waardoor aan biologen op het gebied van een nauwkeurige subcellular (en subplastidial) lokalisatie voor vele chloroplast eiwitten. Dit was vooral het geval voor de envelop eiwitten wiens identiteit en locatie bleef grotendeels onbekend voordat deze analyses, omdat envelop membranen een kleine chloroplast component (1-2% van de eiwitten chloroplast vertegenwoordigen) tijdens het spelen een sleutelrol in de chloroplast metabolisme en biogenese5,20. Met het protocol beschreven hier, wij onlangs geanalyseerd de samenstelling van de drie belangrijkste chloroplast compartimenten van Arabidopsis (dat wil zeggen, de stroma, de thylakoiden en de envelop membraan systeem)9. Gebaseerd op een benadering van de semi-kwantitatieve proteomics (spectrale tellen), konden we beoordelen de partitionering van honderden eiwitten in deze drie chloroplast compartimenten.
Terwijl het huidige protocol mogelijk maakt om te zuiveren van de drie belangrijkste compartimenten van de chloroplast van Arabidopsis, is het ook mogelijk om te onderscheiden van extra sub compartimenten in de chloroplast. Inderdaad, de envelop membraan systeem is gemaakt van de binnenste en de buitenste omslag membranen (Figuur 1). Tot de beste van onze kennis, een methode voor het zuiveren van de envelop van de binnenste en buitenste membranen van Arabidopsis chloroplasten echter tot stand worden gebracht. Envelop van de binnenste en buitenste membranen kunnen van spinazie21 of pea22 chloroplasten gezuiverd worden. De belangrijkste beperking van Arabidopsis komt meestal voort uit de beperkende hoeveelheid grondstof. Vanaf 500 g van Arabidopsis bladeren (waarvoor reeds 1 m2 oppervlakte in een groei-kamer) kunt slechts 100 µg envelop eiwitten te zuiveren. Aan de andere kant, is het gemakkelijk om te beginnen met 5-10 kg mag bestaan uit spinazie vertrekt vanuit de markt, voor het zuiveren van de grote hoeveelheid chloroplasten8 en te eindigen met een rendement van 3 tot en met 10 mg envelop eiwitten uit dit materiaal.
Hetzelfde geldt voor thylakoïde sub compartimenten. Inderdaad, ze zijn gemaakt van licht membraan blaasjes (lamellen) en dichte structuren (grana) (Figuur 1). Specifieke protocollen zijn beschikbaar voor het onderscheiden van deze twee compartimenten in Arabidopsis23,24. Nogmaals, op basis van een analyse van de kwantitatieve proteomics, wij onlangs de eiwitten aanwezig in deze twee sub compartimenten24geïnventariseerd. Deze benaderingen, samen met een diepgaand onderzoek van de literatuur, toegestaan valideren, of hypothesen stelt voor, de locatie van de subplastidial van honderden thylakoïde eiwitten. Het is echter belangrijk op te merken dat de extra membraan microdomains aanwezig op de gebogen rand van ze zijn. Deze lipoproteïne sub compartimenten, of plastoglobules, zijn permanent gekoppeld aan thylakoïde membranen en bevatten een specifieke set van eiwitten25. Met behulp van dit protocol, is het dus niet mogelijk om te onderscheiden van deze specifieke proteïnen van andere thylakoïde componenten.
Sommige echte (bekende) envelop, stroma of thylakoïde onderdelen zijn nog steeds ontbreekt in de lijsten van gedetecteerde eiwitten. Samen met gerichte biochemische en immunologische analyses, zal de voortdurende verbetering van MS gevoeligheid zitten van tof steun om opnieuw de chloroplast inhoud naar een volledige repertoire van de samenstelling van de verschillende sub compartimenten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een gezamenlijke PhD fellowship aan IB van het INRA plantenbiologie en fokken divisie en van de Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Wij willen ook te erkennen van de ANR project ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Parijs) op antilichamen tegen LHCP en Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) op antilichamen tegen KARI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
| Tricine | Roth | 6977.2 | |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
| NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
| MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzamidine | Sigma | B6506 | |
| ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
| Sucrose | Roth | 9286.2 | |
| Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Bromophenol blue | USB | US12370 | |
| Glycin | Roth | 3908.3 | |
| Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
| Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
| NaCl | Euromedex | 1112-A | |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| Fat-free milk powder | Régilait | ||
| HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
| KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
| NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
| Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
| Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
| Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
| P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
| Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
| Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
| A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
| Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
| Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
| Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
| Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
| Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
| Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
| Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
| JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
| Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
| SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
| SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
| Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
| Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
| Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
| Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
| Liquid nitrogen | |||
| Peristaltic pump | Gilson | ||
| Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
| System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |
References
- Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. Endosymbiotic theory for organelle origins. Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).
- Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. Plastid evolution. Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).
- Linka, N., Weber, A. P. Intracellular metabolite transporters in plants. Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).
- Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol. Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Agrawal, G. K., et al. Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function. Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).
- Chua, N. -H. [40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins. Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).
- Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 30 (2008).
- Ferro, M., et al. AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins. Molecular & Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).
- Seigneurin-Berny, D., et al. HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions. Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).
- Vallon, O., et al. Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).
- Douce, R. J. J. Purification of the chloroplast. Methods in Chloroplast Molecular Biology. Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -H. , Elsevier Science Publishers BV. Amsterdam. 239-256 (1982).
- Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity. Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).
- Kunst, L. Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis. Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).
- Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments. Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).
- Walker, D. The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , Oxygraphics Ltd, University of Sheffield. South Yorkshire, UK. (1990).
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization. Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).
- Soll, J. Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 166 (3), 394-400 (1985).
- Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies. Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).
- Tomizioli, M., et al. Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).
- Spicher, L., Kessler, F. Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).
