Locus coeruleus è un piccolo gruppo di neuroni coinvolti in una varietà di processi fisiologici. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di sezioni di cervello di topo per lo studio di proteine e metalli in questo nucleo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Locus coeruleus (LC) è un importante hub di norepinefrina producendo neuroni che modulano un numero di funzioni fisiologiche. Le anomalie strutturali o funzionali di LC parecchie regioni del cervello, compreso la corteccia, ippocampo e nel cervelletto di impatto e possono contribuire alla depressione, disturbo bipolare, ansia, così come la malattia di Parkinson e Alzheimer. Questi disturbi sono spesso associati con metallo disparità, ma il ruolo dei metalli in LC è solo parzialmente capito. Studi morfologici e funzionali di LC sono necessari per comprendere meglio le patologie umane e contributo dei metalli. I topi sono un modello sperimentale ampiamente usato, ma il mouse LC è piccolo (~0.3 mm di diametro) e difficile da individuare per un non-esperto. Qui, descriviamo un protocollo basato su immunohistochemistry passo-passo per localizzare la LC nel cervello del topo. Dopamina-β-idrossilasi (DBH) e in alternativa, tirosina idrossilasi (TH), entrambi gli enzimi altamente espressi in LC, sono usati come indicatori immunohistochemical nelle fette del cervello. Sezioni adiacenti alle sezioni contenenti LC possono essere utilizzati per ulteriori analisi, tra cui l'istologia per studi morfologici, test metabolici, così come formazione immagine di metallo da microscopia di fluorescenza di raggi x (XFM).
Introduzione
Locus coeruleus (LC) è una regione importante nel tronco cerebrale e un importante sito di produzione di noradrenalina (NE)1. Il LC Invia proiezioni in tutto il cervello2 la corteccia, l'ippocampo e il cervelletto3 e regola i principali processi fisiologici, tra cui ritmo circadiano4,5, attenzione e memoria6, sforzo7, processi cognitivi8e commozione9,10. Disfunzione di LC è stata implicata in patologie neurolog....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Gli studi degli animali è stato approvato dalla Johns Hopkins University Animal Care e uso (ACUC) protocollo numero M017M385.
1. cervello affettare
- Per immobilizzare, anestetizzare topi mediante l'applicazione di 3% isoflurane.
- Immergere un batuffolo di cotone con le gocce di isoflurane e inserirlo in un tubo del microcentrifuge da 15 mL. Posizionare il naso dell'animale nel tubo e consentirle di inalare l'isoflurano. Controllare la profondità dell'anestesia la mancanza di risposta a punta-pizzico.
- Metti l'animale sul dorso e immobilizzare e da appuntare le estremità verso il basso con un pin di T pu....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Cambiamenti nell'omeostasi del metallo (ad esempio Cu, Fe, Zn e Mn) sono spesso osservati in disordini neurologici, compreso i cambiamenti nel LC34,35. Così, determinazione dei livelli del metallo nel cervello è necessario per la comprensione dei meccanismi di malattia. Le sezioni di cervello generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di Cu e altri metalli a cristalli liquidi .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Corretto orientamento del campione è un passo cruciale in questo protocollo. Perché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per individuare LC (confine tra cervelletto e collicolo inferiore), è importante che le sezioni vengano allineati correttamente. Questo richiede cura nella corretta impostazione del cervello nella matrice affettatrice del cervello del mouse. Si consiglia di tagliare ~ 500 μm più tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo. L'errore più .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ringraziamenti
Ringraziamo Abigael Muchenditsi per la manutenzione della Colonia del mouse. Impiego della fonte del fotone avanzate all'Argonne National Laboratory è stata sostenuta da US Department of Energy, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, sotto il numero di contratto: DE-AC02-06CH11357. Ringraziamo Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt per supporto utente e assistenza presso la fonte del fotone avanzate. Questo lavoro è stato finanziato dalla 2R01GM101502 di grant del National Institute of Health a SL.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Matrice per affettare il cervello di topo adulto | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 488 (fonte - asino) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Vetrini caricati | Genesee | 29-107 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Lame da taglio per criostato | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Forbici Mini, 9,5 cm | Antech Diagnostiche | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| dopamina β-idrossilasi (DBH) anticorpo - produzione interna (fonte - coniglio) | B. Eipper | - | |
| Anticorpo dopamina β-idrossilasi (DBH) - disponibile in commercio (fonte - coniglio) | Segnalazione cellulare | 8586 | |
| tubi Falcon, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorano) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Pinze Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | sciences | 17984-24 | |
| Microscopio | Pascal | LSM 5 | |
| piastre multipozzetto, 24 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldeide (PFA)/ formalina 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Stampi per inclusione monouso Peel-A-Way | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pennello | |||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Lamette da barba | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatole | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| Il cervello del topo in coordinate stereotassiche, Paxinos e Franklin, 3a edizione | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (per preparare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Anticorpo tirosina idrossilasi (TH) (fonte - coniglio) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene film sottile per XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Microscopio fluorescente a campo largo | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
Riferimenti
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
