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Developmental Biology

Vivo में भ्रूण और अपरा विकास के विश्लेषण के लिए उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58616
Automatic Translation
1, 2, 1
1Experimental Obstetrics and Gynecology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University, 2Institute of Molecular and Clinical Immunology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University

Summary

यहाँ हम vivo में चूहों में भ्रूण के विश्लेषण के लिए उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड की तकनीक का वर्णन. इस विधि के अनुवर्ती भ्रूण और अपरा मापदंडों के विश्लेषण के साथ ही गर्भावस्था भर में मातृ और भ्रूण रक्त के प्रवाह की अनुमति देता है ।

Abstract

अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मानव और पशु ऊतकों में अंग विसंगतियों और ट्यूमर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल एक व्यापक तरीका है । विधि गैर इनवेसिव, हानिरहित, और दर्द रहित है, और आवेदन आसान है, तेजी से, और कहीं भी किया जा सकता है, यहां तक कि मोबाइल उपकरणों के साथ. गर्भावस्था के दौरान, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मानक बारीकी से भ्रूण के विकास की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तकनीक अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध (IUGR), कम और दीर्घकालिक दोनों मां और भ्रूण के लिए स्वास्थ्य परिणामों के साथ एक गर्भावस्था जटिलताओं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । IUGR की प्रक्रिया को समझना प्रभावी चिकित्सकीय रणनीतियों के विकास के लिए अपरिहार्य है ।

अल्ट्रासाउंड प्रणाली इस पांडुलिपि में इस्तेमाल एक अल्ट्रासाउंड उपकरण छोटे जानवरों के विश्लेषण के लिए उत्पादित है और गर्भावस्था अनुसंधान सहित विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां हम के लिए प्रणाली के उपयोग का वर्णन vivo प्राकृतिक खूनी (NK) सेल से भ्रूण का विश्लेषण में/(एम सी)-मां की कमी है कि विकास-प्रतिबंधित पिल्ले को जंम दे । प्रोटोकॉल प्रणाली की तैयारी भी शामिल है, पहले और माप के दौरान चूहों की हैंडलिंग, और बी-मोड, रंग डॉपलर मोड, और पल्स लहर डॉपलर मोड का उपयोग. भ्रूण का आकार, अपरा आकार, और भ्रूण के लिए रक्त की आपूर्ति का विश्लेषण किया गया । हम मध्य हमल के बाद से कम आरोपण आकार और NK/MC-कमी चूहों में छोटे अपरा पाया । इसके अलावा, एम सी/NK-कमी अनुपस्थित और भ्रूण Arteria umbilicalis(उमा) और एक ऊंचा प्रतिरोध सूचकांक में रिवर्स अंत डायस्टोलिक प्रवाह के साथ जुड़ा हुआ था । प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों का उपयोग संबंधित और गैर-संबंधित शोध विषयों के लिए आसानी से किया जा सकता है ।

Introduction

अल्ट्रासाउंड मानव कान की श्रव्य सीमा से ऊपर आवृत्तियों के साथ ध्वनि तरंगों है, के बारे में 20 kHz1से अधिक. चमगादड़, वेल्स, डॉल्फिन2,3, चूहों4, चूहों5, और माउस lemurs6 सभी उपयोग अल्ट्रासाउंड अभिविंयास या संचार के लिए की तरह जानवरों । मानव कई तकनीकी और चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासाउंड का लाभ ले लो । एक अल्ट्रासाउंड डिवाइस ध्वनि लहर बनाने के लिए और वितरित और संकेत का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम है । अल्ट्रासाउंड एक बाधा मुठभेड़ों, ध्वनि प्रतिबिंबित होता है, अवशोषित या इसे माध्यम से जा सकते हैं । एक इमेजिंग विधि के रूप में अल्ट्रासाउंड के आवेदन, सोनोग्राफी कहा जाता है, हृदय की तरह मानव या पशु चिकित्सा में जैविक ऊतकों के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है (इकोकार्डियोग्राफी)7,8, फेफड़े9, थायराइड ग्रंथि10 , गुर्दे11, और मूत्र और प्रजनन पथ12,13; पित्ताशय की पथरी का पता लगाने14 और ट्यूमर15; और रक्त वाहिकाओं या अंगों के छिड़काव का मूल्यांकन16,17. अल्ट्रासाउंड गर्भावस्था के दौरान जंम के पूर्व देखभाल में एक मानक विधि है, और भ्रूण विकास विकलांग या विकलांगता जल्दी पहचाना जा सकता है । विशेष रूप से, एक भ्रूण के विकास बारीकी से नियमित अंतराल पर नजर रखने के लिए एक संभव IUGR पहचान है । अंत में, भ्रूण रक्त प्रवाह पर नजर रखी जा सकता है, के रूप में यह विकास प्रतिबंधों18,19,20,21बिंदु कर सकते हैं ।

रेडियोग्राफी जैसे अंय तरीकों की तुलना में अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का एक प्रमुख लाभ है ध्वनि harmlessness ऊतकों का विश्लेषण किया जा करने के लिए । यह आसान और तेजी से विधि गैर इनवेसिव, दर्द रहित है, और कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है । एक अल्ट्रासाउंड डिवाइस के प्रारंभिक परिव्यय महंगा है; हालांकि, उपभोज्य आवश्यक सामग्री सस्ते हैं । इस पांडुलिपि में इस्तेमाल किया अल्ट्रासाउंड प्रणाली पशु मॉडल (यानी, चूहों और मछली) की एक सीमा के लिए उपयुक्त है, जबकि मनुष्यों के लिए एक अल्ट्रासाउंड डिवाइस की एक आवृत्ति की आवश्यकता है 3-15 मेगाहर्ट्ज, एक आवृत्ति की 15-70 मेगाहर्ट्ज चूहों के लिए आवश्यक है.

वर्तमान पांडुलिपि बी मोड, रंग डॉपलर मोड, और पल्स-वेव डॉपलर मोड के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है । विवरण के साथ ही प्रदर्शन, डेटा प्राप्ति और भंडारण चूहों की तैयारी भी शामिल है. यह विधि सभी गर्भावधि दिनों में विभिन्न माउस उपभेदों के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है और भ्रूण और अपरा विकास के साथ ही मातृ और भ्रूण रक्त मापदंडों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, सभी आवेदनों हमारे अध्ययन के आधार पर समझाया जाता है गर्भवती एम सी/NK-कमी और नियंत्रण चूहों को रोजगार ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD" से अनुमोदित किया गया है ।

1. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. मेट 6से 8-सप्ताहीय महिला mc-आपुर्ति C57BL/6J-Cpa3Cre/+ (Cpa3Cre/+) चूहों और MC-पर्याप् C57BL/6J-Cpa3+/+ (कॉलोनी नियंत्रण; बालब/c नर के साथ Cpa3+/
  2. योनि प्लग की पुष्टि के बाद हमल दिन (gd) 0 को परिभाषित करने और प्लग पुष्टि के बाद तुरंत महिलाओं का इलाज.
    नोट: एक प्लग महिला के योनि छिद्र में पुरुष के शुक्राणु है ।
    1. intraperitoneally Cpa3+/+ महिलाओं में पंजाब के µ एल इंजेक्षन २५०
    2. इंजेक्शन २५० µ एल के विरोधी CD122 (०.२५ मिलीग्राम) intraperitoneally में एम सी की कमी Cpa3Cre/
      नोट: विरोधी के ०.२५ मिलीग्राम का एक इंजेक्शन CD122 है परिधीय NKs और uNKs में MC-कमी Cpa3Cre/+ पहले22वर्णित के रूप में महिलाओं ।
  3. gd5 तक रुको ।
    नोट: gd5 पर, वहां आरोपण विश्लेषण के लिए जल्दी संभावना है ।
    1. अल्ट्रासाउंड विश्लेषण के लिए 2-5 चरणों के साथ आगे बढ़ें ।
  4. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग gd5, 8, 10, 12, और 14 पर निष्पादित करें ।

2. अल्ट्रासाउंड प्रणाली की तैयारी

  1. सिस्टम को चालू करें (चित्र 1a; बाईं साइट पर पीछे और कंप्यूटर स्टैंडबाय पर मुख्य पावर), गरम प्लेटफ़ॉर्म (संख्या 1b; नियंत्रण पैड पर), और जेल गर्म (चित्रा 1C) ।
    नोट: अल्ट्रासाउंड जेल लगभग ०.५ एच के लिए गर्म करने की जरूरत है ।
  2. सुनिश्चित करें कि isoflurane इकाई पर्याप्त (चित्रा 1 डी) भरना है ।
  3. ब्राउज़र में किसी मौजूदा अध्ययन में कोई नया अध्ययन या नई श्रृंखला खोलें । अध्ययन जानकारी विंडो में सभी आवश्यक जानकारी (मालिक, अध्ययन का नाम, श्रृंखला का नाम, पशु डेटा) भरें । ठीकक्लिक करें ।
  4. ठीकक्लिक करने के बाद, सुनिश्चित करें कि b-मोड इमेजिंग विंडो प्रकट होती है और b-मोड में इमेजिंग स्वचालित रूप से शुरू हो जाती है ।

3. माउस हैंडलिंग

  1. माउस का Anesthetization
    1. पछाड़ना बॉक्स (चित्रा 1E) में माउस प्लेस, बॉक्स बंद करें, पछाड़ना बॉक्स के लिए isoflurane ट्यूब खोलने के लिए, और isoflurane पर बारी (एकाग्रता ३.५%) ।
    2. जब माउस anesthetized है, कम (१.५% एकाग्रता के लिए) और हीटिंग प्लेटफॉर्म की दिशा में ट्यूब खोलने और पछाड़ना बॉक्स के प्रवाह को बंद करके isoflurane प्रवाह अनुप्रेषित ।
      नोट: पर्याप्त संज्ञाहरण तक पहुँचने के लिए, माउस अब आगे बढ़ रहा है के बाद एक अतिरिक्त 10 एस रुको.
    3. एक पृष्ठीय स्थिति में गर्म मंच (चित्रा 1F) को नॉकआउट बॉक्स से जल्दी से माउस स्थानांतरण, और धीरे से मंच के शीर्ष पर स्थित संज्ञाहरण नाक ट्यूब में अपनी नाक की स्थिति ।
  2. निर्धारण, depilation, और मापने के लिए माउस की तैयारी
    1. सूखी आंखों को रोकने के लिए माउस के प्रत्येक आंख में नेत्र संरक्षण क्रीम प्लेस ।
    2. गर्म मंच (चित्रा 1F) पर चार तांबे क्षेत्रों में से प्रत्येक पर इलेक्ट्रोड जेल की एक बूंद प्लेस ।
    3. हीटिंग प्लेटफॉर्म के इलेक्ट्रोड जेल-लेपित क्षेत्रों पर सर्जिकल टेप के साथ पंजे ठोकर ।
    4. ईसीजी की जांच करें [इष्टतम मूल्य = 450-550 बीट्स/मिनट (BPM)] और हर समय श्वसन फिजियोलॉजी ।
      नोट: एक गुदा जांच का उपयोग करके, शरीर का तापमान माप संभव है, लेकिन आवश्यक नहीं है ।
    5. माउस के पेट में लोमनाशक क्रीम लगाएं, एक कॉटन झाड़ू से क्रीम रगड़ें और करीब 1 मिनट तक रुकें । क्रीम को पानी से लथपथ सेक कर निकाल लें । इस कदम को दोहराएं नहीं तो सभी बाल हो गए हैं ।
    6. depilated त्वचा पर पूर्व गर्म अल्ट्रासाउंड जेल लागू होते हैं ।

4. माप और छवियों और वीडियो के अधिग्रहण

  1. हाथ में transducer (चित्रा 1G) पकड़ो या यह होल्डिंग डिवाइस में दबाना (चित्राa; होल्डिंग डिवाइस अनुशंसित है) ।
  2. transducer के साथ मूत्राशय की पहचान और संदर्भ बिंदु के रूप में इस्तेमाल करते हैं । पेट की बाईं और सही साइटों के लिए transducer चाल प्रत्यारोपण का पता लगाने के लिए ।
  3. बी-मोड 2 डी ग्रेस्केल छवि में संरचनात्मक संरचनाओं के दृश्य के लिए
    1. transducer या हीटिंग प्लेटफ़ॉर्म तालिका जहाँ माउस जब तक कि पहले आरोपण स्क्रीन पर अपने सबसे बड़े आकार पर दिखाई दे रहा है, ले जाएँ ।
      1. छवि लेबल का चयन करें और पूरे आरोपण माप के लिए एक cineloop स्टोर करने के लिए एकल फ्रेम, या सिने स्टोर को स्टोर करने के लिए एक नाम, या फ्रेम स्टोर (नाम के बिना भंडारण) डालें ।
    2. अपरा को एक ऐसी स्थिति में लाने के लिए transducer या तालिका ले जाएँ जहाँ उमा में रक्त का प्रवाह दिखाई दे रहा हो. अपरा मापन के लिए एक एकल फ़्रेम या cineloop (चरण 4.3.1.1 देखें) संग्रहीत करना.
      नोट: अपरा मापन gd10 आगे से संभव हैं ।
    3. एक ही विधि का उपयोग सभी प्रत्यारोपण के साथ जारी रखें ।
  4. रंग डॉपलर मोड कल्पना और रक्त प्रवाह की दिशा निर्धारित करने के लिए
    1. रंग बटन दबाएं ।
    2. रंग बॉक्स (इस क्षेत्र में, संकेत दिखाई दे रहा है) ट्रैकबॉल का उपयोग करके आवश्यक स्थिति के लिए ले जाएँ । यदि आवश्यक हो, तो अद्यतन दबाकर बॉक्स का आकार बदलें और ट्रैकबॉल (दाईं ओर/ऊपर की तरफ = बड़ा; बाईं ओर करने के लिए/ जब बॉक्स में सही आकार हो, तो चयन करेंदबाएं ।
    3. चरण 4.3.1.1 में बताए गए अनुसार एकल फ़्रेम या cineloops संग्रहीत करना.
  5. पल्स-वेव (पीडब्लू) डॉपलर मोड Arteria uterina (गर्भाशय धमनी, UA) और उमा में जहाजों के माध्यम से रक्त के प्रवाह को बढ़ाता है
    1. रंग डॉपलर अधिग्रहण में ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएँ.
      नोट: UA मूत्राशय के लिए caudal स्थित है, और उमा भ्रूण और अपरा के बीच स्थित है ।
    2. पीडब्लूदबाएं, और एक डैश्ड रेखा दिखाई देगी । ब्याज की रक्त वाहिका के लिए इस लाइन हटो और रक्त प्रवाह के साथ लाइन में "डॉपलर कोण" घुंडी का उपयोग कर लाइन के कोण समायोजित करें । प्रेस अद्यतन।
      नोट: रक्त प्रवाह और transducer की दिशा के बीच कोण सभी पशुओं में संगत होना चाहिए, विशेष रूप से जब ६० ° से अधिक के कोण का उपयोग कर (यहां, यूएएस के लिए ७० ° और ऊमस के लिए ४५ ° इस्तेमाल किया गया) ।
    3. पीडब्लू डॉपलर अधिग्रहण विंडो में interview डॉपलर लाइनों के एक cineloop की दुकान.

5. डेटा प्राप्ति की समीक्षा और परिष्करण और एक श्रृंखला की बचत

  1. डेटा की समीक्षा करने के लिए, अध्ययन प्रबंधन दबाएँ. रूचि की थंबनेल छवि पर स्क्रॉल करें और अद्यतनडबल-क्लिक करे ।
  2. प्रेस पहले अध्ययन प्रबंधन फिर ब्राउज़र विंडो में बंद करने के लिए डेटा अधिग्रहण खत्म और एक रिकॉर्ड श्रृंखला बचाने के लिए ।
    नोट: एक श्रृंखला बंद करने के बाद, यह अब और इस श्रृंखला में फ्रेम या cineloops स्टोर करने के लिए संभव नहीं है.

6. डेटा की प्राप्ति के बाद माउस हैंडलिंग

  1. सूखी compresses की मदद से anaesthetized जानवर से जेल को हटा दें ।
  2. पंजे से सर्जिकल टेप सावधानी से निकालें ।
  3. बंद isoflurane ट्यूब (एकाग्रता 0%) ।
  4. gd5, 8, 10, और 12 पर अल्ट्रासाउंड विश्लेषण के बाद के साथ आगे बढ़ें ।
    1. 5 मिनट की एक ंयूनतम के लिए एक पिंजरे में अकेले जानवर प्लेस तो यह समय जाग और मालूम है ।
    2. माउस को वापस मूल पिंजरे में रखें ।
      नोट: जेल और सर्जिकल टेप को हटाने से पहले isoflurane को बंद न करें, क्योंकि चूहे बहुत जल्दी जाग जाते हैं (लगभग 20 s) isoflurane को बंद करने के बाद ।
  5. gd14 पर निम्नलिखित अल्ट्रासाउंड विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें ।
    1. मादा का बलिदान इससे पहले कि यह ग्रीवा अव्यवस्था से जाग । पशु खोलें, गर्भाशय निकालें, भ्रूण और अपरा को अलग करें, और भ्रूण और अपरा भार को मापने ।

7. डेटा की प्रतिलिपि बनाना और आयात करना

  1. किसी हार्ड डिस्क पर डेटा की प्रतिलिपि बनाने के लिए निर्यात करें पर क्लिक करके एक या अधिक श्रृंखलाएं चिह्नित करें और संग्रहण स्थान चुनें ।
  2. एक कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर खोलें और से कॉपी क्लिक करें और इस सॉफ्टवेयर में एक अध्ययन/श्रृंखला आयात करने के लिए हार्ड डिस्क से अध्ययन/
  3. सॉफ़्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

इस पांडुलिपि में प्रयुक्त अल्ट्रासाउंड प्रणाली के व्यक्तिगत घटकों चित्रा 1में दिखाया गया है । चित्रा 2 प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड gd5, 8, 10 में बी मोड में अधिग्रहीत छवियों से पता चलता है, और 12 (ख) और इसी आरोपण क्षेत्र माप परिणाम (एक), के एक महत्वपूर्ण कम आरोपण क्षेत्र का प्रदर्शन एंटी-CD122-स्वास्थ्यकर्मी Cpa3Cre/+ चूहों से gd10 के बाद.

चित्रा 3 एक आरोपण के एकल भागों से पता चलता है (decidua basalis, अपरा, भ्रूण) बी में अधिग्रहीत मोड (चित्रा 3ए) और conduced अपरा माप (क्षेत्र, मोटाई, व्यास) (चित्र बी1). अपरा मापन के परिणामस्वरूप एक काफी कम अपरा क्षेत्र (चित्रा 3ए), मोटाई (चित्र 3 बी), और व्यास (चित्रासी सी) विरोधी में-CD122-इलाज Cpa3Cre/+ चूहों WTs और gd10 पर gd12 की तुलना में. इसके विपरीत, अपरा क्षेत्र और व्यास gd14 पर समूहों के बीच तुलनीय थे, और मोटाई विरोधी में काफी वृद्धि हुई थी CD122-Cre पर WTs की तुलना में Cpa3gd14/

चित्रा 4 gd14 पर भ्रूण और अपरा वजन से पता चलता है । परिणाम एक काफी decreasedfetal वजन (फिगर 4a), तुलनीय अपरा वजन (चित्रा 4B) से पता चला, और काफी कम feto-अपरा सूचकांक (एफपीआई) (फिगर 4c) में विरोधी CD122-इलाज Cpa3Cre/+ चूहों WTs की तुलना में । चित्रा 5 एक WT माउस के यूए (चित्रा धारा3) और पीक सिस्टोलिक वेग (पीएसवी) (चित्रा 5B), अंत डायस्टोलिक वेग (EDV) (चित्रा 5C), और गणना की माप के एक प्रतिनिधि पीडब्लू डॉपलर छवि से पता चलता है प्रतिरोध सूचकांक (चित्रा 5d), जिससे सभी मूल्यों समूहों के बीच तुलनीय थे । चित्रा 6 gd14 में एक WT भ्रूण उमा की एक प्रतिनिधि रंग डॉपलर छवि से पता चलता है (चित्रा 6A) और प्रतिनिधि पीडब्लू डॉप्लर छवियों के साथ सामान्य, अनुपस्थित, या रिवर्स अंत डायस्टोलिक प्रवाह (फिगर घमण्ड) और PVS की माप (चित्रा 6C), EDV (figure 6D), सिस्टोलिक/डायस्टोलिक रेश्यो (figure6E), और रेजिस्टेंस इंडेक्स (फिगर 6F). एंटी-CD122-स्वास्थ्यकर्मी Cpa3Cre/+ चूहों के प्रतिरोध सूचकांक WT चूहों की तुलना में काफी बढ़ गया था.

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग प्रणाली । मुख्य नियंत्रण इकाई (A) हीटिंग प्लेटफॉर्म नियंत्रण पैड के साथ (B), जेल गर्म (सी), isoflurane नियंत्रण इकाई (D), पछाड़ना बॉक्स (ई), चार तांबे क्षेत्रों के साथ गर्म मंच (एफ; एफ .1), transducer (जी), और transducer होल्डिंग डिवाइस (एच) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: gd5, 8, 10, और 12 पर आरोपण क्षेत्रों की तुलना. (क) WT Cpa3 से आरोपण क्षेत्रों+/ + + पंजाबियों चूहों (चूहों n = 2-5, आरोपण n = 6-31 प्रति दिन) और MC/NK-कमी Cpa3Cre/+ + एंटी-CD122 चूहों (चूहों n = 3, आरोपण n = 8-16 प्रति दिन) पर gd5, 8, 10, और 12. परिणाम प्रत्येक एक आरोपण और मतलब के लिए व्यक्तिगत मूल्यों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकीय अंतर एक ख़राब t-परीक्षण (* * p < ०.०१, * * * p < ०.००१) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे । (ख) प्रतिनिधि Cpa3 से अल्ट्रासाउंड छवियां+/ + + gd5 में पंजाबियों चूहों (i), gd8 (द्वितीय), gd10 (iii), और gd12 (iv) । जी. डी., हमल दिवस; WT, जंगली प्रकार; एम सी, मस्तूल सेल; NK, प्राकृतिक खूनी सेल । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन23से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: gd10, 12, और 14 पर अपरा माप । (एक) decidua basalis, अपरा, और भ्रूण दिखा gd10 में एक WT आरोपण के प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवि । (ख) अपरा मोटाई (मोटी) और अपरा व्यास (व्यास) दिखा gd12 में एक WT आरोपण के प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवि । अपरा क्षेत्र (C), अपरा मोटाई (D), और अपरा व्यास (e) से WT Cpa3+/ + + पंजाबियों चूहों (चूहों n = 3-5, अपरा n = 12-22 प्रति दिन) और MC/NK-कमी Cpa3Cre/+ + विरोधी CD122 चूहों (चूहों n = 3-4, अपरा n = 8-14 प्रति दिन) पर gd10, 12, और 14. परिणाम प्रत्येक एक अपरा और मतलब के लिए व्यक्तिगत मूल्यों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकीय अंतर एक ख़राब t-परीक्षण (* p < ०.०५, * * p < ०.०१) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे । जी. डी., हमल दिवस; WT, जंगली प्रकार; मोटी, मोटाई; दीया, व्यास; एम सी, मस्तूल सेल; NK, प्राकृतिक खूनी सेल । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन23से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: gd14 में भ्रूण और अपरा वजन माप और feto-अपरा सूचकांक (एफपीआई) । भ्रूण भार (क), अपरा भार (ख), और FPIs (ग) WT Cpa3 की संतति से +/ + + पंजाबियों चूहों (चूहों n = 4, भ्रूण/अपरा n = ३५) और MC/NK-आपुर्ति Cpa3Cre/+ + विरोधी CD122 चूहों (चूहों n = 3, भ्रूण/अपरा n = 28) पर gd14. परिणाम व्यक्तिगत मूल्यों और मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकीय अंतर ख़राब t-परीक्षण (* p < ०.०५, * * p < ०.०१) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे । जी. डी., हमल दिवस; WT, जंगली प्रकार; एम सी, मस्तूल सेल; NK, प्राकृतिक खूनी सेल । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन23से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: gd10 पर गर्भाशय धमनी वेग का विश्लेषण । (क) प्रतिनिधि पल्स-वेव डॉपलर छवियों से WT Cpa3+/ + + पंजाबियों पीएसवी और EDV दिखा रहा है चूहों. पीएसवी (ख), EDV (ग), और प्रतिरोध सूचकांक (घ) गर्भाशय धमनियों के Cpa3 से +/ + + पंजाब (एन = 3) और Cpa3Cre/+ + विरोधी CD122 (एन = 3) चूहों गर्भावस्था के gd10 पर । डेटा SEM के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण मान-Whitney यू परीक्षण का उपयोग किया गया था । जी. डी., हमल दिवस; WT, जंगली प्रकार; एम सी, मस्तूल सेल; NK, प्राकृतिक खूनी सेल; पीएसवी, पीक सिस्टोलिक वेग; EDV, अंत डायस्टोलिक वेग. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन23से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: gd14 पर नाल धमनी वेग का विश्लेषण । (एक) जीडी 14 में एक भ्रूण उमा के प्रतिनिधि रंग डॉपलर छवि । (ख) प्रतिनिधि पल्स-वेव डॉपलर छवियों से Cpa3+/ + + पंजाब (i) और Cpa3Cre/+ + विरोधी CD122 (ii, iii) चूहों, सामान्य अंत डायस्टोलिक प्रवाह दिखा (i), अनुपस्थित अंत डायस्टोलिक प्रवाह (द्वितीय), या रिवर्स अंत डायस्टोलिक प्रवाह (iii). पीएसवी (C), EDV (D), सिस्टोलिक/डायस्टोलिक अनुपात (E), और प्रतिरोध सूचकांक (च) Cpa3 से भ्रूण की ऊमस के +/ + + पंजाबियों (चूहों n = 3, उमा माप n = 7) और Cpa3Cre/+ + विरोधी CD122 (चूहों n = 3, उमा माप n = 10) चूहों पर gd14. डेटा SEM के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण एक ख़राब t-परीक्षण (* p < ०.०५) का उपयोग करके किया गया था । उमा, नाल धमनी; जी. डी., हमल दिवस; पीएसवी, पीक सिस्टोलिक वेग; EDV, अंत डायस्टोलिक वेग. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन23से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हमारे अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करना, हम पर gd10 से एम सी/NK की कमी माताओं में भ्रूण विकास प्रतिबंध का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, gd10 और 12 पर, हम कम अपरा आयामों को मनाया, और gd14 में अनुपस्थिति या ऊमस के कुछ भ्रूण के uMC में अंत डायस्टोलिक प्रवाह का पुनर्संस्करण/uNK-कमी चूहों । गरीब vascularization के इस हस्ताक्षर IUGR संकेत धमनियों का एक महत्वपूर्ण प्रतिरोध सूचकांक के साथ जुड़ा हुआ था । परिणाम गर्भावस्था और भ्रूण में uMCs और uNKs की महत्वपूर्ण भूमिका की पुष्टि अच्छी तरह से किया जा रहा है और IUGR के पाठ्यक्रम को समझने में ।

प्रोटोकॉल gd5 (आरोपण के बाद) से हर हमल दिन में लागू होता है । वहां प्रोटोकॉल है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । सबसे पहले, बालों को हटाने सावधानी से किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, depilation क्रीम के साथ अत्यधिक संपर्क त्वचा जलन पैदा कर सकता है । हालांकि, अपूर्ण बालों को हटाने के लिए स्क्रीन पर एक छाया के रूप में दिखाई व्यवधान संकेत सुराग । एक अपर्याप्त संकेत के लिए एक और कारण (छाया या दानेदार चित्र) भी जेल की एक भी कम राशि माउस और अल्ट्रासाउंड बीम के बीच रखा जा सकता है । हमारे अनुभव में, बल्कि जेल की एक उच्च राशि (लगभग 10 मिलीलीटर) पर्याप्त संकेत दृश्यता के लिए आवश्यक है । दूसरा, 2 डी माप किसी भी तरह अशुद्धि से ग्रस्त हो सकता है । प्रत्यारोपण के बीच माप मतभेदों को कम करने के लिए, हम सबसे बड़ा उपलब्ध आकार के उपयोग की सलाह देते हैं जब आरोपण घेरना. सटीक अपरा माप के लिए सभी आरोपण एक तरह से तैनात थे जिसमें उमा का रक्त प्रवाह देखा जा सकता था । इसके अतिरिक्त, आदेश में गलतियों के स्रोतों को कम करने के लिए, माप हमेशा एक ही ऑपरेटर द्वारा किया जाना चाहिए । तीसरा, नाड़ी तरंग डॉपलर माप के लिए, यह रक्त प्रवाह की दिशा और अल्ट्रासाउंड बीम के बीच कोण को देखने के लिए महत्वपूर्ण है । एक भी-उच्च कोण या एक ही प्रयोग में जानवरों के बीच विभिन्न कोणों गलत वेग माप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ध्यान भी महिलाओं के दोहराव anesthetization के जोखिम के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । मां के लिए इस जोखिम और तनाव को कम करने के लिए, अल्ट्रासाउंड माप हर दूसरे दिन से अधिक नहीं किया जाना चाहिए ।

गर्भावस्था के दौरान प्रासंगिक गर्भावधि दिनों में भ्रूण का पालन करने की संभावना अल्ट्रासाउंड प्रौद्योगिकी का एक बड़ा फायदा है । अलग गर्भावस्था के चरणों में चूहों त्याग के विपरीत, प्रौद्योगिकी हमें व्यक्तिगत गर्भवती चूहों के सटीक अनुदैर्ध्य विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है । इस ताकत के बावजूद व्यवस्था की कुछ सीमाएं हैं, जिन पर विचार होना चाहिए । उदाहरण के लिए, भ्रूण गर्भावस्था के दौरान स्थितियों को बदल सकते हैं । इसलिए, यह कुछ डेटा अलग समय पर व्यक्तिगत भ्रूण के लिए प्राप्त सेट आवंटित करने के लिए मुश्किल हो सकता है । इसके अतिरिक्त, कई बार बाद में कुछ भ्रूण पर नजर रखने के लिए संभव नहीं है, के रूप में मैं) उनकी स्थिति को बीम के साथ तक पहुंचने के लिए मुश्किल हो सकता है, द्वितीय) भ्रूण स्क्रीन फिट करने के लिए बहुत बड़ा हो सकता है, या iii) वे आंत के नीचे छिपा हो सकता है । माउस तनाव पर निर्भर करता है, पूरे आरोपण माप gd12 या gd14 तक संभव हैं । बाद में, भ्रूण के केवल एकल अंगों, दिल सहित, मापा जा सकता है और दर्ज की गई । पूरे आरोपण ही बाद में गर्भावस्था के चरणों में बहुत बड़ा है के लिए स्क्रीन में फिट बैठते हैं ।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग है (चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और कंप्यूटर टोमोग्राफी के साथ साथ) केवल उपलब्ध विधि अलग गर्भावधि पर कई जानवरों का त्याग किए बिना गर्भावस्था के दौरान संकेत मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए दिनों. यह डॉपलर इमेजिंग के लिए विशेष रूप से सच है, जो केवल सही रक्त प्रवाह और दिशा का मूल्यांकन करने में सक्षम तरीका है (लाल = अल्ट्रासाउंड बीम की दिशा में प्रवाह; नीला = अल्ट्रासाउंड बीम के विपरीत दिशा में प्रवाह) । पल्स-वेव डॉपलर इमेजिंग के दौरान, अल्ट्रासाउंड बीम ऊतक द्वारा लौटाए जाते हैं और रक्त प्रवाह24के बारे में वेग की जानकारी प्रदान कर रहे हैं कि कई दालों बाहर भेजता है.

अल्ट्रासाउंड के रूप में खुद को मां और भ्रूण के लिए हानिरहित होने लगता है, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग पूरी तरह से गर्भावस्था के अनुसंधान के लिए अनुकूल है । फिर भी, इस पांडुलिपि में वर्णित तरीके कई अंय अनुसंधान क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से; उदाहरण के लिए, सिस्टम भी 3 डी माप, दृश्य और समय पर ऊतक आंदोलन के ठहराव के लिए अनुमति देता है, ट्यूमर में रक्त के प्रवाह के दृश्य, सेल की सतह पर, रक्त दबाव माप, और अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इमेजिंग साधन कंपनी के लिए बहुत धंयवाद (विशेष रूप से Magdalena Steiner, Katrin Suppelt, और सैंड्रा मेयेर) उनके सुखद और तेजी से समर्थन के लिए और इमेजिंग प्रणाली और इसके उपयोग के विषय में हमारे सभी सवालों का जवाब देने के लिए तुरंत और पूरी तरह से । हम प्रोफेसर हंस-Reimer Rodewald और डॉ Thorsten Feyerabend (DKFZ हीडलबर्ग, जर्मनी) Cpa3 कॉलोनी प्रदान करने के लिए आभारी हैं । इसके अतिरिक्त, हम Stefanie Langwisch, जो माउस कालोनियों के प्रभारी और जो चित्र 1 में तस्वीरें उत्पंन धंयवाद ।

काम और इमेजिंग प्रणाली को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया A.C.Z. (ZE526/6-1 और AZ526/6-2) कि DFG प्राथमिकता कार्यक्रम में एंबेडेड परियोजनाओं थे १३९४ "स्वास्थ्य और रोग में मस्तूल कोशिकाओं."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb) BioLegend 123204 Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System  FujiFilm VisualSonics Inc. Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software  FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane Baxter PZN: 6497131
Electrode gel Parker 12_8
Surgical tape 3M Transpore 1527-1
Eye cream Bayer PZN: 1578675
Cotton tipped applicators Raucotupf 11969 100 pieces
Depilatory cream Reckitt Benckiser 2077626
Compresses Nobamed Paul Danz AG 856110 10 x 10 cm
Ultrasound gel Gello GmbH 246000

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References

  1. Abramowicz, J. S., Kremkau, F. W., Merz, E. Ultraschall in der Geburtshilfe: Kann der Fötus die Ultraschallwelle hören und die Hitze spüren? Ultraschall in der Medizin. 33 (3), Stuttgart, Germany. 215-217 (1980).
  2. Jones, G. Echolocation. Current Biology. 15 (13), R484-R488 (2005).
  3. Simmons, J. A. The sonar receiver of the bat. Annals of the New York Academy of Sciences. 188, 161-174 (1971).
  4. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). Public Library of Science ONE. 12 (12), e0188647 (2017).
  5. Wöhr, M., Seffer, D., Schwarting, R. K. W. Studying Socio-Affective Communication in Rats through Playback of Ultrasonic Vocalizations. Current Protocols in Neuroscience. 75, 1-8 (2016).
  6. Hasiniaina, A. F., et al. High frequency/ultrasonic communication in a critically endangered nocturnal primate, Claire's mouse lemur (Microcebus mamiratra). American Journal of Primatology. , e22866 (2018).
  7. Yeo, L., Romero, R. Color and power Doppler combined with Fetal Intelligent Navigation Echocardiography (FINE) to evaluate the fetal heart. Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. 50 (4), 476-491 (2017).
  8. Teichholz, L. E. Echocardiography in valvular heart disease. Progress in Cardiovascular Diseases. 17 (4), 283-302 (1975).
  9. Zechner, P. M., et al. Lungensonographie in der Akut- und Intensivmedizin. Der Anaesthesist. 61 (7), 608-617 (2012).
  10. Blank, W., Schuler, A. Sonografie der Schilddrüse - Update 2017. Praxis. 106 (12), 631-640 (2017).
  11. Hansen, K. L., Nielsen, M. B., Ewertsen, C. Ultrasonography of the Kidney: A Pictorial Review. Diagnostics. 6 (1), Basel, Switzerland. (2015).
  12. Older, R. A., Watson, L. R. Ultrasound anatomy of the normal male reproductive tract. Journal of Clinical Ultrasound. 24 (8), 389-404 (1996).
  13. Reeves, J. J., Rantanen, N. W., Hauser, M. Transrectal real-time ultrasound scanning of the cow reproductive tract. Theriogenology. 21 (3), 485-494 (1984).
  14. Sharma, M., Somani, P., Sunkara, T. Imaging of gall bladder by endoscopic ultrasound. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 10 (1), 10-15 (2018).
  15. Weskott, H. -P. Ultraschall in der Diagnostik maligner Lymphome. Der Radiologe. 52 (4), 347-359 (2012).
  16. Shirinifard, A., Thiagarajan, S., Johnson, M. D., Calabrese, C., Sablauer, A. Measuring Absolute Blood Perfusion in Mice Using Dynamic Contrast-Enhanced Ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (8), 1628-1638 (2017).
  17. Quaia, E. Assessment of tissue perfusion by contrast-enhanced ultrasound. European Radiology. 21 (3), 604-615 (2011).
  18. Saw, S. N., Poh, Y. W., Chia, D., Biswas, A., Zaini Mattar, C. N., Yap, C. H. Characterization of the hemodynamic wall shear stresses in human umbilical vessels from normal and intrauterine growth restricted pregnancies. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2018).
  19. Kessler, J., Rasmussen, S., Godfrey, K., Hanson, M., Kiserud, T. Fetal growth restriction is associated with prioritization of umbilical blood flow to the left hepatic lobe at the expense of the right lobe. Pediatric Research. 66 (1), 113-117 (2009).
  20. Laurin, J., Lingman, G., Marsál, K., Persson, P. H. Fetal blood flow in pregnancies complicated by intrauterine growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 69 (6), 895-902 (1987).
  21. Arduini, D., Rizzo, G., Romanini, C., Mancuso, S. Fetal blood flow velocity waveforms as predictors of growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 70 (1), 7-10 (1987).
  22. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
  23. Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. Simultaneous Ablation of Uterine Natural Killer Cells and Uterine Mast Cells in Mice Leads to Poor Vascularization and Abnormal Doppler Measurements That Compromise Fetal Well-being. Frontiers in Immunology. 8, 1913 (2017).
  24. Evans, D. H., Jensen, J. A., Nielsen, M. B. Ultrasonic color Doppler imaging. Interface Focus. 1 (4), 490-502 (2011).

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विकास जीवविज्ञान अंक १४१ भ्रूण विकास अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध अपरा मस्तूल कोशिकाओं प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं अल्ट्रासाउंड इमेजिंग बी मोड रंग डॉपलर मोड पल्स वेव डॉपलर मोड
<em>Vivo में</em> भ्रूण और अपरा विकास के विश्लेषण के लिए उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड
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Meyer, N., Schüler, T.,… More

Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo. J. Vis. Exp. (141), e58616, doi:10.3791/58616 (2018).

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