Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.
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Article de méthode
Immunotransfert quantitative de lignées cellulaires comme norme pour valider l’Immunofluorescence pour quantifier les biomarqueurs des protéines dans des échantillons de tissus courants
Dans cet article
Résumé
Résumé
Quantification des protéines d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFPE) est importante dans les cliniques et les demandes de recherche. Une méthode de quantification optimale est exacte, dispose d’une large gamme dynamique linéaire et maintient l’intégrité structurale de l’échantillon permettant l’identification des types de cellules individuelles. Les méthodes actuelles telles que l’immunohistochimie (IHC), spectrométrie de masse et immunoblotting chacun ne satisfont pas à ces dispositions en raison de leur nature catégorique ou besoin d’homogénéiser l’échantillon. Comme méthode alternative, nous vous proposons l’utilisation de l’immunofluorescence (IF) et analyse d’image pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans les tissus FFIP. Dans les présentes, nous démontrons que cette méthode est facilement optimisée, donne une large gamme dynamique et est quantifiable linéairement par rapport à l’étalon-or d’immunoblotting quantitative. En outre, cette méthode permet le maintien de l’intégrité structurale de l’échantillon et permet la distinction des divers types de cellules, qui peut être crucial dans les applications de diagnostic. Dans l’ensemble, c’est une méthode robuste à la quantification relative de protéines dans des échantillons FFPE et peut être facilement adapté à la fonction clinique ou besoins en recherche.
Introduction
La nécessité de quantifier des protéines dans des échantillons fixés au formol, paraffine de biopsie du tissu (FFIP) existe dans de nombreux domaines cliniques. Par exemple, des protéines de biomarqueurs chez les spécimens de biopsie systématique est employé pour élucider le pronostic et informer le traitement pour le cancer patients1. Cependant, les méthodes actuelles sont généralement subjectives et manquent de validation.
L’immunohistochimie (IHC) est utilisé de manière routinière dans les laboratoires de pathologie et dépend généralement un anticorps primaire dirigé à la protéine cible et un anticorps secondaire conjugué avec une étiquette enzymatique comme la peroxydase de raifort2. IHC conventionnelle est sensible, peut faire utilisation de minute Echantillons et préserve l’intégrité morphologique des échantillons de tissu permettant l’évaluation de l’expression de la protéine dans son contexte histologique pertinente. Cependant, parce que le signal chromogénique généré par IHC est soustractif, il souffre d’une gamme dynamique relativement étroite et offre un potentiel limité pour le multiplexage2,3,4. Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MSI) d’imagerie préserve l’intégrité morphologique. Cependant, ce développement de la technologie est associée à une résolution morphologique modeste et nécessite significative d’étalonnage et de la normalisation, altérant sa faisabilité pour utilisation clinique courante5,6,7. Les autres techniques pour quantifier les protéines dans des échantillons de tissus incluent immunoblotting8, spectrométrie de masse9,10,11et enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, chaque de qui commence avec un homogénéisé lysat de tissu de l’échantillon. Des échantillons de tissus primaires sont hétérogènes, car ils contiennent une multitude de types de cellules. Par conséquent, des techniques qui impliquent l’homogénéisation des échantillons ne permettent pas de quantification d’une protéine dans une population de cellules particulières d’intérêt tels que les cellules cancéreuses.
Comme IHC, si s’applique aux petites FFIP Echantillons et permet le maintien de l’intégrité histologique13. Cependant, grâce à la nature additive des signaux fluorescents, si se prête à l’application de plusieurs anticorps primaires et étiquettes fluorescentes. Ainsi, une protéine d’intérêt peut être relativement quantifiée dans des cellules spécifiques ou des compartiments cellulaires (par exemple, noyau et cytoplasme) définies à l’aide d’autres anticorps. Signaux de fluorescence ont aussi l’avantage d’une plus grande gamme dynamique13,14. La supériorité, la reproductibilité et potentiel de multiplexage de si appliquée à des échantillons FFPE a été démontrée13,14,15.
Ci-après nous décrivent l’utilisation de l’immunotransfert quantitative à l’aide de lignées cellulaires établies comme un étalon-or pour déterminer la nature quantitative de si couplée avec l’analyse d’images assistée par ordinateur pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans coupes histologiques FFIP d’échantillons de tissus. Nous avons appliqué cette méthode avec succès dans une approche multiplexe pour quantifier les protéines biomarqueur dans des échantillons de biopsie clinique16,17,18.
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Protocole
Autorisation d’utiliser des échantillons de tissus humains primaires a été obtenue de la Health Sciences et affilié hôpitaux d’enseignement recherche Ethics Board (HSREB) à l’Université Queen.
1. construction d’un lignée cellulaire tissu Microarray (TMA)
- Récolter et laver les cellules.
Remarque : Ce protocole a été testé sur plusieurs lignes de cellules immortalisées (p. ex. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Pour les cellules adhérentes, récolter environ 1,3 x 107 cellules dès qu’ils atteignent environ 80 % de confluence. Détacher les cellules à l’aide d’un réactif approprié pour cette ligne de la cellule.
NOTE : Acide Tétraacétique (EDTA) est généralement préférée à la trypsine pour réduire le risque de dégrader les protéines de surface. Si vous utilisez la trypsine, neutraliser la trypsine à l’aide de sérum fœtal (SVF) immédiatement après la récolte des cellules. - Pour les cellules en suspension, récolter environ 8 x 107 cellules en phase de croissance logarithmique.
- Recueillir les cellules récoltées/détaché par centrifugation pendant 5 min à 225 g dans un tube conique de 50 mL.
- Décanter le liquide surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de 1 X solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger pendant 5 min à 225 x g et éliminer le surnageant.
Remarque : 1 X PBS est composée de 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 dans l’eau distillée ; ajuster le pH à 7,4.
- Pour les cellules adhérentes, récolter environ 1,3 x 107 cellules dès qu’ils atteignent environ 80 % de confluence. Détacher les cellules à l’aide d’un réactif approprié pour cette ligne de la cellule.
- Fixer les cellules dans du formol et les granulés.
- Suspendre le culot cellulaire dans le tube à fond conique dans 10 mL de formol tamponné neutre de 10 % (NBF).
NOTE : NBF peut être préparé en diluant 1 mL de solution mère de 37 % de formaldéhyde dans 9 mL de solution 1 PBS X.
Attention : Soyez prudent lorsque vous manipulez le formol et le formaldéhyde. Utiliser une hotte aspirante pour étapes impliquant le formol et le formaldéhyde. - Incuber les cellules sur un rocker à 24 t/mn à température ambiante pendant la nuit (environ 17 h).
- Préparer une solution à 1 % d’agarose de la bas point de fusion dans du PBS (0,01 g d’agarose par 1 mL de PBS).
- Préparer suffisamment pour 500 µL de solution d’agarose par échantillon ligne cellulaire.
- Dissoudre l’agarose dans un 80 ° C eau bain-marie ou bloc chauffant, avec occasionnellement mélanger pendant 2-5 min. Une fois dissous, conserver la solution dans un 37 ° C eau bain-marie ou bloc chauffant pour empêcher le durcissement.
- Pellet les cellules fixes d’étape 1.2.2 par centrifugation pendant 5 min à 225 x g. éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS 1 x.
- Transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et pellet par centrifugation pendant 5 min à 290 x g. aspirer tous le surnageant.
- Suspendre le culot cellulaire dans le tube à fond conique dans 10 mL de formol tamponné neutre de 10 % (NBF).
- Monter les cellules dans l’agarose.
- Ajouter ~ 500 µL de solution d’agarose à 1 % (à l’étape 1.2.3) dans chaque tube contenant les cellules. Doucement, mais rapidement, pipetter mélange et descendre à l’aide d’une micropipette P-1000 mélanger.
NOTE : Couper l’extrémité de l’embout de la pipette pour agrandir l’ouverture et éviter la formation de bulles. Conserver la solution d’agarose dans le bain d’eau de 37 ° C afin d’empêcher le durcissement. - Laisser la solution d’agarose-cellule à durcir (5-10 min) à température ambiante. Ajouter 1 mL de 10 % NBF à chaque microtubes contenant un échantillon de tube et conserver à température ambiante jusqu'à paraffine embedding (jusqu'à 24 h).
- Ajouter ~ 500 µL de solution d’agarose à 1 % (à l’étape 1.2.3) dans chaque tube contenant les cellules. Doucement, mais rapidement, pipetter mélange et descendre à l’aide d’une micropipette P-1000 mélanger.
- Préparer la fiche d’agarose pour l’enrobage de paraffine.
- Aspirer au large de la FBN de l’échantillon.
- Enlever le bouchon de cellule à l’aide d’une lame de rasoir pour couper le tube de microcentrifuge, mettez la fiche dans la cassette de tissu en plastique. Stocker des cassettes dans 10 % NBF à température ambiante.
- Traiter les échantillons du jour au lendemain soit manuellement ou en utilisant un processeur de tissus automatisés et incorporez en cire de paraffine à l’aide de méthodes standard de l’histologie.
Remarque : Voir Fischer et al. 19 pour un protocole de l’exemple. - En utilisant un spécialisé « arrayer tissu » instrument, de la récolte en double cœurs de 0,6 mm de la paraffine bloquent de chaque lignée cellulaire et introduisez-les, en rangées, dans un bloc de paraffine destinataire vide afin de créer une lignée de cellules TMA.
Remarque : Les méthodes Standard doivent être utilisées comme celles décrites dans Fedor et De Marzo20. - Incorporer les carottes prélevées sur des échantillons primaires représentant 2-3 types de tissus supplémentaires (p. ex., amygdale, côlon, testicules, etc.) sous forme de contrôles positifs ou négatifs dans l’ordre des médecins. Choisissez les tissus qui sont appropriés pour la protéine d’intérêt.
- Un microtome permet de préparer deux coupes histologiques, environ 4 à 6 µm d’épaisseur, de la lignée cellulaire TMA. Monter la section sur une lame d’histologie, séchez-le et Déparaffiner (comme décrit dans Fedor et De Marzo20).
2. l’échantillon de coloration par Immunofluorescence
- Optimiser la dilution de l’anticorps primaire.
Remarque : Il existe des protocoles Standard pour l’optimisation d’IHC ou si, pour des sections de tissu FFPE comme dans Kajimura et al. 21. un bref aperçu de l’approche est décrite ici.- Préparer des dilutions de 4-5 d’anticorps primaire de la protéine d’intérêt guidé par les instructions du fabricant.
- Identifier un type de tissu de contrôle provenant d’une source animale ou humaine qui exprime la protéine d’intérêt dans les populations de cellules morphologiquement reconnaissables. Préparer des sections de tissu et les monter sur une diapositive suivant procédure immunohistochimie standard telles que Fedor et De Marzo20.
Remarque : Le nombre de sections requises est le nombre de dilutions de l’anticorps primaire, plus un supplémentaire. - À l’aide d’un système automatisé ou manuel pour immunohistologie, tester les dilutions de l’anticorps primaire de l’étape 2.1.1 chaque diapositive de l’étape 2.1.2. Omettez l’application d’anticorps primaire de la diapositive supplémentaire et utilisez-le comme témoin négatif.
- Pendant le processus de coloration, une coloration toutes les diapositives avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme contre-colorant nucléaire et un anticorps secondaire fluorescent étiqueté. Si une plus grande sensibilité est nécessaire, utilisez un HRP (peroxydase de raifort)-conjugués anticorps secondaire et système d’amplification de signal tyramide-basé (voir pile et al. ( 13).
Remarque : Lorsque le multiplexage des anticorps primaires, une étiquette différente fluorescente est utilisée pour chaque protéine. - Numérisez les diapositives d’immunomarquage à l’aide d’un instrument approprié capable de générer un fichier d’image numérique à l’aide d’excitation et détection de longueurs d’onde appropriées pour les fluorophores utilisés.
- Utiliser un logiciel approprié pour afficher les images numériques et choisissez empiriquement la dilution de l’anticorps primaire qui optimise l’intensité du signal par rapport à la fluorescence de fond.
Remarque : Si vous le souhaitez, cette optimisation peut se produire à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué HRP, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) et microscopie de fond clair.
- Effectuer si la coloration sur la lignée cellulaire TMA.
- Utiliser un système automatisé ou manuel pour immunohistologie sur la tache une diapositive d’une lignée cellulaire TMA avec la dilution de l’anticorps primaire optimisé (tel que déterminé à l’étape 2.1). Omettez l’application d’anticorps primaire de la deuxième diapositive et utilisez-le comme témoin négatif.
- Pendant le processus de coloration, une coloration toutes les diapositives avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme contre-colorant nucléaire et avec un anticorps secondaire et tyramide comme au point 2.1.4.
- Numérisez les diapositives d’immunomarquage à l’aide d’un instrument approprié capable de générer un fichier d’image numérique à l’aide d’excitation et détection de longueurs d’onde appropriées pour les fluorophores utilisés.
- Utiliser un progiciel d’analyse image pour identifier le compartiment cellulaire d’intérêt (c.-à-d., cytoplasme et noyau) et de quantifier l’intensité de la fluorescence moyenne (MFI) pour chaque ligne de la cellule.
Remarque : Divers progiciels peuvent être utilisés à cet effet et beaucoup sont discutés dans la pile et al. 13.
3. quantitative Immunoblotting de lignées cellulaires
- Préparer des lysats de cellules.
- Récolter 2 millions de cellules de chaque ligne de la cellule, comme décrit aux points 1.1.1 à 1.1.3.
- Faire tourner les cellules vers le bas pendant 5 min à 650 x g dans un tube conique de 50 mL. Décanter le liquide surnageant.
- Laver les cellules avec 10 mL de PBS glacée. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS glacée et le transfert à un tube de microtubes de 1,5 mL. Centrifuger comme par l’Etape 3.1.2, décanter et laisser les cellules sur la glace.
- Ajouter environ 200 µL de tampon de lyse froid immunoprécipitation (RIPA) avec les inhibiteurs de la protéase (10 µL d’inhibiteurs de X 100 / mL de tampon de lyse RIPA) aux cellules, vortex et incuber sur la glace pendant 15 minutes.
Remarque : La quantité de tampon de lyse requis pour lyse efficace varie selon la lignée cellulaire et peut être déterminée de manière empirique. Mémoire tampon RIPA est composé de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0 % NP-40, désoxycholate de sodium 0,5 %, SDS 0,1 % dans l’eau distillée. - Afin d’assurer le chargement relativement même sur l’immuno-Blot, quantifier les protéines totales dans un échantillon de 20 µL de chaque lysat en utilisant une méthode appropriée, tels que l’essai de Bradford. Ajouter environ 40 µL de tampon de lyse X Laemmli 6 pour le reste (environ 180 µL) de chaque lysat cellulaire et faites bouillir à 100 ° C dans un bain de chaleur bloc ou de l’eau pendant 5 min.
NOTE : 6 X Laemmli tampon est composé de 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4 % (p/v) SDS, 60 % de glycérol, de 0,6 % (p/v) de bromophénol bleu, 50 mM le dithiothréitol (DTT) dans l’eau distillée. - Stocker les échantillons à-20 ° C pendant deux semaines.
- Effectuer un transfert de toutes les lignées de cellules afin de déterminer quelle ligne de la cellule est la protéine la plus abondante d’intérêt.
Remarque : Suivez la procédure décrite dans les marais, T. et Yang, PC. 22, avec les modifications suivantes.- Aliquote cell lysate (document établi en étape 3.1) contenant 10 à 50 µg de protéines (en fonction de l’abondance de la protéine d’intérêt) dans des tubes de microcentrifuge. Ajouter 2,5 µL de tampon de Laemmli X 6 et de tampon de lyse RIPA suffisante pour transformer le volume jusqu'à 15 µL.
- Charger un empilage de 5 % et une concentration appropriée de résoudre (par exemple, 10 % pour les protéines entre 15 et 100 kDa) gel SDS-PAGE avec une échelle de protéine et les échantillons de l’étape 3.2.1. Charge 1 X Laemmli tampon dans puits vides. Exécuter le bloc d’alimentation à des réglages appropriés, généralement 125 V, 80 min ou jusqu'à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond de la plaque.
- Effectuer un transfert de protéines demi-sec, tel que décrit Wiedemann et al. 23.
Remarque : pour des résultats représentatifs, une membrane de nitrocellulose (qui n’a pas besoin d’être trempés dans du méthanol), et le tampon de transfert froid Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) ont été utilisés. Tampon BSN est composé de 48 mM Tris, glycine de 39 mM, méthanol 20 % dans l’eau distillée. - Après transfert, utiliser une lame de rasoir pour couper la membrane horizontale pour séparer la partie contenant la protéine d’intérêt d’une protéine de contrôle interne appropriés, tels que GAPDH.
- Procéder au blocage et anticorps incubations en utilisant le tampon de blocage recommandé par le fabricant de l’anticorps primaires.
Remarque : Les dilutions de l’anticorps primaire optimale peuvent varier considérablement selon la sensibilité et l’abondance de la protéine. Pour les résultats représentatifs ci-dessous, l’anticorps à la protéine d’intérêt requis une dilution de 1 : 1 000, tandis que le contrôle GAPDH requis une dilution de 1:40,000. La dilution d’anticorps secondaires utilisé était de 3 000:1. - Après incubation des anticorps et le lavage de la membrane, placer les bandes de membrane dans une gaine en plastique transparent comme un sac à sandwich.
- Préparer enchanced chimiluminescence (ECL) mélange suivant les instructions du fabricant. Utiliser une pipette de P-1000 pour couvrir la membrane avec le mélange de l’ECL, fermez la gaine et incuber les bandes de membrane avec le mélange dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 à 2 min.
- Placer la gaine de la membrane dans une plate-forme d’imagerie numérique. Utilisation de chimiluminescence et détection colorimétrique marqueur pour capturer les diverses expositions de la membrane.
NOTE : Temps d’exposition varie selon la quantité de protéines chargées, abondance de protéine cible, affinité anticorps etc. commencent par une exposition automatique (en général quelques secondes) et temps d’exposition de test au-dessus et en dessous par intervalles de quelques secondes. - Empiriquement, ou en utilisant le logiciel d’analyse image, déterminer quelle ligne de la cellule exprime le plus la protéine cible.
- Trouver la plage dynamique linéaire de chaque anticorps primaire en utilisant une dilution en série.
- Effectuer des mesures 3.2.1-3.2.8 à l’aide d’une série de dilutions en série de la lignée cellulaire qui exprime la concentration la plus élevée de la protéine cible (identifiée à l’étape 3.2.9).
- Logiciel d’analyse image comme ImageJ permet d’effectuer la densitométrie sur les images de l’exposition.
- Par exemple, à l’aide de ImageJ, utilisez l’outil de Sélection rectangulaire pour sélectionner la première voie du gel pour quantifier. Aller à analyser | Gels | Sélectionnez la première ruelle. Utilisez la souris pour déplacer le rectangle résultant à la prochaine voie. Aller à analyser | Gels | Sélectionnez Next Lane. Déplacer le rectangle vers la voie suivante et sélectionnez la voie pour le reste des voies à plusieurs reprises.
- Aller à analyser | Gels | Tracer des voies. Utilisez l’outil de Ligne droite pour dessiner des lignes à travers les bases de chaque pic pour éliminer le bruit de fond. Utilisez l’outil baguette magique pour sélectionner chaque pic et recueillir la densité de chaque pic, désormais dénommé intensité de bande, de la fenêtre de résultats .
- Utilisez la densitométrie de sortie pour créer un diagramme de dispersion de la bande intensité par rapport à la quantité de protéines totales chargés pour chaque anticorps primaire. À l’aide d’une ligne de meilleur ajustement et une inspection visuelle, déterminez l’emplacement (plage d’intensité) de la gamme dynamique linéaire de chaque anticorps.
- Choisir une concentration de protéine qui génère une valeur sur l’extrémité supérieure de la gamme linéaire la concentration va de l’avant avec les lignées cellulaires.
Remarque : Étant donné que cette concentration est au-dessous du niveau de saturation dans la lignée de cellules avec la plus grande quantité de cette protéine, au-dessus ne doit être aucun danger d’exposer les bandes pour les autres lignées cellulaires.
- Effectuer un immunoblot en utilisant la concentration de protéine choisie à l’étape 3.3.4 pour toutes les lignées cellulaires et répétez les étapes 3.2.1-3.2.8.
- Effectuer la densitométrie sur les scans numériques comme au point 3.3.2. Choisir les images des expositions qui donnent des signaux dans les gammes linéaires pour chaque anticorps identifié à l’étape 3.3.3.
- À l’aide de l’intensité de la bande des signaux de l’exposition idéale de 3.4.1, calculer le rapport de cible protéine bande intensité à intensité de bande de contrôle pour chaque ligne de la cellule de chargement. Ces valeurs indiquent l’abondance relative de la protéine cible d’intérêt.
- Effectuer un test de corrélation de Pearson (peut être fait à l’aide du progiciel de statistiques) pour établir une corrélation entre les valeurs obtenues par l’analyse d’image de l’IF coloration (étape 2.2) à ceux obtenus par immunotransfert (étape 3.4.2).
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Résultats
Ce protocole a été utilisé pour confirmer la capacité de IF pour déterminer la quantité relative de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 dans les lignées cellulaires à confectionner des blocs de tissus FFIP. Quantification de Bcl-2 sélectivement dans les cellules cancéreuses peut élucider les mécanismes oncogènes et peut être utile dans le diagnostic pathologique et en informant des décisions de prise en charge clinique24. Plus précisément, Bcl-2 joue un rôle dans le...
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Discussion
Nous avons décrit une méthode qui utilise immunoblotting quantitative (IB) pour démontrer l’utilité de l’immunofluorescence (IF) pour déterminer l’abondance relative d’une protéine cible dans les échantillons de tissus FFIP. Les méthodes actuelles de quantification des protéines sont limités par leur nature catégorique, comme chromogène IHC2,3, ou par la nécessité d’homogénéiser les échantillons, empêchant l’enquête sur la population échantillon de structure et c...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé en partie par le Fredrick Banting et Charles Best Canada Graduate Scholarship (a.m.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Lignée cellulaire |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Lignée cellulaire |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Lignée cellulaire |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Lignée cellulaire |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Lignée cellulaire |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Lignée cellulaire |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Lignée cellulaire |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Lignée cellulaire |
| Trypsine/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | Pour détacher les cellules adhésives |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | Pour neutraliser la trypsine |
| Protocole de formaline tamponné neutre | 245-684 | Pour fixer les pastilles | |
| cellulaires Agarose à faible point de fusion UltraPure | Invitrogen | 15517-022 | Pour couler les granules cellulaires |
| Anticorps monoclonal anti-humain Bcl-2 de souris, clone 124 | Dako (Agilent) | cat# : M088729-2, RRID : 2064429 | Pour détecter Bcl-2 par immunofluorescence et immunotransfert (lot# : ; 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche-Pour | l’automatisation de la coloration par immunofluorescence | |
| Système EnVision+- Polymère marqué HRP (anti-souris) | Dako (Agilent) | K4000 | Pour l’amplification du signal d’immunofluorescence |
| Système EnVision+- Polymère marqué HRP (anti-lapin) | Dako (Agilent) | K4002 | Pour l’amplification du signal d’immunofluorescence |
| Cyanine 5 réactif de tyramide | Perkin Elmer | NEL745001KT | Pour l’amplification du signal d’immunofluorescence |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems-Pour | afficher les lames numérisées | |
| Logiciel d’analyse d’images HALO | Indica Labs-Pour | d’immunofluorescence | |
| (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | Pour ajouter à Tampon RIPA |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | BioShop | EDT001 | Pour tampon RIPA |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | Pour tampon RIPA |
| Désoxycholate de sodium | Sigma-Aldrich | D6750 | Pour tampon RIPA |
| Glycérol | FisherBiotech | BP229 | Pour tampon Laemlli |
| Bleu de bromophénol | BioShop | BRO777 | Pour tampon Laemlli |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | Pour tampon Laemlli |
| Albumine sérique bovine (BSA) | BioShop | ALB001 | Pour les lavages immunoblot |
| Échelle protéique (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | Pour l’utilisation du gel protéiné |
| Papier filtre (Papier tampon extra épais) | Bio-Rad | 1703969 | Pour le buvard |
| transfert Membrane nitrocellulosique | Bio-Rad | 162-0115 | Pour transfert |
| trans-blot SD cellule de transfert semi-sèche | Bio-Rad | 1703940 | Pour transfert demi-sec |
| Lait écrémé en poudre (lait écrémé en poudre) | Cell Signaling Technology | 9999S | Pour tampon de blocage |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | Pour tampon de lavage |
| GAPDH rabbit anticorps monoclonal | Epitomics | 2251-1 | Anticorps primaire de la protéine de contrôle (lot # : YE101901C) |
| Anticorps IgG anti-souris de chèvre (HRP conjugué) | abcam | cat# : ab6789, RRID : AB_955439 | Anticorps secondaire pour immunoblot |
| Anticorps IgG anti-lapin de chèvre (HRP conjugué) anticorps | abcam | cat# : ab6721, RRID : AB_955447 | Anticorps secondaire pour immunoblot (lot # : GR3192725-5) |
| Clarity Western Substrats ECL | Bio-Rad | 1705060 | Pour la détection des signaux immunoblot |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | Pour la détection des signaux immunoblot |
| Logiciel | ImageJ Freeware, NIH-Pour | l’analyse densitométrique |
Références
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