여기, 우리는 간단 하 고, 침략, 그리고 쉽게 처리 방법, 더 적은에서 유 방 지방 패드에 유방암 세포를 이식 하는 프로토콜을 제시 하 고이 마우스 orthotopic 유 방 암 모델 적절 한 유 방 지방 패드 환경으로 사용할 수 있습니다의 다양 한 측면을 조사 하 암입니다.
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이 논문에서
요약
초록
적절 한 동물 모델은 질병의 더 나은 이해를 위해 중요 합니다. 동물 모델 설립 (피하 주사, xenografts, 유전자 조작, 화학 시 약 유도, 등) 다른 방법으로 다양 한 병리학 자 및의 특정 측면을 조사 하 고 있는 중요 한 역할 질병입니다. 비록 아무 모형도 없다 완전히 전체 인간의 질병의 진행을 모방 수 있습니다, 적절 한 stromal 환경 orthotopic 장기 질병 모델 한 역할 대신할 질병을 이해 하 고 잠재적인 약물에 대 한 심사. 이 문서에서는, 우리는 간단 하 고, 더 적은 침략, 그리고 쉽게 처리 방법에서에서 유 방 지방 패드에 유방암 세포를 이식 하 여 먼 장기에 전이 수행 방법을 설명 합니다. 기본 종양 성장, 유 방 및 젖꼭지 병 적인 변화에의 적절 한 기능 및 다른 장기의 전이의 높은 발생, maximumly이 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방합니다. 기본 종양 성장에서 제자리에서긴-먼 전이, 그리고 유방암의 종양 microenvironment이이 모델을 사용 하 여 조사 될 수 있다.
서론
유방암은 전세계 여성 사망의 주요 원인. 점차적으로 증가 발생률, 유방암 공중 보건1에 대 한 심각한 도전 되고있다. 암 murine 모델은 전 임상 및 임상 연구, 사이 좋은 교량 그리고 좋은 모방 murine 질병 모델 질병 및 의학 연구의 정확도 증가 합니다.
기본 종양 성장 전이 및 합병증은 죽음 및 가난한 생활 질 대부분의 암 환자에서의 주요 원인은 악성 질환의 진행을 시작 합니다. 여러 murine 모델은 인간 유 방 암2,,34의 병 리를 모방 하는 데 사용 됩니다. 이 종이 식 모델은 널리 사용 화면 약물을 병 적인 캐릭터를 이해 하는 암 연구에 대 한 안전과 효능5,,67. 유전자 조작된 생쥐 (보석) 특정 oncogenes 또는 종양 억제기 유전자8대상으로 인간의 유방암을 모방 하기 위해 생성 됩니다. 보석 암 진행; 유전자의 역할을 이해 하는 비교적 간단 하 고 제복을 입은 배경을 그러나, 인공 환경 및 배경 조사 전이 병 리 제한 됩니다 및 관련 요법9. 인간의 암 세포, 비록 인간의 병 적인 특징으로, 수만 이식 면역 결핍 생쥐에서 그리고 종양 호스트 면역 상호 작용의 부족 편견된 결과10으로 이어질 수 있습니다.
단단한 종양 시작 질병11,,1213의 생물 학적 및 병 적인 캐릭터에 직접적인 영향이 있다. 암 진행 종양 세포, stromal 세포, 면역 세포, 염증 세포, 성장 요인, 및 프로 테아 제 간 상호 작용의 복잡 한 결과 이기 때문에, 1 차 종양 이식 제자리에 것입니다 더 나은 통찰력을 제공 하 고 모방은 화학 약품 또는 종양의 피하 주입에 의해 유도 된 종양 보다 더 정확 하 게 세포 암의 과정. 종양을 유발 하는 데 사용 하는 화학 약품 연구자와 환경에 해로울 수 있습니다 하 고 심지어 일부 국가에서 금지 된다. 유 방 지방 패드 환경의 부재로 인해 실제 유방암 환자에 그 암 발생 및 유 방 지방 패드에서 그만두지 피하 주사의 진행 하는 병 적인 상황으로 달라질 수 있습니다. 피하 주사의 단점은 orthotopic 종양 성장 연구 모델의 사용을 권장 합니다. 이전 연구에서 높은 전이성 MDA-MB-231 종양, 7 orthotopic 간이식 후 개발 주입 위치14의 중요성을 표시. 최근, 수술과 유 방 지방 패드에 유방암 세포의 orthotopic 주입 보고15,16이었다. 유 방 패드 환경, 종양의 성장 및 병 적 관련 사이트에서 유방암의 먼 장기 커버 전체 과정으로 마이그레이션는 인간 질병의 진행의 미니어처 모델이 게 합니다. 그러나, 수술 후, 피부는 자동으로 자체는 정상적인 유 방 암 개시 방해의 잠재적인 위험을가지고 있으며 결과 편견을 치료 하려고 시도 합니다.
우리 일부 유 방 암 모델을 비교 하 고 유 방 암 진행17,18에 약물의 잠재적인 효과 조사 하는 최소 침 습 orthotopic 모델 설립. 이 연구에서 orthotopically 하는 방법에 비디오 프로토콜, 간단한 유 방 지방 패드 유방암 세포 주입, 더 적은 침략 적인 방법 제시. 수술 없이이 orthotopic 주입 방법 많은 방법으로 유리 하다. 먼저, 작업은 간단 하 고 빠른, 마우스 당 약 1 분. 둘째, 기본 종양 foci 바로 병 적인 사이트에서와 전체 tumorigenic 과정을 공부 하기 위한 좋은 실험 동물 모델을 제공 하는 다른 장기 전이 종양의 성장에서 유 방 암 진행의 커버는 종양 세포와 종양 microenvironment의 상호 작용입니다. 게다가, 그것은 유방암의 모든 단계에서 치료 효과 예측 하는 중요 한 모델을 수 있습니다. 이 방법의 목표는 maximumly 모방 인간의 유방암 암 진행 하는 동물 모델을 제공 하는입니다.
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프로토콜
동물 실험 규정 및 일반적인 추천 중국 실험 동물 관리 입법의 실시 했다와 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 주요한 의학 대학에 의해 승인 되었다 (Ref 없습니다. AEEI-2014-052). 6 ~ 8 주 세 여성 Balb/c 마우스 사용 되었다.
1입니다. 세포와 동물의 준비
- 작업을 하기 전에 1 일 운영 영역을 폭로 4 번째 유 두 주위에 머리를 면도.
- 한 손으로 사용 하 여 밀접 하 게 되도록 마우스 것입니다 하지 자유롭게 이동, 그것의 배는 연산자를 노출 하는 마우스를 올려 다음 다른 손으로 4 젖꼭지 주위 모피 전자 면도기와 면도를 사용 하 여 뒤에 마우스를.
- 머리 제거의 얇은 층을 30-60 s 젖꼭지 주위 크림 넣어, 증류수, 크림 멀리 깨끗 하 고 건조 한 다음 부드러운 종이로 마우스.
- 작업 일에 murine 유방암 세포 (4T1-luc2)를 수집 하 고, 셀 수를 계산 하 고 및 메 마른 microcentrifuge 튜브에 2 x 105 셀/ml 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 셀 밀도 조정 한 얼음에 그들을 유지. 각 마우스에 대 한 1 x 104 의 세포/50 µ L 1 mL 주사기에 준비 된다.
2. Orthotopic 주입
-
쥐의 마 취
- 마 취 유도. 닫힌된 투명 용기에 쥐를 넣고 설정까지 그들은 모든 누워서 약 5 분 동안 마우스를 anesthetize를 2 %isoflurane 가스 및가 자 고.
- 마 취를 유지 합니다. 컨테이너에서 개별 마 취 마스크 쥐를 전송, 일부 수 의사 연 고 건조를 피하기 위해, 그들의 젖꼭지는 연산자에 노출 supinely 쥐를 계속 그들의 눈에 넣고 그들 때까지 몇 분 동안 isoflurane 가스를 흡입 하는 주사 수행 되었습니다.
- 발가락 핀치 철수 반사의 부족에 의해 마 취의 성공을 확인 합니다.
- 눈 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
참고: 컨테이너 크기와 사용 가능한 개별 마 취 마스크의 수, 쥐 그룹이 함께 마 취 고 주입 하나 하나 개별 취.
-
주사의 성능
- 따라 주사기에 대 한는 도서관에서 "터널"을 설정 하려면 핀셋와 4 젖꼭지 주위 피부 텐트 한 손을 사용 합니다. 사용 바늘과 주사기를 잡고 다른 손으로 피부를 입력 5-10 mm에서 피하 젖꼭지;에서 위쪽으로 설정 그런 다음 바늘 팁 젖꼭지 활동적 때까지 "터널"을 따라, 신중 하 게 바늘 팁은 최대로 유 방 지방 패드에 바늘 눈 온다 젖꼭지 팁 아래 핀셋, 삭제 하 고 셀을 천천히 주입까지 이동.
- 바늘 좀 돌아서 천천히;는 주사기를 철회 면봉을 사용 하 여 아무 액체 누수 확인을 10-20 s 대 상처 바늘을 누릅니다.
- 성공적인 주입 확인 4 젖꼭지를 관찰: 중심으로 젖꼭지를 한 백색 투명 플랫 영역 (그림 1) 관찰 될 수 있다.
- 쥐 쥐 복구 하 고는 열기를 주입 하면 너무 빨리 이동 시키는 피하기 위해 다른 분 취와 종양 세포 밖으로 누출을 유지.
3. 종양 성장 및 전이의 분석
참고: 기본 종양 식별 됩니다 구형 또는 둥글지 단단한 덩어리와 주사, 후 투명 또는 물집 모양의 범프로 젖꼭지와 몇 일 후. 종양의 성장 종양 및 종양 생물 발광에 의해 평가 됩니다.
- 종양 볼륨을 설정 하기 위해 한 손으로 마우스를 잡아. 운영자에 게 그 배를 노출 하 고 다른 손으로 캘리퍼스 종양 길이 (L)와 폭 (W)를 사용 하 여. 종양 볼륨 (V)를 다음과 같이 계산 합니다.
V = (L x W2) / 2 - 종양 생물 발광을 잡으려고 마우스의 목, 이미징 하기 전에 10 분 뒤 D 소 150 mg/kg을 주사. 5 분에 대 한 2 %isoflurane 가스와 쥐를 anesthetize 하 고 5 분 이상 isoflurane 가스 흡입을 개별 마 취 마스크에 그들을 전송. 제조업체의 지침에 따라 1에서 기본 종양과 전이, 자동 노출 시간, 중간 binning, 그리고 f/정지의 생물 발광 이미지를 캡처하십시오.
4. 분석을 위한 기본 종양 및 전이 장기 수확
참고:이 실험 또는 자비 롭 끝점에 도달의 목적을 달성 하는 경우 기본 종양 추가 연구에 대 한 수확 수 있습니다. 이 연구에서는 종양 종양 볼륨 약 800 m m3를 도달할 때, 주사 후 4 ~ 5 주에 제거 됩니다. 폐는 8 주에 제거 됩니다.
-
기본 종양의 수확
- 메 마른 분위기를 유지 하기 위해 살 균 후드에 수술을 수행 합니다. Isoflurane에 의해 동물을 anesthetize. 발가락 핀치 철수 반사의 부족에 의해 마 취의 성공을 확인 합니다. 밖으로 건조에서 그들을 방지 하기 위해 쥐의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 수술 후 통증을 완화 하가 위, dropwise 진통제 (1 mg/mL tramadol, 마우스 당 약 50 µ L의 1 방울) 피부에서 종양을 분리.
- 외과 봉합 사를 피부를 꿰 매, 잘라 초과 봉합, 절 개에서 드러 워 진.
- 기본 종양 메스와 반에, 추가 되며 오신 (H & E) 얼룩 및 immunohistochemistry, 4 %paraformaldehyde 종양의 1/2를 넣어 자르고 즉시 다른 1/2 부 럽에 대 한 액체 질소 또는 한 RNA를 동결 나중에 격리 연구입니다.
- 봉합, 후 따뜻한 쥐 램프와 그들은 복구까지 완전히 복구 될 때까지 한 장에 마우스를 유지. 수술 후 3 d 구강으로 10 mg/kg tramadol를 지속적으로 관리 합니다.
-
전이 장기의 수확
- Pentobarbital의 과다와 함께 마우스를 안락사, 그들의 가슴이 위, 부드럽게, 폐를 꺼내 열고 PBS로 그들을 씻어. 폐 전이 foci 투명 화이트는 형태학 상으로 다른 하 고 정상적인 핑크 폐 조직에서 구별할 수는 요동으로 확인할 수 있습니다.
- H & E 염색 하 여 전이 확인 하기 위해 4 %paraformaldehyde 폐를 넣어.
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결과
성공적인 주입으로 젖꼭지를 한 백색 투명 플랫 영역 후에 둥근 표면 밖으로 센터 (그림 1) 관찰 될 수 있다. 기본 종양 성장 종양 볼륨 및 생활 종양에 의해 측정 될 수 있다 세포 생물 발광 (그림 2). 종양 크기와 총 속 절제 하기 전에 실험 기간 동안 증가 했다. 초기 단계에서 전이 없는 2 차 종양 발생 했습니다 또는 기본 종양의 강한 발광 신호 약한 신호를 가진 작은 전이 foci의 검출을 방해 하기 때문에 찾을 수 없습니다. 절제, 후 먼 장기의 전이성 foci에서 발광 신호 감지 고 분석 될 수 있습니다. 기본 유 방 종양과 폐 섹션의 형태는 신생 용기 표시 CD31 microvessel 밀도 (MVD) (그림 3)와 함께 종양을 얼룩에 의해 조사 하는 동안 H & E 염색, 함께 공부 했...
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토론
이 연구에 사용 된 셀은 4T1-luc2, murine 트리플 부정적인 유방암 세포 luciferase 라벨와 그들의 매우 침략 적 자연2,19 때문 마약의 antitumor 및 antimetastatic 효과 투자를 위한 유용한 도구입니다. . Luciferases, 차세대 셀에 안정적인 생활 종양을 나타내는 데 사용 됩니다 세포, 유 방 동맥에서 및 다른 먼 장기20. 경우에 따라 저 산소 증 및 발광 신호 및 기본 종양의 볼륨 감소에 종양 결과 내 영양소 결핍 아니다 발광 신호와 일치 종양 진행의 나중 단계에서. 세포 현 탁 액의 세포 orthotopic 주입 (예쁜)의 기술 또한 다른 유 방 암 세포 처럼 줄 인간 세포 MDA-MB-231 (되지 않은 데이터)으로 수행할 수 있습니다. 환경으로 유선이이 연구에서는 종양 microenvironment, 공부 하는 적절 한 동물 ...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81873111, 81673924, 81774039, 81503517), 감사 하 고 싶습니다 베이징 자연 과학 재단 (보조금 번호 7172095, 7162084, 7162083), 및의 베이징 병원의 쑤 쌰 재단 전통 중국의 술 (아니, 부여 xx201701). 우리 실험 연구 센터, 중국 과학원 중국 의료, 발광 이미지에서 교수 장 젠 리 우 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취기 | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | 마취 |
| In-Vivo 이미징 시스템 | PerkinElmer | IVIS Spectrum | 생물발광 측정에 사용됨 |
| isoflurane | Hebei yipin 화학 시약 회사 | O21400 | 마취 |
| 1 ml 주사기 | Becton,Dickinson 및 회사 | A257 | 세포 주입 |
| 디지털 캘리퍼스 | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | 부피 측정 |
| 트라마돌 | Mundipharma 회사 | - | 진통제 |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | 생물 발광 감지에 사용됩니다 |
| . 분화 클러스터(CD)에 대한 기본 항체 31 | Abcam | MVD 검출에 사용되는 ab28364 | |
| 헤마톡실린 및 에오신 염색 키트 | 베이징 Zhong Shan Jinqiao 생명공학 Co., 주식 회사. | ZLI-9615 | 조직학 |
| 제모 크림 | Veet | - | 제모 크림 |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | 안과 연 |
| 고 재봉 바늘 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | 봉합사 |
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재인쇄 및 허가
