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Neuroscience

マウスの脳、青斑核の局在

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58652
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

斑は、様々 な生理学的なプロセスに関わるニューロンの小さいクラスターです。ここでは、蛋白質やこの核で金属の研究のマウスの脳のセクションを準備するためのプロトコルについて述べる。

Abstract

軌跡青斑核 (LC) は、ノルエピネフリン生理機能の数を調節する神経細胞の生産の主要なハブです。液晶の構造的または機能的な異常皮質、海馬、小脳などいくつかの脳領域に影響を与えるし、うつ病、双極性障害、不安、パーキンソン病、アルツハイマー病に貢献するかもしれない。これらの疾患はしばしば金属 misbalance に関連付けられている、lc における金属の役割は部分的にしか理解されています。LC の形態と機能の研究は、人間の病態と金属の貢献を理解する必要です。マウスは、広く使用されている実験モデル、マウス液晶が小さい (~0.3 mm 径) と非専門家を特定するは難しい。ここでは、マウスの脳で LC をローカライズする段階的な免疫組織化学ベースのプロトコルについて述べる。ドパミン-β-水酸化酵素 (DBH)、およびまた、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)、両方の酵素を液晶で高発現は、脳切片での免疫組織化学的マーカーとして使用されます。X 線蛍光顕微鏡 (XFM) による詳細な分析、組織形態学的研究、代謝性のテストと同様の金属のイメージングを含む LC を含むセクションに隣接するセクションを使用できます。

Introduction

軌跡青斑核 (LC) は、脳幹とノルエピネフリン (NE) 生産1の主要なサイトで重要な地域です。LC 脳2全体の予測を大脳皮質、海馬、小脳3に送信し、概日リズム4、5注意と記憶6を含む主要な生理的プロセスを調節します。7、認知過程8、および感情9,10を強調します。LC の機能不全は、神経疾患、精神神経疾患11を含むパーキンソン病12,13,14アルツハイマー病1415 うつ病に関与しています。 ,16,17, 双極性障害18,19, そして不安20,21,22,23,24します。 これらの役割を考えると、LC の分析はその機能と機能障害を勉強することが重要です。

マウスは、生理学的および病態生理学的プロセスの研究に広く使用されます。サイズが小さいためマウス LC は ~ 300 μ m、構造を見つける難しさにつながるの平均直径を有する。脳の断面、中に、LC は、コロナや矢状のセクションで簡単に逃したことが。動物で LC の同定を記述する利用可能な研究は、ステップバイ ステップのプロトコルを提供していない非専門家が1,25を従うことができます。したがって、LC のローカリゼーションのためのガイダンスを提供するいくつかのアプリケーション (図 1, , 図 2図 3) マウス脳のこの領域を検出する開発したプロトコルについて述べる。プロトコルは、胸高直径26,27, または日24、注意深く制御された脳区分および免疫組織化学的検出 LC28の高濃縮両方の酵素を適用されます。LC を免疫組織化学で見つかったら、隣接する脳スライスはさらなる研究、形態および代謝解析、x 線蛍光顕微鏡 (XFM)29を介して金属のイメージング研究などに使用できます。このプロトコル (図 3) の例として XFM について述べる。

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Protocol

動物の研究は、ジョンズ ・ ホプキンス大学動物ケアと (ACUC) を使用するプロトコル番号 M017M385 によって承認されました。

1. 脳スライス

  1. 固定、3% イソフルランのアプリケーションでマウスを麻酔します。
    1. イソフルランの滴でコットン ボールを浸すし、15 mL 遠心チューブ内に配置します。動物の鼻にチューブを置き、イソフルランを吸い込むことができます。つま先ピンチへの応答の欠乏によって麻酔の深さを確認します。
  2. その裏に動物を置き、その腹部へのアクセスをしながら、T ピンでその四肢を固定することによってそれを固定します。
  3. 腹部の皮膚から切り取り領域することによって手術ハサミで動物をカットし、胸部領域で皮膚をカットします。皮膚 T ピンを釘付けに。胸部まで腹膜の膜を破る。割れ胸腔内横隔膜を切断して、心臓を公開します。
  4. 動物の外に流す血を許可する右房をカットします。左心室に 25 g 針、10 mL シリンジを挿入し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml を灌流します。
    注: これにより、ソリューションが全身循環と出口を通過する右心房を。
  5. 10 mL 注射器を取り出し、60 mL の注射器に接続されている 25 ゲージの針を挿入します。50 ml の氷冷 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の左心室を介して灌流します。
    1. H2O 10 %pfa 溶液を希釈し、4 ° C で最終 4 %pfa 溶液を低温の氷冷 4 %pfa 溶液を準備します。
  6. マウスの頭を分離し、頭蓋骨から脳を削除します。
    1. 首の皮膚をカットし、頭蓋骨を公開する目に向かって切り取ります。首、鼻を他に 1 つの眼球から頭蓋骨を割る。頭蓋骨の取り出しの皮をむき、脳全体を切除します。
  7. 4% で脳を孵化させなさい 4 ° C で 24 h の PFA
  8. 30% ショ糖溶液の 25 ml、50 mL の円錐管に鉗子で脳を転送します。脳が管の底に沈むまで 4 ° C 48-72 時間でそれを維持します。
  9. 中脳 (前の ~ 3 mm 前後) をマトリックス コロナ、成体マウス脳スライサーと脳をカットします。脳幹を含む脳のセクションを保ちます。
    注: これは 2 つの脳のセクション-(カットの前部) 皮質と脳幹・小脳 (カットの後部) を含む 1 つの含んでいる最もになります。次の手順で脳幹セクションを使用します。
  10. 囲まれた化合物の最適な切削温度 (OCT); 埋め込みの金型の下に置かれたカット表面と脳幹セクションを埋め込む-80 ° C のフリーザーに埋め込まれた脳を移動し、さらに使用するまで、少なくとも 12 時間-凍結します。
  11. クリオスタットで切断:; クライオスタットに年 10 月脳を含む金型埋め込み場所クリオスタットの頭脳のブロックの温度を調整して数時間用クライオスタットでそれを孵化させなさい。
  12. 脳を含む 10 月のブロックを公開する埋め込み型をはがします。
  13. かみそりの刃を使用して、ブロックの面から脳に触れることがなく 10 月の超過分を削除します。
  14. 正面に向かって脳の切断面を公開する、クライオスタットのチャックに 10 月のブロックをマウントします。
  15. それ、クリオスタットの razorblades に平行に配向するように脳の切断面を調整します。
  16. 吻方 100 μ m のセクションをカット、延髄から始まる脳をトリムします。
  17. 小脳と脳幹を 1 つの連続スライス カットまで吻方をトリミングします。50 μ m の厚みでスライスを収集を開始します。
    注: 1 つの髄質から吻方トリム, 脳幹と小脳がカット 2 つの独立したセクションとして。吻側のセクションで、脳幹と小脳が 4th心室レベルで最終的にマージされます。4番目の脳室の横方向のエッジは、小脳と脳幹が 1 つの連続スライスとして出てくるだろうし、整形が。
    1. 鉗子で 10 月囲まれた脳スライスを収集し、それを満ちている PBS (図 2 a) 24 ウェル プレートのウェルに配置。小脳と下丘 ~-5.52 mm 前 (図 1 b) の後方で互いに会うとき、LC は最も著名ななります。
      注: 小脳が完全に切断されている、もはや ~-5.34 mm 前 (図 1 c) の後部の下丘を囲む一度 LC の最も前方部分が表示されなくなります。

2. ドーパミン β-水酸化酵素またはチロシン水酸化酵素 (図 2) の免疫組織化学

  1. 日 1
    1. PBS で 5 分間 3 回選択したスライスを洗います。
    2. 4 ° C で洗剤 (PBSD) 0.5% リン酸緩衝生理食塩水で 24 時間を permeabilize します。
      1. 125 μ L の PBS の 25 の mL の洗剤を希釈します。
  2. 日 2
    1. 0.5% で 5 分間 3 回スライスを洗う PBSD。
    2. 1: 500 で 0.5% の希釈で一次抗体、抗 DBH またはアンチ-日 18 h を追加 4 ° C で PBSD
  3. 日 3
    1. 0.5% で 3 回 10 分間のスライスを洗う PBSD。
    2. 0.5% で 1: 1000 希釈に必要な二次抗体 (488 蛍光グリーンのロバ反うさぎ) を追加 16 h の PBSD。
    3. アルミと 4 ° C の場所で 24 well プレートをラップします。
    4. 0.5% で 5 分間 3 回スライスを洗う PBSD。
    5. PBS で 5 分間洗浄します。
    6. 鉛筆ブラシでスライスを水容器に転送します。
    7. 充電されたスライド上の水に浮かんでいるスライスをマウントします。
    8. (DAPI) なしメディアをゆるませたマウント Coverslip セクション。
    9. 室温で 30 分間マウントされた脳のセクションを乾燥させます。
    10. 適切な二次抗体蛍光波長からの信号を検出するための設定や共焦点蛍光顕微鏡でイメージ脳スライス。
    11. 10 倍の倍率で 1 つの画像を取るし、脳スライスの焦点面に顕微鏡を調整します。
    12. 脳スライスの可能な LC 地域を検索するには、4th心室を使用向き。ポンスと脳幹、小脳は心室の上にある、30以下発見されます。
    13. 4th心室; の横方向のエッジに焦点を当てて、LC を見つけるには、4th心室と橋に向かってポイントの端に由来する LC/脳幹領域 (図 2 b, 2 c)。
    14. 以下の画像と特定の脳のスライスで LC の局在, 4 ° C で脳切片を含むスライドを保存します。

3. 脳スライスで LC の検出

  1. LC を含む脳セクションを見つけます、前述のように、マウスの脳をスライスし、PBS のセクションを収集を図 2 aに示すように 24 よく料理をいっぱい。
    1. LC の適切な局在化を可能にするにあたり 1 つの脳のセクションに配置します。
  2. 脳あたり immunostained になる 48 の脳スライスの合計を収集します。
    注:図 2 aに示すように 2 つの料理のすべての井戸には、1 つの動物から脳スライスが含まれています。
  3. Immunostain 胸高直径、または木のすべての第五のスライス好ましくは、試金されるそれらに隣接しているそれらの脳切片の免疫組織化学を実行 (x 線蛍光顕微鏡、XFM) を経由してさらに。
    注: この手順により、最終的なアッセイのスライスで LC の厳密な局在化のため (図 2 a; 井戸間の数字の付いている)。
  4. 彼らはセンターと、LC または概算だけのエッジの正確な位置を必要とするかどうかは、アプリケーションによっては、例えばimmunostained 脳スライスの数を調整します。
  5. 免疫組織化学、次 4回心室 (図 2 b, 2 c) の両側の式の特徴的なパターンで LC を含む脳スライスを検出します。図 2 d, 2 e; 連続脳スライスの LC で DBH 信号の表示倍率が表示されます。TH を示すために染色は LC の拡大図 2 f.
  6. 金属レベル (図 3) を定量化する XFM の場合それら含む LC のさらなる研究のために隣接するセクションを使用します。
  7. XFM を実行すると、高分子薄膜、試料ホルダーにマウントされているし、できるシンクロトロンでイメージに 10-30 μ m (セットアップ) によって薄いコロナ脳スライスを収集します。
  8. 常温 XFM の高分子薄膜に用意し、実行 XFM 脳スライスを保存します。

4 XFM を介して lc 金属のイメージング

  1. 上記のように例のマウス脳をスライス LC を判断し、LC を含むこれらの脳のスライスから XFM を介して金属の濃度を測定します。
  2. ビームライン 2-ID-E 高度な光子源 (アルゴンヌ国立研究所、イリノイ州アルゴンヌ) での元素分布をイメージ。
  3. 'オンザフライ' データを記録31を前述のよう。
  4. プログラム マップ32,33を使用して液晶を含む脳スライス中元素濃度を決定します。

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Representative Results

(Cu、Fe、Zn, Mn) など金属恒常性の変化は、神経学的疾患、LC34,35の変化などで多く観察されます。したがって、脳内金属のレベルを決定する疾患のメカニズムを理解するために必要です。記述のプロトコルを使用して生成された脳のセクションは、Cu と LC で他の金属のレベルを定量化し、LC 以外の地域のレベルにそれらを比較する使用できます。(図 3)。例では、LC、リン酸、カリウム、カットされた脳スライスの塩化物および銅を測定しました。銅だけ具体的に、LC で上昇した.金属レベルの細胞内分布の検出のため高解像度 XFM イメージング (ここでは表示されません) が行えます。このプロトコルの応用の可能性が更に豊かさと細胞内分布、DBH (図 2 b、2 d、2 e)、TH (図 2 c、2 階)、および個別に LC で表される他のタンパク質の検出を含んで、共同染色の試金、LC 形態と神経密度の研究。

Figure 1
図 1: マウス脳幹で LC のローカリゼーション。(、)、LC をローカライズするのには断面が脳幹部を示す模式図。(b) に基づいて Paxinos とフランクリンの脳アトラス30、LC 小脳と下丘は互いに (前の後部-5.520 mm) を満たすとき最も顕著なようになります。左の画像は、右画像はニッスル染色による 4th心室の横方向のエッジの LC のローカリゼーションを示している間、LC を切って冠状断面を示しています。LC の (c) の最も前方部分は、小脳は完全に切断されている、もはや下丘 (前の後部-5.340 mm) を囲む一度に表示されなくなります。ニッスル染色右の画像には、LC がこのコロナのスライスにわずか存在のみを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 免疫染色脳で LC の検出は DBH または木のスライス(、) の 1 つのマウスの脳は脳の幹周り 50 μ m のスライスに分割され、2 24 よく料理で収集しました。8th収集した脳スライスするすべての 5th XFM を介してイメージング用カバー フィルム上にマウントされました。これらのスライスは、井戸の青色の数字が付いています。PBS に浮かんでいる隣接するスライスされた DBH LC (井戸、赤十字社のラベル) を検出するための immunostained。緑の円は DBH 信号をスライス正を表し、したがって LC を含みます。LC を含む (b) A コロナ脳スライス DBH と immunostained と共焦点顕微鏡のイメージします。イメージは、(緑) で LC の強力な信号を示しています。(c) A コロナ スライス LC を含むチロシンヒドロキシラーゼ (TH) の immunostained、蛍光顕微鏡のイメージします。画像は、左と右の両方の LC の強力な信号を示しています。(d) スライス、DBH の immunostained、スライス 7 (左側) と 9 (右側) に LC が含まれています。隣接するセクションは、XFM 解析に選ばれました。(e) スライス 10 はまた LC を示した。このセクションで左の液晶は液晶右側の前方の端に捕獲された中その中心を通るカットされました。LC を含む (f) A セクションは、番目の immunostained をされ、共焦点顕微鏡のイメージします。画像では、緑のラベルの付いた lc ニューロンを表現する回を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: LC でレベルを金属のイメージングします。銅トランスポーター ATP7B のノックアウトのある男性 12 週齢のマウスの脳は、分離され、このプロトコルで説明されています。LC を含むセクションに隣接する非染色のスライスが撮影され、XFM を介して金属の濃度を測定しました。銅レベルは一方、周囲の脳の領域と比較して (黄色の矢印の付いた) LC で特に増加した要素 (K、P、および Cl) は変更されなかった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルの重要なステップは、供試体を正しく方向づけます。LC (小脳と下丘間の境界) を検索する脳の背側表面の解剖学的特徴を使用している我々 は、ためには、セクションが正しく位置合わせされることが重要です。マウス脳スライサー行列に脳を正しく設定に注意が必要です。核の欠落を回避する LC に前部と後部に 〜 500 μ m より多くの組織を切断をお勧めします。最も一般的な間違いは、LC の完全欠落した結果あまりにもいくつかのセクションをカットすることです。したがって、初めて 1 つの次のこのプロトコルは、必要とするよりより多くのセクションをカットすることをお勧めします。汚れる前に脳アトラスのイメージの注意深い研究は、非常に便利です。脳幹の外観の変化かなりすべての数百ミクロン、いくつかの経験を持つセクションがマクロスコ ピック出現によって単に汚す価値がある何を知ることは不可能です。

LC のローカライズの過程で、脳が断面中に配向がいかにうまくによって信号のバリエーションがあります。LC の中心を通って切断、信号は明るいし、に比べてはるかに小さい範囲に信号として表示されます、液晶の端の大きい区域をカバーします。場合コロナ スライスが少し傾いている、4番目の脳室の 1 つの側面の LC を明らかにする可能性があります、他の側の 1 つは、隣接するスライドに表示されているだけかもしれない。したがって、1 つは常に一つの脳スライス内の最大強度で両方の LC の領域の外観を期待できません。このアーティファクトは、マウス脳スライサー行列でまさにコロナの脳を切断し、慎重に立方体の埋め込み型に 10 月の脳を埋め込みによって回避できます。

免疫染色、少なくとも反チロシン水酸化酵素抗体が非常に寛容と、我々 の経験での作品セクション最大 100 μ m の厚さで。我々 は、解決を妨げる高い信号対雑音染色 lc のコストを削減し、LC を検索に必要な時間の量を減らすために必要ではないことを発見しました。我々 の経験で汚損のプロトコルことができますをスピードアップする-を削減した品質や染色の-また、2 h、8 h の一次抗体と二次抗体 2 のために透過を減らすことによって浸透 LC (の場所に単に興味がある場合とはいえ例えばウイルス/トレーサーの注入を検証するため)、100 μ m 厚で vibratome に固定脳からのセクションを切ることができます。

このプロトコルの制限の 1 つです、仕様では、動物を安楽死させると脳を削除します。したがって、(例えば、電気生理学的録音) 生体内でのローカリゼーションのため便利ですありません。別の制限は、このプロトコルが組織の本来の状態を変更可能性があります PFA 固定を必要とすることです。これらの変更には、銅、カルシウム、鉄、亜鉛36など元素のコンテンツが含まれます。PFA 固定による金属分布の実際の変化は、非固定標本に並列で実行することができます 1 つのサンプル テスト可能性があります。これらの 2 つのサンプル間金属分布の比較は PFA 固定特定の研究に関心のある金属の分布の影響に関する証拠を提供します。PFA 固定を回避する必要があります、(免疫染色による LC の検索およびフォロー アップの実験の隣接したセクションを使用して) この議定書の原則が固定せず凍結切片を拡張できます。

我々 はこの問題を解決するために既存の法の精緻化主をこのプロトコルには注意してください。目新しさは、非常に小さい、容易に逃された核を検索する従来のアプローチを仕立てに存在します。このプロトコルことができます簡単に変更および延長に基づいて必要性 (例えば、免疫染色を避けるために LC の蛍光物質を表現するトランスジェニック動物を使用して) ことを期待しています。

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Disclosures

なし。

Acknowledgments

我々 はマウス コロニーの維持のための Abigael Muchenditsi を感謝します。アルゴンヌ国立研究所で高度な光子源の使用は、米国エネルギー省科学局オフィスの基本的なエネルギー科学、契約番号によって支えられた: デ AC02 06CH11357。ユーザー サポートや高度な光子源援助、オルガ Antipova と博士ステファン Vogt に感謝します。この作品は、SL に国立衛生研究所の助成金 2R01GM101502 で賄われていた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mouse brain slicer matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) Thermo Fisher Scientific A-21206
Charged glass slides Genesee 29-107
Confocal microscope Zeiss LSM 800
Cryostat Microm GmbH HM 505E
Cryostat cutting blades Thermo Fisher Scientific MX35
Scissors Mini, 9.5cm Antech Diagnostcs 503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) B. Eipper -
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) Cell Signaling 8586
Falcon tubes, 50ml USA Scientific 339652
Forane (isofluorane) Baxter NDC 1019-360-60
Forceps Micro Adson Antech Diagnostcs 501245
Hardset mounting media EM sciences 17984-24
Microscope Pascal LSM 5
Multi-well plates, 24 wells Thermo Fisher Scientific 930186
Optimal cutting temperature compound (OCT) VWR/ tissue tech 102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% Fisher Scientific SF98-4
Peel-A-Way disposable embedding molds Polysciences Inc. 18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS) Life Tech 14190250
Razor blades Amazon ASIN: B000CMFJZ2
Spatulas Antech Diagnostcs 14374
T pins Office Depot 344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition Amazon ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD) Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) EMD Millipore AB152
Ultralene thin film for XRF SPEX Sample Prep 3525
Wide-field fluorescent microscope Zeiss Axio Zoom.V16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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神経科学、問題 145、脳、青斑核、金属、免疫組織化学、蛍光 x 線顕微鏡、ノルエピネフリン、銅、DBH、TH、ATP7A ATP7B

Erratum

Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

マウスの脳、青斑核の局在
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Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M.,… More

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).

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