Summary
Her beskriver vi protokollen og implementering av Methyl-Seq, en epigenomic plattform, med en rotte modell for å identifisere epigenetic endringer forbundet med kronisk stress eksponering. Resultatene viser at rotte Methyl-Seq plattformen er stand til å oppdage metylering forskjellene som framkommer stress eksponering i rotter.
Abstract
Som genomer av flere dyr blir tilgjengelige, er det et økende behov for verktøy som kan fange dynamisk epigenetic endringer i disse dyremodeller. Rotta er en bestemt dyr der en epigenetic verktøyet kan utfylle mange farmakologiske og atferdsmessige studier å gi innsiktsfulle mekanistisk informasjon. Dette tilpasset vi SureSelect fange målsystemet (referert til som Methyl-Seq) rat, som kan vurdere DNA metylering nivåer over rotte genomet. Rotte design mål arrangører, CpG øyene, island bredder og GC-rike områder fra alle RefSeq gener.
For å implementere plattformen på en rotte eksperiment, ble Sprague Dawley hannrotter utsatt for kronisk variabel stress i 3 uker, hvoretter blodprøver ble samlet inn for genomisk DNA utvinning. Methyl-Seq biblioteker ble konstruert fra rotte DNA-prøver av klipping, kortet hemorroider, målet berikelse, bisulfite konvertering og multipleksing. Biblioteker var sekvensielt på en neste generasjons sekvensering plattform og den sekvensert lest ble analysert for å identifisere DMRs mellom DNA av stresset og trykklette rotter. Toppkandidat DMRs var uavhengig bekreftet av bisulfite pyrosequencing å bekrefte robustheten av plattformen.
Resultatene viser at rotte Methyl-Seq plattformen er et nyttig epigenetic verktøy som kan fange metylering endringer forårsaket av eksponering til stress.
Introduction
Fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering har ført til et vell av genomisk sekvenser for både modellen og ikke-modellen organismer. Tilgjengeligheten av slike sekvenser har muliggjort forskning på genetikk, komparativ genomikk og transcriptomics. For eksempel tilgjengelig genomisk sekvenser er svært nyttig for å justere sekvensering data fra ChIP-Seq eksperimenter som beriker DNA basert på tilknytningen histone modifikasjoner1eller bisulfite sekvensering, som måler DNA metylering av oppdage uracil dannet fra bisulfite konvertering unmethylated cytosines2. Imidlertid har det vært forsinkelser i gjennomføringen av epigenomic plattformer som innlemme tilgjengelig genomisk sekvensering data i sin design på grunn av kommenterte data artsspesifikke regulatoriske sekvenser som kan påvirke gen funksjon.
Spesielt er DNA metylering en av de mest studerte epigenetic endringene på DNA som kan utnytte tilgjengelige genomic data for å bygge en methylomic plattform. Et slikt eksempel er en matrise-basert plattform for menneskelig methylome3, som har vært mye brukt i ulike disipliner fra onkologi psykiatri4,5. Dessverre er lignende plattformer for ikke-menneskelige dyr modeller knappe, som det er nesten ingen brukte plattformer som har tatt nytte av genomisk sekvensen i sin første design.
En vanlig metode for å vurdere methylomic landskapet av ikke-menneskelige dyr modeller er redusert representasjon bisulfite sekvensering (RRBS)6. Denne tilnærmingen overvinner kostnaden for hele-genome bisulfite sekvensering at samtidig som et omfattende methylomic landskap, gir lavere Les grundig dekning kostnader og begrenset funksjonell informasjon i store gen-fattige områder i genomet2 . RRBS innebærer begrensning fordøye og størrelse-utvalg av genomisk DNA å berike for svært GC-rik sekvenser som CpG øyer som er ofte funnet i nærheten av genet arrangører og tenkte å spille en rolle i genet regulering7. Mens metoden RRBS er brukt i en rekke viktige studier, er sin avhengighet av begrensning enzymer ikke uten betydelige utfordringer og begrensninger. For eksempel er anriking av GC-rik sekvenser i RRBS helt avhengig av tilstedeværelse av bestemte sekvenser anerkjent av begrensning enzym og påfølgende størrelse av geleelektroforese. Dette betyr at alle genomic områder som ikke inneholder disse begrensning utelates under størrelse. Cross-species sammenligninger er også utfordrende hvis samme begrensning områder finnes i de samme loci blant de ulike artene.
En tilnærming til å overvinne begrensninger av RRBS er å bruke en berikelse metode som utnytter publiserte genomisk sekvensen i utformingen av plattformen. Matrise-basert menneskelige plattformen bruker primer sonder designet mot bestemte forbruksvarer for allel-spesifikke (CG vs TG etter bisulfite konvertering) mål avspenning og grunning forlengelsen. Designen reflekterer ikke bare tilgjengelige menneskelige genomisk sekvens, men eksperimentelt verifisert regulatoriske regioner fra flere tekstlinjer henvendelse, som kode og ENSEMBL8. Til tross for bred bruk i menneskelig methylomic undersøkelser finnes ikke en tilsvarende plattform for modell dyr. I tillegg steder til matrise-basert format betydelig begrensningen på areal tilgjengelig for probeplassering. I de siste årene, har forsøk vært gjort kombinere målet-spesifisitet by av fange sonde design og funksjonen høy gjennomstrømming av neste generasjons sekvensering. Slik bestrebelse resultert i sekvensering-baserte målet berikelse systemet for musen genomet (mus Methyl-Seq), som ble brukt til å identifisere hjernen-spesifikke eller glukokortikoid-indusert forskjeller i metylering9,10. Lignende plattformer for andre modellen og ikke-modellen dyr for å lette epigenomic forskning i disse dyrene.
Her viser vi gjennomføringen av denne romanen plattform for å gjennomføre methylomic analyse på rotte. Rotta har fungert som en viktig dyremodell i farmakologi, metabolisme, neuroendocrinology og virkemåte. For eksempel, er det et økende behov for å forstå de underliggende mekanismene som gir opphav til medikament toksisitet, fedme, stressrespons eller narkotikamisbruk. En høy gjennomstrømming plattform kan fange methylomic endringer forbundet med disse forholdene vil øke vår forståelse av mekanismer. Siden rotten genomet mangler fortsatt merknad for regulatoriske regioner, vi innlemmet ikke-redundant arrangører, CpG øyene, island bredder11, og tidligere identifisert GC-rik sekvenser i rotta Methyl-Seq plattform12.
For å vurdere vellykket design og implementering av SureSelect mål berikelse (generelt referert til som Methyl-Seq) plattform for rotte genomet, ansatt vi en rotte modell av kronisk variabel stress (CVS)13 å identifisere ulikt methylated områdene mellom trykklette og stresset dyr. Vår plattform tegning, protokollen og implementering kan være nyttig for etterforskerne som kanskje ønsker å gjennomføre en omfattende og upartisk epigenetic undersøkelse på en organisme som genomisk sekvensen er allerede tilgjengelig, men fortsatt dårlig kommentert.
Protocol
Alle eksperimentene ble avsluttet i samsvar og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer, inkludert institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Johns Hopkins School of Medicine.
1. dyr
- Få hannrotter ungdom Sprague-Dawley for 4 ukens av alderen. Huset dyrene i polykarbonat rotte bur i en temperatur- og luftfuktighet-kontrollerte rom på en 12 h lys 12t mørke syklus med lys utbruddet på 0600 h. gir til dyr med annonsen libitum tilgang til vann.
- Tillat rotter å acclimate for 1 uke å redusere stress forbundet med transport. Par-huset dyrene (N = 16) å utelukke isolasjon stress, og for 5 ukens av alderen, begynner variabelen kronisk stress (CVS) diett i 3 uker.
2. kronisk variabel Stress
- Administrere CVS diett morgen (9-11 AM) og en gang på ettermiddagen (1-3 PM) uregelmessig ganger å holde rutinen uforutsigbar. Innlemme over natten mild stressfaktorer. The CVS diett inkluderer: 1) 3 h i en tilbakeholdenhet sylinder; 2) 10 min svømme; 3) 3 h bur vippe 4) 1t langsom risting plattform; og 5) 1 h i 4 ° C kaldt rommet.
Merk: Overnatting stressfaktorer inkluderer sosiale stimlet (5 per bur), sosial isolasjon, våt sengetøy, maten begrensningen og opplyste. En typisk ukeplan av stress diett er gitt i tabell 1.
3. endokrine analyser
-
Bestemme nivåer av corticosterone (CORT) med halen blod (~ 50 mL) prøvetaking samlet på samme tid (9 AM) to ganger per uke i hele eksperimentet før CVS diett å etablere planlagte hormonnivået (dag 0), en gang i midten av den ukentlige CVS (dager 4,11, og 18), etter hver 7 dager av CVS (dager 7 og 14), og ved avslutningen av CVS (dag 21). Samle blodprøver før den daglige stress diett.
- Samle en siste trunk blodprøve i euthanasia (dag 25) for RIA og genomisk DNA utvinning.
- Sentrifuge alle blodprøver (600 x g, 4 ° C, 10 min) for å skille plasma fra blodet celler. Pipetter ut plasma (nedbryting) og lagre prøver på-80 ° C.
- Tine og bruk plasma for å bestemme CORT nivåer av radioimmunoassay (RIA). Kontroller at 3 ukers plasma CORT nivåene er opphøyet i stresset dyrene å bekrefte robust stress diett.
4. atferd
- Etter den CVS diett (dager 23-24), vurdere hvert dyr for angst-lignende oppførsel på forhøyet pluss labyrint (EPM)14.
- Bruker et videokamera, post dyrene på EPM-apparater for 300 s og score tid i midten, lukket armene, og åpne armer.
5. utforming av rotte Methyl-Seq
- Bruker UCSC genomet leseren, få ikke-redundant genomisk koordinater (rat Nov 2004 rn4 montering) for CpG øyene og øya bredder (± 1 kb flankert CpG øyer), arrangører (± 1 kb av hver TSS) av hver RefSeq genet og andre sekvenser som er tilgjengelige fra relevant litteratur.
Merk: For rotta Methyl-Seq, flere GC-rik sekvenser fra en tidligere matrise-basert metylering plattform lagt12. For regioner større enn 5 kbps, var vekslende regioner 500 bps samplet etterfulgt av 1 kbps som ble droppet. Siste rotte Methyl-Seq design består av 111 Mbps, 2,3 millioner forbruksvarer; og en gjennomsnittlig størrelse 594 bps. Det mål 228,800 unike loci. - Angi en kompilert liste over genomisk koordinater i en kommersielt tilgjengelig målet fange design programvare for aktuelle sonde design.
6. bygging av rotte Methyl-Seq biblioteket fra genomisk DNA
Merk: For å eliminere satsvise effekter, behandle flere eksempler på samme tid, og skalere opp master mikser tilsvarende. Ekstra DNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA utvinning kit. Kolonne - eller nedbør-baserte metoder begge gir høy kvalitet genomisk DNA (260/280 forholdet ~ 1.8). Bruk av fenol-baserte metoder er ikke anbefalt. Elute eller resuspend DNA i lav TE buffer (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8.0).
- Eksempel forberedelse
Merk: For hvert trinn ved hjelp av DNA-binding magnetiske perler, kontroller at perlene er acclimated til romtemperatur i minst 30 min og godt blandet før bruk.- Skjær DNA
- Bruk en fluorometer for å bestemme første double-strandet DNA konsentrasjon av hvert utvalg. Fortynne > 1 µg av gDNA til 50 µL med lav TE buffer (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8.0) i lav DNA-bindende microcentrifuge rør.
- Skråstille prøver ved en isotermiske sonicator (10% driftssyklus, 5 intensitet, 200 sykluser per briste, 6 sykluser av 60 s, frekvens feiende, 4 ° C).
- Vurdere kvaliteten på DNA ved hjelp av et geleelektroforese-basert system som måler DNA størrelse og antall.
Merk: Hvor DNA anbefalt er 1 µg eller 3 µg. Hvis det er begrenset starter materiale, laveste inn beløpet skal være > 500 ng, som lavere beløp vil påvirke kvantitet og kvalitet av bibliotekene generert.
- Reparasjon DNA ender.
- Bruk rotta Methyl-Seq kit for å forberede blanding slutten-reparasjon Master på is. Legge til 52 µL av hvert utvalg og ruge i en termisk cycler uten oppvarmet lokk (20 ° C i 30 min, 4 ° C vent).
Slutten-reparasjon Master Mix (per eksempel):
35,2 µL av vann
10 µL slutten reparasjon bufferen (10 x)
1.6 µL av dNTP Mix
1 µL av T4 DNA Polymerase
2 µL av Klenow DNA Polymerase
2.2 µL av T4 Polynucleotide Kinase - Rense prøver ved 180 µL av DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL av nylagde 70% etanol per prøve. Legge til 180 µL av perler i hvert utvalg og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Pellets perler, fjerne nedbryting og resuspend pellets i 200 µL av 70% etanol. Fjerne etanol gjenta vask en gang.
- Bruk en magnetisk plate pellets perler og fjerne etanol så mye som mulig. Tørr i en 37 ° C heatblock i 3-5 min til perle pellets er helt tørr. Resuspend i 44 µL nuclease uten vann og samle ca 42 µL av nedbryting.
Sluttpunkt: Etter reparasjon DNA, prøver kan bli forseglet og lagret på 20 ° C.
- Bruk rotta Methyl-Seq kit for å forberede blanding slutten-reparasjon Master på is. Legge til 52 µL av hvert utvalg og ruge i en termisk cycler uten oppvarmet lokk (20 ° C i 30 min, 4 ° C vent).
- Adenylate 3' ender.
- Forberede Adenylation Master Mix på is. Legge til 9 µL blanding hvert utvalg og ruge i en termisk cycler uten oppvarmet lokk (37 ° C i 30 min, 4 ° C vent).
Adenylation Master Mix (per eksempel):
5 µL Klenow bufferen
1 µL av dATP
3 µL av Klenow DNA Polymerase - Rense prøver med 90 µL av DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL av nylagde 70% etanol per prøve. Legge til 90 µL av perler i hvert utvalg og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Pellets perler, fjerne nedbryting og resuspend pellets i 200 µL av 70% etanol. Fjerne etanol gjenta vask en gang.
- Bruk en magnetisk plate pellets perler og fjerne etanol så mye som mulig. Tørr i en 37 ° C heatblock i 3-5 min til perle pellets er helt tørr. Resuspend i 35 µL nuclease uten vann og samle ca 33,5 µL av nedbryting.
- Forberede Adenylation Master Mix på is. Legge til 9 µL blanding hvert utvalg og ruge i en termisk cycler uten oppvarmet lokk (37 ° C i 30 min, 4 ° C vent).
- Ligate methylated kortet.
- Klargjør Ligation Master blandingen på is og legge 16,5 µL av blanding til hvert utvalg. Inkuber i en termisk cycler uten oppvarmet lokk (20 ° C i 15 min, 4 ° C vent).
Hemorroider Master Mix (per eksempel):
2,5 µL av vann
2,5 µL av Methyl-Seq denaturert Adapter
10 µL av T4 DNA Ligase Buffer (5 x)
1,5 µL av T4 DNA Ligase - Rense prøver med 90 µL av DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL av nylagde 70% etanol per prøve. Legge til 90 µL av perler i hvert utvalg og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Pellets perler, fjerne nedbryting og resuspend pellets i 200 µL av 70% etanol. Fjerne etanol gjenta vask en gang.
- Bruk en magnetisk plate pellets perler og fjerne etanol så mye som mulig. Tørr i en 37 ° C heatblock i 3-5 min til perle pellets er helt tørr. Resuspend i 22 µL nuclease uten vann og samle ca 22 µL av nedbryting. Vurdere kvaliteten med en bioanalyzer.
Merk: Hvis den totale mengden DNA er mindre enn 500 ng, skjær og prosessen ytterligere DNA før du fortsetter med neste trinn. Hvis den gjennomsnittlige DNA størrelsen ikke øker av mer enn 30 bps, kontrollere sikre at reagensene er ny, som T4 DNA polymerase, Klenow eller T4 ligase kan være gamle.
Sluttpunkt: Etter ligating denaturert kortet, prøver kan bli forseglet og lagret på 20 ° C.
- Klargjør Ligation Master blandingen på is og legge 16,5 µL av blanding til hvert utvalg. Inkuber i en termisk cycler uten oppvarmet lokk (20 ° C i 15 min, 4 ° C vent).
- Skjær DNA
- Hybridisering
- Overføre prøver til lav DNA-bindende microcentrifuge rør og bruk en oppvarmet vakuum konsentrator for å redusere utvalget volumet til mindre enn 3,4 µL. Rekonstituer prøver å 3,4 µL.
Merk: Konsentrat prøvene å ca ~ 3 µL å sikre prøvene blir fjernet fra vakuum konsentrator før all væsken fordamper. - Forberede hybridisering buffer ved romtemperatur og metyl-Seq blokk mikse på isen. Legge til 5,6 µL av Methyl-Seq blokk Mix hver prøve og ruge i termisk cycler (95 ° C i 5 min, 65 ° C i 2 minutter, 65 ° C vent).
Hybridisering Buffer (per eksempel):
6.63 µL av Methyl-Seq Hyb 1
0,27 µL av Methyl-Seq Hyb 2
2.65 µL av Methyl-Seq Hyb 3
3,45 µL av Methyl-Seq Hyb 4
Methyl-Seq blokk Mix (per eksempel):
2,5 µL av Methyl-Seq indeksering blokk 1
2,5 µL av Methyl-Seq blokk 2
0,6 µL av Methyl-Seq blokk 3 - Forberede RNase blokk Mix og fange biblioteket hybridisering blanding. Legge til 20 µL av fange biblioteket hybridisering Mix hver prøve og ruge ved 65 ° C i minst 16 timer.
RNase blokk Mix (per eksempel):
0,5 µL RNase blokk
1,5 µL av vann
Fange biblioteket hybridisering Mix (per eksempel):
13 µL av hybridisering Buffer
2 µL RNase blokk Mix
5 µL av rotte Methyl-Seq fange bibliotek
Merk: holde reaksjoner på 65 ° C når hybridisering blanding for å hindre ikke-spesifikk bindende. - Aliquot 50 µL av streptavidin magnetiske perler per prøve til en ny 8-vel stripe tube. Vask perler med 200 µL Methyl-Seq bindende bufferen. Bruke magnetisk plate pellets perler og fjerne nedbryting mellom hver vask for totalt 3 vasker. Etter siste vask, resuspend streptavidin perler i 200 µL Methyl-Seq bindende bufferen.
- Legg prøver å 200 µL av vasket streptavidin magnetiske perler og ruge ved romtemperatur for 30 min med en roterende blandebatteri. Mens miksing, aliquot 200 µL av Methyl-Seq vask Buffer 2 i tre eksemplarer brønner av en 96-brønns plate per eksempel og sted i en termisk cycler å forvarme til 65 ° C.
- Etter inkubasjon pellets streptavidin magnetiske perler bruker magnetisk plate og resuspend perler i 200 µL Methyl-Seq vask Buffer 1. Inkuber i 15 min ved romtemperatur. Bruk en magnetisk plate pellets og forkaste nedbryting.
- Vask perler 3 ganger med Methyl-Seq vaske bufferen 2: resuspend perle pellet i 200 µL vaske bufferen 2 (pre-oppvarmet i trinn 6.2.5.), ruge perler i termisk cycler (65 ° C, 10 min) og pellets perler. Kaste nedbryting etter hver vask med en magnetisk plate.
Merk: Opprettholde hybridisering reaksjoner på 65 ° C når du legger til vask Buffer 2 for å hindre ikke-spesifikk bindende. - Legge til 20 µL av Methyl-Seq elueringsbufferen vasket perler og ruge ved romtemperatur for 20 min. Bruk en magnetisk plate pellet perler og overføre supernatant til en ny stripe tube. Kaste perler.
Merk: Mens rugende, forberede bisulfite konvertering reagens.
- Overføre prøver til lav DNA-bindende microcentrifuge rør og bruk en oppvarmet vakuum konsentrator for å redusere utvalget volumet til mindre enn 3,4 µL. Rekonstituer prøver å 3,4 µL.
- Bisulfite konvertering
Merk: Utføre bisulfite konvertering av den eluted ssDNA ved hjelp av riktig reagenser og instruksjoner fra en kommersielt tilgjengelig bisulfite konvertering kit.- Legge til 130 µL forberedt bisulfite konvertering reagens nedbryting fra forrige trinn. Dele hver av 150 µL reaksjonene like i to brønner. Inkuber i en termisk cycler (64 ° C for 2,5 h, 4 ° C vent).
Merk: 150 µL reaksjonen er delt likt i to separate brønner å sikre homogen temperatur. Etter rugende 2,5 h, umiddelbart videre til neste trinn. - Binde å spinne kolonner ved å legge til 600 µL bindende bufferen og vaskes en gang med 100 µL av vaskebuffer. Sentrifuge kolonner (15.000 x g, 1 min) mellom alle bisulfite Konverteringstrinn og kast strømme gjennom.
- Desulphonate eksempler ved å legge 200 µL Desulphonation bufferen til kolonner. Inkuber ved romtemperatur for 15-20 min. Gjenta sentrifugering og kast strømme gjennom.
- Vask kolonner to ganger med 200 µL av vaskebuffer. Elute hvert utvalg ved å legge 10 µL av elueringsbufferen til kolonnen rugende for 3 min ved romtemperatur og sentrifugering (15.000 x g, 1 min). Gjenta elueringsrør trinn for totalt 20 µL.
- Forberede PCR reaksjon Master Mix 1 på is. Legge til 82 µL av hvert utvalg. Inkuber i en termisk cycler med følgende program.
PCR reaksjon Master Mix 1 (per eksempel):
30 µL av vann
50 µL av Methyl-Seq PCR Master Mix
1 µL av Methyl-Seq PCR1 Primer F
1 µL av Methyl-Seq PCR1 Primer R
Termisk Cycler Program:
Trinn 1, 1 syklus: 95 ° C 2 min
Scene 2, 8 sykluser: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
Scene 3, 1 syklus: 72 ° C 7 min
Trinn 4: 1 syklus: 4 ° C Hold - Rense prøver ved 180 µL av DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL av nylagde 70% etanol per prøve. Legge til 180 µL av perler i hvert utvalg og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Pellets perler, fjerne nedbryting og resuspend pellets i 200 µL av 70% etanol. Fjerne etanol gjenta vask en gang.
- Bruk en magnetisk plate pellets perler og fjerne etanol så mye som mulig. Tørr i en 37 ° C heatblock i 3-5 min til perle pellets er helt tørr. Resuspend i 21 µL nuclease uten vann og samle ca 19,5 µL av nedbryting.
- Legge til 130 µL forberedt bisulfite konvertering reagens nedbryting fra forrige trinn. Dele hver av 150 µL reaksjonene like i to brønner. Inkuber i en termisk cycler (64 ° C for 2,5 h, 4 ° C vent).
- Indeksering
- Forberede PCR reaksjon Master Mix 2 på is. Legge til 25,5 µL Master Mix 2 til hvert utvalg. Legg til 5 µL kommersielle indeksering primere for individuelle prøver og ruge i en termisk cycler.
PCR reaksjon Master Mix 2 (per eksempel):
25 µL methyl-Seq PCR Master Mix
0,5 µL methyl-Seq felles indeksering Primer
Termisk Cycler Program:
Trinn 1, 1 syklus: 95 ° C 2 min
Scene 2, 6 sykluser: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
Scene 3, 1 syklus: 72 ° C 7 min
Trinn 4: 1 syklus: 4 ° C Hold
Merk: Ytterligere sykluser (2-3) kan være nødvendig hvis Start DNA konsentrasjonen er under anbefalt. - Rense prøver med 90 µL av DNA-bindende magnetiske perler og 400 µL av nylagde 70% etanol per prøve. Legge til 90 µL av perler i hvert utvalg og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Pellets perler, fjerne nedbryting og resuspend pellets i 200 µL av 70% etanol. Fjerne etanol gjenta vask en gang.
- Bruk en magnetisk plate pellets perler og fjerne etanol så mye som mulig. Tørr i en 37 ° C heatblock i 3-5 min til perle pellets er helt tørr. Resuspend i 24 µL nuclease uten vann og samle ca 24 µL av nedbryting.
- Vurdere konsentrasjon og bp størrelse med høy følsomhet DNA oppdagelsen reagensene på en bioanalyzer.
Merk: Hvis bioanalyzer ikke finne biblioteket DNA, gjenta de forberedende trinnene med ekstra DNA.
Stoppestedet: etter rensing, indekserte eksempler kan være forseglet og lagret på 20 ° C. - Pooling prøver for aktuell neste generasjons sekvensering plattformen brukes.
- Ved hjelp av konsentrasjon data fra bioanalyzer, som bestemmer DNA molarity basert på biblioteket størrelse og antall et gitt volum, fortynn med lav TE buffer (6.1.1.1) og kombinere alle prøver å en final konsentrasjon av 15 pM.
Merk: En mer følsomme metoden av kvantifisere biblioteket er kvantitative sanntid PCR bruker primer som mål ligated kortene. - Kjøre gruppert eksempler på antall baner som er tilstrekkelig for 4 samplinger kjørefelt på en neste generasjons sequencer.
Merk: For eksempel hvis 16 biblioteket prøver er entydig indeksert og kombinert, kjøre bibliotekene 4 kjørefelt, tilsvarende 4 samplinger lane.
- Ved hjelp av konsentrasjon data fra bioanalyzer, som bestemmer DNA molarity basert på biblioteket størrelse og antall et gitt volum, fortynn med lav TE buffer (6.1.1.1) og kombinere alle prøver å en final konsentrasjon av 15 pM.
- Forberede PCR reaksjon Master Mix 2 på is. Legge til 25,5 µL Master Mix 2 til hvert utvalg. Legg til 5 µL kommersielle indeksering primere for individuelle prøver og ruge i en termisk cycler.
7. sekvensering på en neste generasjons Sequencer
- Sende prøvene til institusjonelle sekvensering kjernen for klynger av Methyl-Seq biblioteket, etterfulgt av sekvensering på en neste generasjons sekvensering maskin.
8. analyse for å identifisere DMRs
- Implementere Bismark15, som påkaller Bowtie 2.0 som en intern sekvens aligner16,17, justeres innspill lese rådata til bisulfite-konvertert, pluss-strand genom. Etter justering, bruk Bismark_methylation_extractor å utføre kvalitetskontroll og tilordne en estimert metylering verdi til hver CpG.
- Generere en liste over DMRs med BS-Seq pakken18 i Bioconductor. Filter på DMRs basert på å ha større enn 3 sammenhengende forbruksvarer og P-verdien < 0,05.
Merk: Generere en DMR-liste som inneholder genomisk koordinater, avstand til nærmeste RefSeq genet, antall forbruksvarer i hvert DMR, gjennomsnittlig % CpG metylering verdi over DMR for to sammenligningsgrupper (f.eks stresset vs trykklette) P-verdi, og FDR (false oppdagelsen rate) verdien. Bruk listen DMR, dvs., genomisk koordinater, utforme pyrosequencing primere for validering.
9. validering av Bisulfite Pyrosequencing
-
Primer Design
- Utforme primere for bisulfite PCR og pyrosequencing. Utforme to sett med PCR primere (utenfor og nestede) slik at den nestede PCR vil forsterke 150-400 bps av en DMR.
Merk: generelt utformet primere er minst 24 baser lang med minst 4 – 5 uavhengig G (C's for omvendt primer) til kontoen for redusert annealing temperatur av tap av sekvens kompleksitet. En nestet primerne blir biotin-merket og HPLC-renset. Men bør standard primere ordnes første å optimalisere PCR-trinn ved å løse reaksjonene på en agarose gel.- Design i pyrosequencing analysen primer slik at det mål de utfyllende biotinylated strand bare 1-2 baser oppstrøms av forbruksvarer å være assayed. Utforme flere pyrosequencing primer som nødvendig, som hver pyrosequencing primer kan pålitelig analysen 30 bps nedstrøms.
- For Rt1-m4, bruker du følgende:
rRT1M4 utenfor-F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
rRT1M4 utenfor-R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
rRT1M4 Nøstet-F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
rRT1M4 Nøstet-R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
- Utforme primere for bisulfite PCR og pyrosequencing. Utforme to sett med PCR primere (utenfor og nestede) slik at den nestede PCR vil forsterke 150-400 bps av en DMR.
-
Bruk en kommersielt tilgjengelig kit for bisulfite konvertering av rotte blod gDNA.
Merk: Bisulfite konverteringstrinnene har blitt tilpasset fra kommersielt tilgjengelig kit med følgende modifikasjoner: I trinn 1, legge til 50-100 ng av blod gDNA og fortynn med vann til 20 µL. I trinn 9, elute 20 µL per prøve.- Forberede bisulfite konvertering reagens i henhold til produsentens protokollen og kombinere med fortynnet gDNA. Inkuber i termisk cycler (64 ° C for 2,5 h, 4 ° C vent).
- Legge til bindende Buffer konverterte gDNA i spin kolonner og sentrifuger (15.000 x g, 1 min). Vask kolonner når deretter legger Desulphonation Buffer til kolonnene og ruge i 15 min ved romtemperatur. Sentrifuger (15.000 x g, 1 min).
- Vask kolonne med vaskebuffer og sentrifuger (15.000 x g, 1 min). Gjenta wash trinn med sentrifugering (15.000 x g, 2 min). Legge til 20 µL elueringsbufferen og sentrifuger (15.000 x g, 1 min) til elute.
-
PCR forsterkning
- Forberede utenfor PCR Master Mix. Legge til 21,5 µL av Master Mix 3,5 µL bisulfite-konvertert gDNA og kjøre termiske cycler program.
Utenfor PCR Master Mix:
16,25 µL av vann
2,5 µL Polymerase bufferen [10 x]
0,5 µL av dNTP [10 mM]
1 µL av fremover Primer [0,1 µM]
1 µL av omvendt Primer [0,1 µM]
0,25 µL av Taq DNA Polymerase [5000 U/mL].
Termisk cycler program:
Trinn 1, 1 syklus: 94 ° C 4 min
Scene 2, 47 sykluser: 94 ° C 1 minutt, 53 ° C 30 s, 72 ° C 1 min
Scene 3, 1 syklus: 72 ° C 8 min, 4 ° C Hold - Forberede nestede PCR Master Mix. Legge til 23 µL av Master Mix 2 µL av prøve fra utenfor PCR gjenta utenfor PCR termisk cycler programmet. Vurdere PCR produktkvalitet gjennom gel geleelektroforese (1 x TAE buffer, 1% agarose gel).
Nestede PCR Master Mix:
17,75 µL av vann
2,5 µL Polymerase bufferen [10 x]
0,5 µL av dNTP [10 mM]
1 µL av fremover Primer [0,1 µM]
1 µL av omvendt Primer [0,1 µM]
0,25 µL av Taq DNA Polymerase [5000 U/mL]
Merk: For nestede PCR, Videresend eller omvendt primer må være biotinylated.
- Forberede utenfor PCR Master Mix. Legge til 21,5 µL av Master Mix 3,5 µL bisulfite-konvertert gDNA og kjøre termiske cycler program.
-
Pyrosequencing
- Lage en master blande inneholder 38 µL bindende bufferen, 35 µL av vann og 2 µL av streptavidin-belagt sepharose perler per prøve. I en 96-brønns tallerken, Legg 75 µL av master mix og 5 µL av nestede PCR-produkt. Riste på en plate shaker i 15-60 minutter.
- Mens risting, legger du til 12 µL av primer (0,5 µM, utvannet i annealing buffer) i brønnene av en pyrosequencing analysen plate.
- Etter risting, utføre vask skritt benytter bindende reaksjon vaskebuffere. Plasser vakuum verktøyet i trough fylt med vann, deretter samle inn eksempler fra platen. Senk vakuum verktøyet i halv fylt daler med 70% etanol, NaOH (0,2 M) og Tris acetate buffer (10 mM, pH 7.4). Koble fra vakuum og sted vakuum verktøyet i HS analysen plate overføre perler.
- Plasser platen på varme blokk og ruge ved 80 ° C i 2 min. Tillat plate avkjøles i 5 min deretter starte pyro program.
Representative Results
En vellykket implementering av rotte Methyl-Seq-plattformen er avhengig av flere vilkår. Figur 1 viser hele arbeidsflyten for studien og uthever bestemte kvalitetskontroll (QC) trinn som kreves før du går videre. En av de første faktorene å vurdere er robust dyr modellen og stress diett, som avgjør størrelsen på epigenetic endringer som skjer over på methylome. Siden vår forrige observasjon som corticosterone (CORT) eksponering kan føre til endringer i DNA metylering19,20forutsetter at dyr arbeidet, våre kronisk variabel stress (CVS) diett trengte å være av tilstrekkelig rigor å produsere stresset rotter med forhøyet plasma CORT nivåer. En typisk ukentlige CVS diett er vist i tabell 1 og besto av daglig stress i morgen, ettermiddag, og overnatting som stadig endres for å hindre habituering og redusert stressrespons. Gjennom de 3 ukers diett, stresset dyr utstilt betydelig forhøyede nivåer av gjennomsnittlig plasma CORT [dager 4 – 21: kontrollere: 32,7 3.7 ng/mL, Stress: 103.0 11,9 ng/mL (mener SEM), P = 2.2 x 10-4, figur 2A] over de trykklette, kontrollen dyr. Konsekvent, disse dyrene også viste større angst-lignende oppførsel på forhøyet pluss labyrinten (EPM), som angitt av betydelig mer tid brukt i lukket armene av EPM og mindre tid i de åpne armene (figur 2B). Disse resultatene viser at CVS eksponering førte til betydelig endokrine og atferdsmessige endringer, fører oss til å undersøke om disse endringene var knyttet til bestemte DNA metylering signaturer.
Vi vektlegger flere sjekkpunkter som er avgjørende for vellykket bygging av Methyl-Seq biblioteket. Starter med en tilstrekkelig mengde DNA er nødvendig, som sonication, flere vask/rensing, målet berikelse bisulfite Konverteringstrinn redusere suksessivt antallet DNA ferdig biblioteket. Selv om flere PCR forsterkning trinn lindre tap av DNA mal, kan overdreven PCR syklus nummer introdusere høyere like leser. For gjeldende Methyl-Seq rottestudien, ble 2 g av blod gDNA per rotte brukt. Vi registrerer at Methyl-Seq biblioteker kan gjøres med starter DNA beløpet så lavt som 500 ng. Mindre starter materiale tillater brukere å generere biblioteker fra DNA isolert av FACS (fluorescens-aktivert celle sortering) eller punktstiler slag, selv om det er økt risiko for å produsere en tilstrekkelig mengde biblioteker for påfølgende sekvensering. QC utføres av geleelektroforese av 1 L prøven på en bioanalyzer, som gir DNA molekylvekt, antall og molarity. Tre viktige trinn som krever bruk av bioanalyzer er: 1) etter sonication trinn for å sikre tilstrekkelig klipping av DNA (~ 170 bp, rød, Figur 3); 2) etter kort ligation trinn angitt av en endring i den gjennomsnittlige størrelsen på skråstilte DNA (~ 200 bp, blå, Figur 3) å sikre deres påfølgende forsterkning av PCR; og 3) etter siste biblioteket rensing trinn for å sikre antall og størrelsen av bibliotek for sekvenser.
R-pakkene BSSeq og BSmooth i Bioconductor ble brukt for å analysere bisulfite sekvensering data18. De inkluderer verktøy og metoder for å justere den sekvens lest, utføre kvalitetskontroll, og identifisere ulikt denaturert regioner (DMRs). BSmooth programvare påkaller Bowtie 2.016,17 som en intern sekvens aligner å få CpG-nivå måling Sammendrag, ved justering av rå inndata til bisulfite-konvertert genomisk sekvenser. Den justerte lest deretter filtrert gjennom streng kvalitetskontroll prosedyrer som søker å identifisere systematisk sekvensering og base-ringer feil som kan gjøre nedstrøms analyser. En rekke tomter genereres til visuelt hjelp i denne prosessen med filtrering. Sekvensering beregninger generert å gi relevant informasjon som antall justert leser, % målet og per CpG dekning, blant andre (tabell 2). Når dataene filtreres, en utjevning/normalisering algoritme er utført, der hver CpG tilordnes en estimert metylering verdi basert på alle QC leser fra hver prøve og anslag fra nabokommunene forbruksvarer for å sikre mer nøyaktig kall av metylering status selv i tilfeller der rekkefølgen dekningen er lav. Denne verdien inneholder en utjevnet anslå sannsynligheten for metylering på hver CpG-området. Ved å sammenligne gjennomsnittet av utjevnet metylering estimatene for hvert utvalg mellom to behandlingsgrupper og rangering genomisk områder fra den mest signifikant forskjellig å minst, genereres det en liste over DMRs (tabell 3).
Toppen DMR mellom stresset og trykklette lå i arrangøren av rotte store histocompatibility genet Rt1-m4, med understreket dyr viser høyere metylering nivåer over alle forbruksvarer enn trykklette dyr (figur 4A). For å bekrefte vellykket implementering av Methyl-Seq-plattformen og dataanalyse, ble primere utformet mot DMR og blodet DNA metylering i hele kohort av stresset og trykklette dyr (8 sekvensert av Methyl-Seq og 8 ikke i rekkefølge) ble vurdert av bisulfite pyrosequencing. Resultatene viser betydelig økning i DNA metylering over 10 av de 12 forbruksvarer assayed (5.1-10.4 endring i % metylering, P < 0.037, figur 4B). KEGG sti analyse var utført på alle de standardoppløsning betydelige DMRs å identifisere trasé forbundet med stress. Konsekvent innblandet DMR-assosiert trasé sykdommer knyttet til kronisk stress eksponering, som diabetes, hjerte-og karsykdommer og kreft (Tabell 4). 21 , 22 , 23 for å demonstrere en tilknytning mellom epigenetic dataene og eksponeringsgraden stress, metylering nivåer på CpG-10 ble sammenlignet betyr 3 ukers CORT nivåer for hvert dyr. Resultatene viste en beskjeden sammenheng mellom endokrine og metylering dataene (R2= 0.54, P = 0,001, figur 5).
Figur 1: Total skjematisk arbeidsflyt for rotte Methyl-Seq plattformen. En g genomisk DNA utvunnet fra blod stresset og kontroll rotter behandles først for å konstruere Methyl-Seq bibliotekene for sekvensering, analyse og target identifikasjon. Ytterligere 100 ng DNA brukes for uavhengig validering av identifiserte epigenetic mål av bisulfite pyrosequencing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksponering for kronisk variabel stress (CVS) fører til endokrine og atferdsmessige endringer i rotter. (A) flere prøvetaking av corticosterone (CORT) vise robust 3 uken CVS diett. Blodprøver ble samlet i morgen før den daglige stress diett. (B) understreker dyr brukte mer tid i lukket armene og mindre tid i åpne armer til opphøyet pluss labyrinten (EPM). Boxplots med datapunkt for hvert dyr vises. Student T-test ble utført for statistisk betydning. * P < 0,05, ** P < 0,01, og *** P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kvantifisering av skåret og adapter-samskrevet rotte DNA på en bioanalyzer. De røde og blå kurvene viser antall og størrelsen av genomisk DNA (rød) etter skjæring i en isotermiske sonicator og kort ligation, henholdsvis. Hver linje representerer ett utvalg og røde og blå kurver reflektere både tap av DNA under flere trinnene (slutten-reparasjon, 3-adenylation og eksempel opprydding) og økning i bp størrelse på grunn av ligation av kortene. Skarpe topper på 25 bp og 1500 bp er standard markører som er lagt til lasting bufferen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: CVS-indusert epigenetic endringer oppdages av rotte Methyl-Seq. (A) analyse av rotte Methyl-Seq data innblandet arrangøren av genet Rt1m4 som et ulikt methylated område (DMR) mellom stresset (rød) og kontroll (blå) rotter. Grafisk utdata for Rt1m4 DMR (rosa skyggelagt område) viser hver CpG (vertikal grå linje), fire prøvene i hver gruppe (rød eller blå linjer) og % metylering nivåene for hvert dyr (rød eller blå prikk). (B) tolv forbruksvarer innenfor DMR ble godkjent av bisulfite pyrosequencing. Søylediagrammer representeres som betyr SEM, og en Student T-test ble utført for statistisk betydning. * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: lineær regresjonsanalyse viste en beskjeden sammenheng mellom % DNA metylering på CpG-10 av Rt1m4 og 3 uken mener plasma CORT nivåer av begge stresset og kontrollere dyr (N = 16). Data fra stresset dyr vises som røde sirkler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Uke | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 |
| AM | Selvbeherskelse | Svømme | Kjølerom | Svømme | Selvbeherskelse | Shaker | Svømme |
| PM | Shaker | Buret Tilt | Selvbeherskelse | Shaker | Kjølerom | Selvbeherskelse | Kjølerom |
| Overnatting | Mat begrense | Våt sengetøy | Isolasjon | Lys på | Trengsel | Lys på | Våt sengetøy |
Tabell 1: En typisk ukeplan av kronisk variabel stress diett (CVS).
| Sekvensering beregninger | Stress1 | Kontroll1 |
| (n = 4) | (n = 4) | |
| Sammen slutten leser (PER) | 89,290,397 | 80,165,674 |
| Entydig tilordnet sammenkoblede slutten leser (UMPER) | 39,200,255 | 35,013,406 |
| Justering/tilordning effektivitet (UMPER / PR) | 44% | 44% |
| Dupliserte leser (% av UMPER) | 73% | 65% |
| Deduplicated UMPER | 10,481,031 | 12,306,018 |
| Gjennomsnittlig lese dybde dekning (x) (ARDC) | 6 x | 6 x |
| Forbruksvarer (N) | 12,056,878 | 12,056,878 |
| ARDC (x) av forbruksvarer | 2 x | 2 x |
| Forbruksvarer med minst 10 leser (N) | 481,383 | 595,850 |
| ARDC (X) av forbruksvarer med minst 10 leser | 19 | 19 |
| På målet forbruksvarer (fullstendig overlapping med sonde Målrett mot regioner) | 1,923,872 | 2,007,638 |
| På målet ARDC (x) av forbruksvarer | 7 x | 8 x |
| På målet forbruksvarer med minst 10 leser (N) | 428,249 | 531,419 |
| På målet ARDC (x) av forbruksvarer med minst 10 leser | 18 x | 18 x |
| På målet (PER med 1 eller flere Base par overlapping med sonde Målrett mot regioner) (UMPER) | 8,277,715 | 9,369,523 |
| % På målet (Deduplicated UMPER) | 78% | 77% |
| På målet (totalt baser tilordnet) Mb | 125 mb | 128 mb |
| På målet gjennomsnittlig lese dybde dekning (x) (ARDC) | 9 x | 10 x |
| 1 Sekvensering beregninger basert på gjennomsnitt over fag i hver gruppe |
Tabell 2: Sekvensering beregninger fra rotte Methyl-Seq plattformen.
| Chr | Start | slutten | genet | avstand | areaStat | meanDiff | stress | kontroll | retning |
| chr20 | 1,644,246 | 1,644,390 | RT1-M4 | in_gene | 93.03 | 0.22 | 0,33 | 0,11 | få |
| chr5 | 160,361,352 | 160,361,564 | LOC690911 | in_gene | -70.75 | -0.19 | 0.72 | 0,91 | tap |
| chr3 | 61,138,281 | 61,138,330 | RGD1564319 | 265569 | 61.79 | 0,21 | 0,94 | 0.72 | få |
| chr2 | 143,064,811 | 143,065,010 | Ufm1 | 8569 | -59.48 | -0.11 | 0,13 | 0.24 | tap |
| chr7 | 30,764,111 | 30,764,284 | Ntn4 | in_gene | 57.04 | 0,21 | 0,94 | 0.73 | få |
| chr17 | 12,469,112 | 12,469,218 | Idnk | 41996 | -50.91 | -0.13 | 0.74 | 0,88 | tap |
| chr7 | 47,101,725 | 47,101,930 | Pawr | in_gene | -50.54 | -0.12 | 0.64 | 0.76 | tap |
| chr5 | 76,111,248 | 76,111,822 | Txndc8 | 151703 | -50.38 | -0.11 | 0,85 | 0,96 | tap |
| chr11 | 80,640,132 | 80,640,356 | Dgkg | in_gene | -50.07 | -0.16 | 0.73 | 0.89 | tap |
| chr8 | 71,759,248 | 71,759,411 | Mir190 | 210226 | -47.84 | -0.17 | 0.58 | 0,75 | tap |
Tabell 3: Topp 10 ulikt denaturert regioner. For hver DMR, utdatatabellen viser fra venstre til høyre: chromosomal plassering (chr), koordinater (start/slutt), gene navn, avstand fra transkripsjon starter nettsted, differensial området statistikk mellom stresset og kontroll grupper (areaStat), mener differensial metylering (meanDiff), mener metylering nivåer over hver DMR for stresset og kontroll grupper (stress/kontroll), og retning i metylering endre fra kontroller.
| KEGG veien vilkår | Gene teller | % | P-verdien | Benjamini |
| Diabetes | ||||
| Type II diabetes mellitus | 12 | 0,1 | 3.6 x 10-4 | 9.8 x 10-3 |
| Karsykdommer | ||||
| Vaskulær glatt muskel sammentrekning | 18 | 0,1 | 1.6 x 10-3 | 3.6 x 10-2 |
| Arrhythmogenic høyre ventrikkel kardiomyopati (ARVC) | 13 | 0,1 | 4.0 x 10-3 | 7.1 x 10-2 |
| Dilaterte kardiomyopati | 14 | 0,1 | 7.6 x 10-3 | 1.2 x 10-1 |
| Nevron funksjon | ||||
| Langsiktig potensiering | 11 | 0,1 | 1,5 x 10-2 | 1.4 x 10-1 |
| Signalisering | ||||
| MAPK signalveien | 35 | 0,2 | 2.4 x 10-4 | 9,9 x 10-3 |
| Kalsium signalveien | 22 | 0,1 | 1.2 x 10-2 | 1.4 x 10-1 |
| Chemokine signalveien | 21 | 0,1 | 1.2 x 10-2 | 1,3 x 10-1 |
| Kreft | ||||
| Veier i kreft | 42 | 0,3 | 4.1 x 10-5 | 3.4 x 10-3 |
| Glioma | 15 | 0,1 | 4.4 x 10-5 | 2.4 x 10-3 |
| Ikke-småcellet lungekreft | 10 | 0,1 | 7.9 x 10-3 | 1.1 x 10-1 |
| Tykktarmskreft | 13 | 0,1 | 8.4 x 10-3 | 1.1 x 10-1 |
| Kronisk myelogen leukemi | 12 | 0,1 | 1.2 x 10-2 | 1,3 x 10-1 |
Tabell 4: KEGG sti analyse av DMRs identifisert fra rotta Methyl-Seq.
Discussion
I denne studien vi designet og implementert Methyl-Seq plattformen for rotte genomet. Ved å demonstrere sin nytteverdi med en rotte modell av stress, viste vi at eksperimentelle og analytisk rørledningen kan gi ulikt denaturert områder mellom to sammenligningsgrupper.
For å sikre en vellykket implementering av plattformen, må flere viktige trinn overholdes. Første, innledende DNA kvalitet og kvantitet har en betydelig innvirkning på kvaliteten og kvantiteten av siste Methyl-Seq biblioteket. Vi brukte en fluorometer, i stedet for et spektrofotometer, slik at våre DNA måling reflektert antall double-strandet DNA stede. Bioanalyzer ble brukt til å måle molekylær størrelse og antall DNA etter klipping og etter kort hemorroider. Bekrefter den molekylære størrelsen "shift" mellom disse trinnene er avgjørende å bekrefte tilstedeværelse av kort på slutten av hver DNA fragment som vil gjennomgå adapter-mediert PCR i de etterfølgende trinnene. Antall DNA igjen på slutten av kortet ligation trinnet er også viktig, siden minst 100 ng biblioteket produktet er nødvendig på dette trinnet å sikre tilstrekkelig mengde er tilgjengelig etter målet berikelse og bisulfite konverteringstrinnene. En siste høy følsomhet måling ble utført på konstruert Methyl-Seq biblioteket slik at biblioteket kan fortynnes riktig for påfølgende klynger på neste generasjons sequenceren. Endelig var bisulfite pyrosequencing ansatt som svært kvantitativ, uavhengig å vurdere nøyaktigheten av rørledningen analytisk. Det siste godkjenningen ved hjelp av den opprinnelige prøver og replikering bruker flere dyr er avgjørende skritt for å sikre at eksperimentet kan oppdage biologisk betydelige endringer i DNA metylering.
Vi har også flere retningslinjer avvik fra protokollen eller hvis oppstår problemer. Først er det mulig å miste for mye DNA under slutten-reparasjon, kortet hemorroider eller magnetiske perle rensing trinn. Eventuelt starter mengder DNA kan være små (< 200 ng) på grunn av begrenset vev/DNA tilgjengelighet eller gjennomføringen av ulike berikelse som fluorescens aktivert celle sortering. Øke antall syklus under to biblioteket forsterkning trinnene kan være stand til å kompensere for overdreven tap av DNA eller lav starter DNA beløp gjennom biblioteket bygging protokollen. Men er ikke mer enn en ekstra 2-3 sykluser anbefalt, overdreven mal forsterkning er sannsynlig føre til en økning i antall dupliserte leser blir sekvensielt. Disse like utelates under justering skritt for å hindre skjevhet i prosent metylering beregninger. Andre hvis den gjennomsnittlige DNA størrelsen ikke øker av mer enn 30 bps, kontrollere sikre at reagensene er ny, som T4 DNA polymerase, Klenow eller T4 ligase kan være gamle. Kommersielt tilgjengelige erstatning reagenser kan brukes.
I tillegg er det mulig at de anslåtte DMRs ikke kan validere av pyrosequencing, hvor DNA metylering forskjeller finnes ikke eller er betydelig mindre enn de spådd av analyse. Dårlig godkjenningen kandidat regioner er et problem for felles for mange genomet hele analyser, for eksempel når pyrosequencing resultatene ikke bekrefte differensial metylering eller effekt er mye mindre enn det spådd av analysen. BSmooth er en analytisk pakke som "jevner" metylering nivåer over et vindu av flere forbruksvarer. For gjeldende eksperimentet innblandet BSmooth en DMR som metylering nivåer ble godkjent av bisulfite pyrosequencing. Imidlertid vil det trolig være avvik mellom metylering nivåer spådd av BSmooth og de bekreftet av pyrosequencing. Avvik oppstår fra utjevning funksjonen beregner gjennomsnittlig metylering verdiene på tvers av alle forbruksvarer i en DMR, inkludert påfølgende forbruksvarer som kan variere i DNA metylering av mer enn 50% eller forbruksvarer som metylering verdiene ble ekskludert grunn sub terskelen lese dybde. R-pakker som MethylKit24 kan brukes til å identifisere mindre Vinduer forbruksvarer eller selv enkelt forbruksvarer som metylering nivåer korrelerer sterkt med de godkjent av pyrosequencing. Implementere ulike pakker og teste deres spådd regioner eller forbruksvarer av differensial metylering av pyrosequencing sikrer robustheten av data. Alternativt kan opprinnelige Methyl-Seq biblioteker resequenced og lagt til lese filene å øke lese dybde. Siden fastsettelse av metylering nivåer er semi kvantitative og diktert av antall leser [(# of CpGs) / (antall TpGs + forbruksvarer)], øke Les dybden for en gitt CpG vil øke nøyaktigheten i prosent metylering verdien. I denne studien vurdert vi bare forbruksvarer som metylering ble fastsatt av minst ti leser og oppnådd en total Les dekning av 19 x for hver CpG.
Rotte Methyl-Seq plattformen er ikke uten begrensninger. Det er mer kostnadseffektivt enn hele-genome bisulfite sekvensering, er det betydelig dyrere enn andre metoder. Likevel var mesteparten av kostnadene for innkjøp lanes på sequenceren og ikke på systemet. Avhengig av Les dybden nødvendig med kryss-vevet sammenligninger krever mindre på grunn av store (25-70%) forskjeller12 i DNA metylering, reduseres kostnadene ved multipleksing flere samplinger lane og bruke en høyere kapasitet plattform. Også er prøve forberedelsene mer tidkrevende enn andre metoder. Ligner andre pulldown tilnærminger som inneholder neste generasjons sekvensering, legge ekstra bisulfite konvertering og rensing trinnene til arbeidsbelastningen. Total, metyl-Seq plattformen er et kostnadseffektivt alternativ til hele-genome sekvensering og gir base par oppløsning på mer enn 2,3 millioner forbruksvarer, som er betydelig mer enn de assayed av microarray-baserte plattformer. Til dags dato, kommersielt tilgjengelig menneskelige og mus har Methyl-Seq plattformer blitt brukt til å dokumentere alkohol-avhengige endringer i macaque hjernen25,26, neurodevelopmental gener i musen hjernen9og blod-hjerne mål av glukokortikoider10. Videre, muligheten til å målrette bestemte områder uavhengig av sekvens anerkjennelse av begrensning enzymer gjør det til en ideell plattform for cross-species sammenligninger. Til denne studien designet vi Methyl-Seq plattformen for rotte, som mange farmakologiske, metabolske og atferdsmessige eksperimenter utføres uten fordelen av et genom hele methylomic verktøy. Våre data viser at det kan brukes til å oppdage DMRs i en rotte modell av stress og korrelert andre fysiologiske parametere som samlet plasma CORT nivåer.
Methyl-Seq plattformen er ideell for epigenetic eksperimenter i dyr med sekvensert genomer som ikke kanskje har nok eksperimentelle bevis for å dokumentere regulatoriske regioner. Når slike områder er gjort tilgjengelig, kan flere regioner spesialdesignede og knyttet til den gjeldende versjonen. Videre er plattformen ideell for komparativ genomikk, siden målet anriking ikke er begrenset av begrensning enzym anerkjennelse. For eksempel kan området formidler alle genet av interesse fanges uansett om havner det en spesifikk begrensning nettsted. Tilsvarende kan noen regulatoriske regioner, som de identifiserte i musen eller mennesker, som er bevart i genomet av interesse hentes.
Disclosures
Manuskriptet er del av en konkurranse premie Agilent teknologi.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av NIH grant MH101392 (RSL) og støtte fra følgende priser og stiftelser: en NARSAD ung forsker pris, Margaret Ann pris etterforsker fondet, James Wah affektive lidelser Scholar fondet via Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation, og prosjektet Match Foundation (RSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
| Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
| Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
| Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | - | Must be capable of 20,000 x g |
| Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
| SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
| IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Covaris E-series or S-series | Covaris | - | Isothermal sonicator |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
| Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
| Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
| 96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
| 2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | - | Vacuum Concentrator |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
| Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
| EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
| Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | - | Next-generation sequencing machine |
| PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
| Pyromark MD96 | QIAGEN | - | Pyrosequencing machine |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
| Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
| Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
| PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
| PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
| PyroMark Binding Buffer (200 mL) | QIAGEN | 979006 | |
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
| PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
| Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
| SureDesign Website | Agilent Technologies | - | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
| UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | - | rat Nov 2004 rn4 assembly |
| Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | - | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
- Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
- Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
- Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).
- Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
- Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
- Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).
- Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
- Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
- Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
- Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
- Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).
- Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).
- Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
- Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
- Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
- Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
- McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
- Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).
- Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).
- Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).
