ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Mangelen på standardisering for murine vev behandling reduserer kvaliteten på murine histopathological analyse i forhold til menneske prøver. Her presenterer vi en protokoll for å utføre histopatologisk undersøkelse av murine betente og uninflamed colonic vev å vise muligheten for robotic systemer rutinemessig brukes for behandling og innebygging prøver fra mennesker.
Abstract
Forståelsen av menneskelige sykdommer er blitt betydelig utvidet takk til studiet av dyremodeller. Likevel må histopathological evaluering av eksperimentelle modeller være så strenge som brukes for menneskelig prøver. Faktisk er trekke pålitelig og nøyaktig konklusjoner kritisk påvirket av kvaliteten på vev delen forberedelse. Her beskriver vi en protokoll for histopathological analyse av murine vev som implementerer flere automatiserte trinn under prosedyren, fra innledende forberedelse til parafin innebygging av murine prøvene. Reduksjon av metodologiske variabler gjennom strenge protokollen standardisering fra automatisert prosedyrer bidrar til generelle påliteligheten av murine patologisk analyse. Spesielt denne protokollen beskriver bruken av automatiserte behandling og innebygging robotic systemer, rutinemessig brukes for vev behandling og parafin innebygging av prøver fra mennesker, behandle murine eksemplarer av intestinal betennelser. Vi konkludere med at påliteligheten av histopatologisk undersøkelse av murine vev er betydelig økt ved innføring av standardiserte og automatisert teknikker.
Introduction
I de siste tiårene, er flere eksperimentelle modeller utviklet for å analysere patogene mekanismer fører til menneskelige sykdommer1,2. For å vurdere alvorlighetsgraden av en sykdommen, må forskere evaluere effekten av behandling og studere fargemaskin og histologiske arkitektoniske variasjoner eller mengden av betennelse3. Du kan utføre på disse eksperimentelle modeller, er detaljerte histopathological analyser nødvendig, ofte sammenligne murine og menneskelige4,5.
Dessuten prøver fra mennesker vanligvis behandles og scoret av histopatologi kjernen fasiliteter og erfarne menneskelige patologer gjennom standardisert histopathological kriterier og metoder. Derimot er murine vev vanligvis fast, innebygd og analysert av forskere rydding av histopathological protokoller. Kvaliteten og påliteligheten av histopathological eksamen begynner med utarbeidelse av høy kvalitet vev deler. Flere faktorer bidrar kritisk å forhøye eller nedgang kvaliteten på den endelige analysen, inkludert fiksering, makroskopisk skjæring, behandling, parafinen innebygging og innebygging av prøver6,7.
Alle disse passasjene som involverer manipulering av prøven er utsatt for manuelle feil, inkludert manuell innebygging av prøvene og, i mindre grad, manuell mikrotomen snitting og flekker. I dag bruker hele prosessen med murine vev forberedelse til histologiske evaluering protokoller som varierer fra laboratoriet til laboratoriet og manuell protokoller. Målet med denne studien er å implementere standardiserte automatisert protokoller for å redusere feil og variasjon i murine histopathological eksamen.
Vi vet beskriver vi her første protokollene for helautomatisk vev behandling og innebygging av histologiske evalueringen av murine vev; disse brukes rutinemessig i patologi enheter for analyser av menneskelig. Som et praktisk eksempel på muligheten for metoden, en murine modell av intestinale betennelsen er analysert, i.e., kronisk kolitt modellen skyldes gjentatt utfylling av dekstran natrium sulfat (DSS) i drikkevann8 ,9. Denne eksperimentelle innstillingen tett ligner menneskelige inflammatorisk tarm sykdommer (IBD)10 siden DSS-behandlede dyr forevise underskriver av intestinal betennelser, f.eks vekttap, løs mage eller diaré og forkorte den kolon samt fibrose 8,9,11. Som observert i menneskelige IBD pasienter, genererer DSS behandling et komplisert sykdom kurs. I denne sammenheng må forseggjort histologiske evalueringer forstå dyptgripende endring av vev arkitektur. Dermed gjennomføringen av beskrevet protokoller for å øke eksempel forberedelse kvalitet kan ha nytte forskere avhengig tolkning av histologiske og immunohistochemical analyserer for murine eksperimentelle innstillinger. Murine eksperimentelle modeller av menneskelige sykdommer som involverer forandringer av vev arkitektur, mobilnettet vev infiltrere eller betennelse i ulike vev og organer (tarmen, hjerne, lever, hud) kan bruke den økte kvaliteten på den eksempel forberedelse til histopathological eksamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal prosedyrer ble godkjent av det italienske Forsvarsdepartementet helse (Auth. 127/15, 27/13) og fulgt retningslinjene dyr omsorg European Institute of onkologi IACUC (dyr institusjon og bruk Committee)
1. kronisk kolitt induksjon av repeterende DSS administrasjon
- Egen alder og kjønn matchet mus i 2 grupper (behandling DSS vs control H2O, minst 5 mus littermates per forsøksgruppen).
- Administrere 2,5% DSS (40 kDa) i drikkevannet i 7 dager til behandling gruppen og vann til kontrollgruppen.
Merk: Denne modellen induserer en kronisk transmuralt intestinale betennelsen9. - Etter 7 dager, stoppe DSS behandling og gir vann til begge gruppene i 14 dager. Gjenta denne prosessen 3 ganger.
Merk: Repeterende administrasjon av DSS induserer endringer colonic mucosa ligner menneskelige IBD fibrose9dvs. - Ofre mus i henhold til prosedyrene som er godkjent av den institusjonelle IACUC, dvs., av CO2 innånding.
- Åpne mus magen og peritoneum med skalpell.
Merk: Sterilitet anbefales men ikke strengt nødvendig. - Skille kolon fra tynntarm med tang og pinsett. Avgiftsdirektoratet kolon med pinsett og tang.
Merk: Kolon lengdemåling (figur 1A) er en metode for å fastslå Hvis kolitt skjedd i DSS-behandlet mus. - Skyll kolon i en Petriskål med 10 mL kaldt 1 x fosfat buffer saltvann (PBS) og trykk forsiktig fjerne avføring materiale.
2. murine vev fiksering
- Fordype hver murine kolon prøven i 10 mL av 10% nøytrale fullbufrede Formalin (NBF) på RT (romtemperatur).
Merk: Sterilitet anbefales men ikke strengt nødvendig. - Reparere vevet 18 – 24 h på RT.
3. kolon snitting og vev forberedelse
- Fjerne fast vev fra beholderen NBF med små pinsett og sett dem i en Petriskål. Sette kolon på en snitting arbeid plate med små pinsett.
- Kuttet kolon i fragmenter (0,2 cm til 0,3 cm lengder) med sterilt skalpell. Denne fragment lengden er optimal for ikke å overskride tykkelsen på kassetten.
- Plukk opp ett kolon segmentet med små pinsett (figur 2A). Sett inn ett kolon segmentet i en av plast stikker tips av orientert parafinen innebygging kassett med små pinsett (figur 2B).
- Gjenta operasjonen (3,2-3.3) med en ytterligere 3 kolon segmenter per kassett. Unngå å sette inn segmentene i tilstøtende utstående tips, minimere overlapping av vev
- Tett nærhet kassetten forsiktig skyve de fire kantene (figur 2C). Unngå klemmer vev for å hindre skade på vev.
- Sett inn rutenettet i en plast støtte ramme. Etiketten støtte rammen for å identifisere prøven. Gjenta for hvert biologiske utvalg.
4. vev behandling
- Slå på automatisk prosessoren ved å trykke på power-knappen (figur 3A, 3B).
- Varm opp 1 h å sikre parafinvoks smelter. Vent til instrumentet bekrefter parafinen er helt smeltet, ved å observere tilstedeværelsen av ikonet dedikert (Figur 3 c).
- Inn hver orientert kassett (inneholder vevsprøver) manuelt på metall kurv av automatiserte prosessoren (figur 3D). Plass kassettene loddrett av fôr dem nær ene til den andre å optimalisere kurv belegget.
- Lukk metall kurven (figur 3E).
- Åpne lokket på retorten (figur 3F). Retorten er stedet der kurven settes inn i maskinen. Sett kurven i egen bolig av prosessoren (Figur 3 g). Lukk lokket på retorten (Figur 3 H).
- Bruk berøringsskjermen på instrumentet datamaskinen for å definere arbeider protokollen (figur 3I). Velg en rekke løsninger, timing og temperatur skal gjennomføres i henhold til ordningen gitt i tabell 1.
- Tilordne protokollen skal kjøres på retorten som inneholder kurven ved å klikke på ikonet dedikert datamaskin (figur 3J). Start protokollen ved å klikke Start-knappen (Figur 3 L).
- Vent til instrumentet bekrefter slutten av protokollen, observere tilstedeværelsen av ikonet dedikert og høre alarmtonen kommer fra maskinen.
- Åpne retorte-lokket. Fjerne kurven fra prosessoren (Figur 3 M).
5. vev innebygging
- Slå på den automatiske embedder ved å trykke på power-knappen (figur 4A).
- Varm opp 1 h å sikre parafinvoks smelter. Vent til instrumentet bekrefter parafinen er helt smeltet ved å observere temperaturen på parafin bad angitt av interne termometeret av instrumentet.
- Manuelt overføre alle behandlet kassettene fra prosessor kurven til embedder rack. Hver rack kan inneholde opptil 32 kassetter. (Figur 4B 4 C).
- Åpne det viktigste embedder lokket (figur 4C, 4 D, 4E).
- Bruk berøringsskjermen på instrumentet datamaskinen for å signalisere til den robot system som et rack blir satt inn (figur 4F).
- Åpne inntak bolig lokket (figur 4G). Stativet inn inntak bolig. Hver embedder kan inneholde opptil 4 hyller samtidig (Figur 4 H, 4I). Lukk innløpet bolig dekslet (figur 4J).
- Bruk berøringsskjermen på instrumentet datamaskinen for å starte innebygging prosedyren, i henhold til tabell 2 (Figur 4 K).
Merk: Hver rack av 32 kassetter tar 45 min bygges. - Vent til instrumentet bekrefter slutten av protokollen, ved å observere tilstedeværelsen av ikonet dedikert (Figur 4 L).
- Fjern stikkontakt brettet (Figur 4 M). Lukk viktigste embedder lokket.
- Fjern innebygde blokkene (inneholder retning rutenettene) fra stativet. Overføre de innebygde blokkene i en papp oppbevaringsboks.
6. mikrometer snitting
- Slå på kjøleplaten til mikrotomen. Still inn temperaturen mellom-8 og -10 ° C.
- Slå på Termostatiske vannbad av mikrotomen, som inneholder 2 L destillert vann. Angi temperaturen i vannbad mellom 42-45 ° C.
- Sted parafinen innebygd blokker på kjøleplaten. Vent minst 5 minutter å tillate blokker for å kjøle.
- Ta ett kvartal fra kjøleplaten og plassere det inn i mikrotomen blokk holderen.
- Angi mikrotomen kutte tykkelse 10 µm. Trim blokken med klippe det 6 ganger på 10 µm tykkelse.
- Endre innstillingen tykkelsen av mikrotomen fra 10 µm 3 µm. kutt en 3 µm delen for Hematoxylin og Eosin (H & E) flekker.
-
Samle 3 µm delen med en liten børste. Sette 3 µm delen i vannbad, legge den nøye på vannflaten å redusere vev rynker. Samle delen vev fra termostatstyrt vannbad i et enkelt glass lysbilde.
- Hvis nødvendig, kutte flere inndelinger.
- Etiketten av objektglass ved å skrive eksempel identifikasjon.
- Satt lysbilder i en 37 ° C ovn for minst 10 min.
- Sette glass lysbilder i rack for umiddelbar analyser eller oppbevaringsbokser.
7. hematoxylin og Eosin (H & E) flekker
- Slå på den automatiske fargemaskin ved å trykke på strømknappen. Tillate initialiseringen av robotarmen, ved å observere endringen av baren lasting på instrumentet skjermen.
- Sett inn på glass lysbilder i fargemaskin stativet, loddrett innsetting av opptil 30 lysbilder.
- Etiketten brettet med passende radio frequency identification (RFID) plast taggen. RFID merking er et system som identifiserer den riktige fargeprotokoll lastet inn fargemaskin datamaskinen.
- Stativet inn i fargemaskin. At datamaskinen skal automatisk laste og starte fargeprotokoll etter anerkjennelse av RFID-brikke.
Merk: Protokollen for H & E flekker er beskrevet i tabell 3.
8. Immunohistochemical flekker
- Utføre immunohistochemical og Mallory trichrome flekker som beskrevet tidligere7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentell kronisk kolitt indusert av gjentatte administrasjon av DSS i drikkevannet er et murint intestinale betennelsen ligner menneskelige IBD8,9. Figur 1 beskriver virkningene av DSS behandling, inkludert kolon forkortelse (figur 1A), brukte parameter å score tilstedeværelsen av DSS-indusert betennelser og colonic uttrykk av pro-inflammatoriske gener inkludert CXCL10 , tnf og mcp-1 (figur 1B). Infiltrasjon av inflammatoriske celler var kraftig forbedret av DSS behandling, viser en rekruttering av immunrespons i intestinal lamina propria som analyseres av cytofluorimetry (figur 1 c).
Figur 2 viser hvordan colonic vev er delt og satt inn i orientert kassettene. Disse kassetter er utformet for å inneholde et rutenett med ekstrudert tips, tillater innsetting av vevet vertikalt og med riktig retning, dvs, med lumen i den indre delen og veggen exteriorly (figur 2A, 2B, 2 C ). Når kassettene er lukket, beholdes vev retningen av rutenettet, i motsetning til hva som skjer med konvensjonelle histologiske kassetter (figur 2B).
Vev behandling utføres med en automatisert prosessor (figur 3A-3 M og tabell 1), mens innebygging prosedyren utføres med en automatisert embedder (figur 4A-4 M og tabell 2). I den sistnevnte maskinen, en robot samler kassettene og dispenses riktig mengde parafin. Til slutt, ved en mikrotom deler er kuttet av hver parafin. Lysbildene er så forberedt for videre analyse.
Figur 5 beskriver viktigste passeringer av den automatiserte H & E flekker (figur 5A-5E og tabell 3) og hvordan lysbildene vises etter H & E flekker (figur 5F). Figur 6 og 7 viser hvordan gjennomføringen av automatiserte behandling og innebygging protokoller sterkt øke kvaliteten på histopathological analysene av murine colonic. H & E stainings av prøver med automatisert protokollene avledet fra ubehandlet mus (figur 6A) ble sammenliknet med dem DSS behandlet mus (figur 6B). Histopathological score ble vurdert ved å evaluere modifikasjonene av ulike parametere forekommer i tarmen, inkludert inflammatoriske celler infiltrasjon, epithelial endringer og endringer av slimhinnene arkitektur som beskrevet i Tabell 4. Figur 6C viser en representant H & E farging av en colonic vev behandles manuelt og inkludert i tradisjonelle kassetter. I figur 7kvaliteten på murine vev utarbeidelse og innebygging utført gjennom automatisert instrumenter i tillegg bekrefter IHC farging av CD20 og Mallory trichrome flekker8,9 i colonic deler av ubehandlet (figur 7A 7 C) og DSS-behandlet (figur 7B, 7 D) mus.
Figur 8 beskriver praktiske relevansen av denne metoden. Samme kolon prøvene ble behandlet og innebygd manuelt eller via automatiske metodene. Hvert utvalg (enten kontrollen eller DSS-behandlet) ble skåret i 2 like deler og behandles parallelt med manuelt eller automatiske metodene. H & E flekker var da spilte og en fullstendig microscopical vurdering om alle patologisk parameterne adressering endringer i slimhinnene arkitektur, detaljnivå, immun celle infiltrere, mucosal tykkelse, glandular rarefaction normalt observert ved intestinal betennelser, ble vurdert for hver prøve, både for manuelt og automatiserte protokollen (figur 8A og tabell 4). Utarbeidelse av prøvene med automatisert protokollen tillatt konsekvent evalueringen av en høyere andel av histologiske parametere enn den manuelle metoden. I tillegg en egen analyse av ulike histologiske parametere ble utført (figur 8B). Arkitektur og basale infiltrere evalueringen var positivt påvirket, spesielt i ubehandlet mus, av eksempel utarbeidelsen med det automatiserte metoden.
Det automatiserte metoden for prøve behandling og innebygging brukt til menneskelig histopathological analyser kan brukes for analyse av murine prøver. Høy kvalitet eksemplarer genereres med det automatiserte metoden som demonstrerer overlegenhet over den manuelle metoden i vurderingen av arkitekturen og de basale immun infiltrere murine colonic vev.
Figur 1: kronisk intestinal inflammasjon evaluering. (A) kolon lengdemåling. (B) Colonic uttrykket av pro-inflammatoriske gener (cxcl10, tnf, mcp-1) i DSS-behandlet (svart barer, n = 12) og ubehandlet mus (hvit barer, n = 6). (C) Immunophenotyping av colonic lamina propria celler i DSS-behandlet (lukket symboler, n = 12) og ubehandlet mus (åpne symboler, n = 6). CD11b + Ly6G + nøytrofile, CD11b + F4 / 80 + makrofager (venstre panel), CD4 + og CD8 + T celler (høyre panel) infiltrasjon i kontroller (åpne symboler, n = 10) og DSS-behandlet mus (lukket symboler, n = 10). Statistisk signifikans beregnet bruker Diversified matchet-parene signert rang t-test. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. Bety verdien ± SEM er rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: beskrivelse av prøven forberedelse. (A) instrumenter kreves for vev forberedelse og bilde av orientert kassetten, komponert av en ekstern kassett (hvit) og interne rutenett med ekstrudert retning tips. (B, C) Innsetting av murine kolon i interne nett kassetten før (B) og etter (C) nedleggelsen av rutenettet. I panelet B er avbildet orientert kassetten (venstre) eller i en tradisjonell kassett (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: beskrivelse av automatiserte. (A, B) automatisert prosessor. (C) ikon som beskriver den riktige parafinvoks smelter temperatur. (D, E) Innsetting av kassetten i metall kurven (D) og nedleggelse (E). (F, G, H) Innsetting av metall kurven i retorten. (I, J, K) Valg av behandling protokollen. (L) kjører protokollen. (M) fjerning av skjemaet kurv retorten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: beskrivelse av automatiserte bygge . (A) bilde av den automatiske embedder. (B, C) Innsetting av kassettene i racket. (D, E) Åpning (D) og lukking (E) av lokket. (F) signal til maskinen av tilstedeværelsen av et rack. (G, H) Innsetting av stativet inn i inntak bolig. (jeg, J) lukking av lokket. (K) Start av innebygging protokollen. (L) åpning av uttaket bolig lokket. (M) fjerning av skjemaet rack stikkontakt bolig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: beskrivelse av automatiserte H & E fargemaskin. (A) bilde av lysbildeholderen. (B, C) Innsetting av lysbildeholderen i maskinen. (D) lukking av maskinen. (E) starten på fargeprotokoll. (F) Exemplificative bilde av et lysbilde etter mikrotomen klipping og H & E flekker. Høyre panel, H & E flekker som eksempel retningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: H & E stainings av colonic prøver danne ubehandlet og DSS-behandlet mus. H & E farging av ubehandlet (A) og DSS-behandlet (B) prøver forberedt (behandlet, innebygd, farget) med automatisert (A, B) eller manuelt (C) metoder. Skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Mallory trichrome (A, B) og IHC stainings av infiltrere CD20 + celler (C, D) av ubehandlet (-vekselstrøm) og DSS behandlet (B, D) mus. Mallory flekker: blå, kollagen, mørk rosa, kjerner, mørk rød, cytoplasma. Skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: sammenligning mellom histopathologic analyser med manuelle og automatiserte protokoller. (A) Total histopathological parametere assessable i alle delene utarbeidet enten manuell (hvit barer) eller med det automatiserte metoden (lilla barer). (B) prosent av de angitte parameterne i prøvene utarbeidet med manuell (hvit barer) eller med automatisert metoden (lilla barer) i ubehandlet (vanlig barer) eller DSS-behandlet mus (prikket barer). Statistisk signifikans beregnet bruker Diversified matchet-parene signert rang t-test. p < 0,05; p < 0.005. Bety verdien ± SEM er rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | tid (min) | temperatur (° C) | Trykk |
| NBF | 1 | RT | ambient |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambient |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambient |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambient |
| Absolutt etanol | 1 | 45 | ambient |
| Absolutt etanol | 11 | 45 | ambient |
| Absolutt etanol | 30 | RT | ambient |
| Xylen | 1 | RT | ambient |
| Xylen | 1 | 45 | ambient |
| Xylen | 28 | 45 | ambient |
| Parafin voks | 5 | 65 | vakuum |
Tabell 1: Automatisert vev behandling protokollen.
| Handlingen perfomed av roboten for hver kassett |
| Fjerne en kassett fra stativet |
| Identifisere kassetten |
| Forvarm mold |
| Plass kassetten på forvarmet mold |
| Dispensere mengden parafin for kassetten |
| Avkjøl mold |
| Tillate parafinen å størkne |
| Fjerne befestet parafin blokken fra formen |
| Presentere blokken kvalitet mot |
| Sted parafinen tekstblokken i output døren |
Tabell 2: Automatisert innebygging protokollen.
| Kategori | Kriterium | Definisjon | Score verdi |
| Inflammatorisk celle infiltrere | Alvorlighetsgrad (leukocytter tetthet av lamina propria infiltrert i vurdert hpf) | Ingen infiltrere | 0 |
| Minimal akutt (< 10%) | 0,25 | ||
| Mild kronisk (10-25%, spredte nøytrofile) | 0,5 | ||
| Moderat kronisk (26-50%) | 0,75 | ||
| Merket (> 51%, tett infiltrere) | 1 | ||
| Grad (utvidelse av leukocytter infiltrasjon) | Slimhinnene | 0,5 | |
| Slimhinnene og submucosal | 0,75 | ||
| Epitel endringer | Hyperplasia (øke i epithelial cellen tallene i langsgående crypts, synlig som krypten forlengelse) | Ingen hyperplasia | 0 |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26-35%) | 0,5 | ||
| Moderat (36-50%, mitoses i øvre tredjedel av crypt epitel) | 0,75 | ||
| Merket (> 51% mitoses i krypten epitel fjernt fra krypten base) | 1 | ||
| Goblet celle tap (reduksjon av goblet cellen tallene i forhold til grunnlinjen goblet cellen tallene per krypten) | Uten tap | 0 | |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26-35%) | 0,5 | ||
| Moderat (36-50%) | 0,75 | ||
| Merket (> 51%) | 1 | ||
| Slimhinnene arkitektur | Sår (epithelial defekt nå utover muscolaris mucosae) | Ingen magesår | 0 |
| Magesår | 0,25 | ||
| Korning vev (bindevev reparasjon med nye kapillærene, omgitt av infiltrere celler, forstørret områder) | Ingen korning vev | 0 | |
| Korning vev | 0,25 | ||
| Mucosal tykkelse og krypten dybde | Ingen jevning | 0 | |
| Jevning | 0,5 | ||
| Kjertel rarefaction | Ingen rarefaction | 0 | |
| Rarefaction | 0,5 | ||
| Dysplasia | Ingen dysplasia | 0 | |
| Dysplasia | 0,5 | ||
| MAX SCORE | 6 |
Tabell 3: Automatisert farging protokollen.
| Handlingen perfomed av fargemaskin for hvert lysbilde | Reagens | tid (s) | temperatur (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinize | Xylen | 120 | RT |
| Deparaffinize | Xylen | 120 | RT |
| Hydrat | Etanol 96% | 120 | RT |
| Hydrat | Etanol 96% | 120 | RT |
| Vask | Destillert wtaer | 240 | RT |
| Flekk Hematoxylin | Carazzi's Hematoxylin | 540 | RT |
| Skyll | Vann fra springen | 360 | RT |
| Flekk Eosin | Eosin Y 1% aqueos løsning | 60 | RT |
| Skyll | Vann fra springen | 120 | RT |
| Tørke | Etanol 96% | 20 | RT |
| Tørke | Etanol 96% | 20 | RT |
| Tørke | Absolutt etanol | 15 | RT |
| Tørke | Absolutt etanol | 15 | RT |
| Klart | Xylen | 30 | RT |
| Klart | Xylen | 30 | RT |
Tabell 4: Scoring ordningen for vurdering av intestinal betennelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi benytter automatisert fremgangsmåten under utarbeidelsen av murine vev for histopathologic analyse. Denne protokollen tar sikte på å gi tekniske tips for å øke reproduserbarhet og standardisering av hele prosessen, dermed forsterke den generelle kvaliteten på den endelige histopathological evalueringen. Vi implementert automatisert instrumenter og metoder for utarbeidelse og innebygging av vev, rutinemessig brukes i patologi kjernen anlegg for studiet av menneskelig prøver.
For å demonstrere potensialet anvendelighet av denne metoden, valgte vi kronisk murine eksperimentelle innstillingen tarm betennelse, kalt DSS-indusert kronisk kolitt modell. Denne innstillingen ligner komplekse sykdom kurset i IBD pasienter, krever omfattende histologiske evaluering å undersøke de dyptgripende endringene av vev arkitekturen oppstår ved kronisk intestinal inflammasjon. Til sammen kan histologiske evaluering av disse prosessene stor nytte fra økt eksempel forberedelse kvalitet. For å merke seg, kan denne protokollen brukes på andre murine vev (dvs. spleens, lymfeknuter, lever, hjernen), med den eneste forskjellen er at orientert kassetten ikke er nødvendig for vev uten en lumen.
Viktigste observasjon var at nedgangen for manuelle feil, (dvs., retning for prøven) bruk av kassetter med rutenett og eliminering av kassett gjenåpning for innebygging (et skritt vanligvis utføres under manuell protokoller), forbedret sterkt den generelle reproduserbarhet analysen. Med protokollen beskrevet her, er utvalget manipulert bare i begynnelsen av preparatet, når eksperimentator setter inn vevet i orientert kassettene. Når lukket, er aldri kassettene gjenåpnet, dermed sikre opprettholdelse av riktig retning og redusere manuelle feil3,11. Standardisering av disse to viktige trinn forbedret hele kvaliteten på de påfølgende analysene og redusert antall tapte eller ikke assessable eksempler, problemer både knyttet til gjenåpningen av kassetten eller feil retning av utvalget3 ,11.
Vi også lykkes i å vurdere en kompleks biologisk hendelsen fibrose (figur 7), som er svært ofte undervurdert i murine modeller av eksperimentelle tarm betennelse, ved gjennomføringen av automatiserte protokollen. Under Oppsett av protokollen standardisert vi strengt som fiksering tiden, som vi innså ikke må overskride 24 timer for å unngå vev endringer. Dermed kan vi bevare kvaliteten på etterfølgende immunohistochemical analyser.
Det automatiserte metoden forbedret evaluering av disse parametrene knyttet til endring av vev arkitektur, spesielt i ubehandlet mus. Faktisk er riktig sammenligning av en patologisk vev med en sunn motpart kritisk viktig for siste vurdering av eksperimentell modell3.
Om vev behandling testet vi forskjellige protokoller skal kjøres i automatisk prosessoren tilgjengelig i laboratoriet. Protokollen beskrevet her ga lyd og svært konsekvente resultater. Vi har også gjennomført en tidsperiode for protokollen. Siden murine prøvene var sammenlignes med menneskelig små biopsic eksemplarer i størrelse, en kortere protokoll var tilstrekkelig til å behandle Trouble (tarm, i dette tilfellet) vev. Endelig, helt automatisert prosedyren redusert eksperimentelle totaltiden. Fra begynnelsen av behandlingen til mikrotomen skjæring og skiver forberedelse beregnet vi at totaltiden krevde er 5 h. Tvert imot, avhengig av den tekniske muligheten til operatøren, kan fullføring av samme protokoller manuelt kreve mer enn dobbelt så mye tid, spesielt under behandlingen og innebygging. En grense av teknikken er at det krever automatisert prosessorer og embedder utføres for å være i laboratoriet.
Avslutningsvis tror vi at gjennomføringen av disse automatiserte protokollene kan sterkt forbedre arbeidet translasjonsforskning forskere arbeider med murine eksperimentelle modeller av menneskelige sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Institutt for patologi på IRCCS Policlinico Hospital, Milan kundestøtte og IEO dyr anlegget for hjelp i dyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
Tags
Immunologi og infeksjon problemet 143 histopathological analyse murine modeller automatisering innebygging system standardisering murine intestinal prøverErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
