Ce protocole montre comment purifier les microARN extracellulaires de milieux de culture cellulaire pour petite construction de bibliothèque de RNA et de séquençage de la génération suivant. Différents points de contrôle de contrôle de la qualité sont décrites pour permettre aux lecteurs de comprendre à quoi vous attendre lorsque vous travaillez avec des échantillons d’entrée faibles comme exRNAs.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Extracellulaires et circulation RNAs (exRNA) sont produites par plusieurs types de cellules du corps et existent dans nombreux fluides corporels comme la salive, plasma, sérum, lait et l’urine. Un sous-ensemble de ces ARN sont les régulateurs post-transcriptionnel – microARN (miARN). Pour délimiter les miARN produites par les types spécifiques de cellules, systèmes de culture in vitro permet de récolter et profil exRNAs dérivé d’un sous-ensemble de cellules. Les facteurs sécrétés de cellules souches mésenchymateuses sont impliqués pour soulager de nombreuses maladies et est utilisé comme système modèle in vitro ici. Cet article décrit le processus de collecte, de purification de petits ARN et de génération de la bibliothèque de séquence miARN extracellulaire. ExRNAs de milieux de culture diffèrent des ARN cellulaire étant faibles échantillons d’entrée d’ARN, qui prévoit des procédures optimisées. Ce protocole fournit un guide complet à exRNA petite séquence de milieux de culture, montrant les points de contrôle de la qualité à chaque étape au cours de la purification d’exRNA et de séquençage.
Introduction
Extracellulaire et circulant RNAs (exRNAs) sont présents dans divers liquides organiques et sont résistants vers RNases1,2. Leur abondance élevée, la stabilité et la facilité d’accessibilité sont attrayants pour l’évaluation clinique des marqueurs diagnostiques et pronostiques3. Le mode de transport pour exRNAs comprennent les vésicules extracellulaires (EVs), liaison avec les lipoprotéines (tels que les lipoprotéines de haute densité ; HDL) et des complexes ribonucléoprotéiques (comme avec des complexes Argonaute2)4.
Un sous-ensemble ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
NOTE : Milieu de culture de cellules souches mésenchymateuses (médias MSC) est établi au préalable, comme indiqué dans la Table des matières.
1. culture cellulaire
Remarque : Les cellules souches mésenchymateuses humaines peut provenir de la moelle osseuse, tissu adipeux ou autres sources11. Alternativement, les CSM peut être achetés chez un fournisseur. Le BMSC utilisés dans le présent protocole ont été dérivées de la moelle osseuse des patients et acheté auprès d’une société.
- Décongelez les 1 x 106 BMSC dans une fiole de T175 contenant 20 mL de média....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La méthode décrite dans le présent protocole est optimisée afin de recueillir des exRNA de culture MSC pour l’ordonnancement de la génération suivante. L’économie générale du flux de travail est à la Figure 1 sur la gauche et les points de contrôle de la qualité respective sont sur la droite.
La morphologie des cellules sur le jour du prélèvement pour indifférencié (Figure 3 a
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour l’ordonnancement de production prochaine d’exRNAs qui permet des analyses des échantillons d’entrée faibles expression différentielle. Il est important de respecter un protocole spécifique pour l’isolement EV et exRNA parce que même de petites modifications (l’étape de l’ultracentrifugation ou un changement de type de rotor) peuvent influencer le transcriptome et miRNA niveaux13,14. Ainsi, quelle que soit la façon dont l’exRNA.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à M. Claus Bus et Mme Rita Rosendahl à iNANO pour leur assistance technique. Merci à Dr Daniel Otzen pour permettre à notre usage fréquent de son ultracentrifugeuse. Cette étude a été financée par le fonds d’Innovation danois (projet MUSTER).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse | ATCC | PCS-500-012 | Les cellules utilisées dans ce protocole ont été achetées à ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Qualifié de milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses (milieu MSC) |
| FBS appauvri en exosomes | Gibco | A2720801 | |
| Milieu collecteur d’ExARN : MSCGM mais avec le FBS remplacé par un FBS appauvri en exosomes | |||
| Trypsine-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flacon | Sarstedt | 833,912 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Tamponné Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Bouteille en polycarbonate avec bouchon | Beckman Rotor Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | utilisé ici | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| &beta ;-glycérophosphate | Calbiochem | 35675 | Composants du milieu de différenciation ostéogénique |
| Dexaméthasone | Sigma | D4902-25MG | Composants du milieu de différenciation ostéogénique |
| 2-Phospho-L-ascorbique ; sel trisodique acide | Sigma | 49752-10G | Composants du milieu de différenciation ostéogénique |
| 1&alpha ;,25-Dihydroxyvitamine ; D3 | Sigma | D1530-1MG | Composants du milieu de différenciation ostéogénique |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | kit de purification de miARN et d’ARN total pour l’étape 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Machine d’électrophorèse capillaire à base de puce et puces pour l’analyse de l’ARN et de l’ADN |
| Agilent 2100 Bioanalyseur | Agilent Technologies | G2939BA | Machine d’électrophorèse capillaire sur puce et puces pour l’analyse de l’ARN et de l’ADN |
| Kit d’ADN haute sensibilité | Agilent Technologies | 5067-4626 | Machine d’électrophorèse capillaire sur puce et puces pour l’analyse de l’ARN et de l’ADN |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Kit de quantification de la bibliothèque |
| utilisé ici TruSeq Small RNA Library Prep Kit - Set A (24 rxns) (Set A : indices 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Petit kit de préparation de banque d’ARN utilisé dans ce protocole - utilisé à l’étape 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Extracteur automatisé de gel d’ADN utilisé dans ce protocole ; l’extraction manuelle peut également être effectuée | |
| MinElute Kit de purification PCR | Qiagen | 28004 | Purification PCR à l’étape 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Élagage des lectures de mauvaise qualité à l’étape 6 | |
| cutadapt | Retrait de l’adaptateur à l’étape 6 | ||
| Nœud papillon | Cartographie des lectures propres à l’étape 6 | ||
| Samtools | Pour créer le profil d’expression à l’étape 6 | ||
| Bedtools | Pour créer le profil d’expression à l’étape 6 |
Références
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circul....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
