Method Article

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

DOI:

10.3791/58735

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.

Abstract

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Quantificação de proteínas de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) é importante na clínica e aplicações de pesquisa. Um método ideal de quantificação é exato, tem uma ampla gama de dinâmica linear e mantém a integridade estrutural da amostra para permitir a identificação dos tipos de células individuais. Métodos atuais como imuno-histoquímica (IHC), espectrometria de massa e immunoblotting cada um não cumprem estas estipulações devido à sua natureza categórica ou necessidade de homogeneizar a amostra. Como um método alternativo, propomos a utilização de análise de imagem para determinar a abundância relativa de uma proteína de interesse em tecidos FFPE e imunofluorescência (IF). Neste documento vamos demonstrar que este método é facilmente otimizado, produz uma ampla faixa dinâmica e é linearmente quantificável em comparação com o padrão-ouro de immunoblotting quantitativa. Além disso, este método permite a manutenção da integridade estrutural da amostra e permite a distinção de vários tipos de células, que pode ser crucial em aplicações diagnósticas. Globalmente, este é um método robusto para a quantificação relativa de proteínas nas amostras FFPE e pode ser facilmente adaptado para atender clínicas ou as necessidades de investigação.

Introduction

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A necessidade de quantificar proteínas no formalin-fixas, parafina amostras de biópsia de tecido (FFPE) existe em muitos campos clínicos. Por exemplo, quantificação de proteínas biomarcador em espécimes de biópsia de rotina é usada para elucidar o prognóstico e informar o tratamento para pacientes de câncer1. No entanto, métodos atuais são tipicamente subjetivos e faltam de validação.

Imuno-histoquímica (IHC) é usado rotineiramente em laboratórios de patologia e geralmente depende de um anticorpo primário dirigidas a proteína do alvo e um anticorpo secundário conjugado com um rótulo enzimático, tais como a peroxidase....

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Protocol

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Aprovação para usar as amostras de tecido humano primário foi obtida as Ciências da saúde e afiliado hospitais de ensino pesquisa ética Board (HSREB) na Universidade da rainha.

1. construção de um linha celular tecido Microarray (TMA)

  1. Células de colheita e lavagem.
    Nota: Este protocolo foi testado em várias linhas celulares imortalizado estabelecidas (por exemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. Para as células aderentes, colheita aproximadamente 1,3 x 107 células quando atingem cerca de 80% de confluência. Separe células usando um reagente apropriado para essa linha de celular.
      Nota: O ácido etilenodiami....

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Results

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Este protocolo foi utilizado para confirmar a capacidade de se determinar a quantidade relativa da proteína anti apoptótica Bcl-2 em linha de celular feita em blocos de tecido FFPE. Bcl-2 quantificando seletivamente nas células cancerosas pode elucidar mecanismos oncogênicos e pode ser útil no diagnóstico patológico e em informar as decisões de manejo clínico24. Mais especificamente, Bcl-2 desempenha um papel no desenvolvimento de linfócitos adequado, e a sua expre.......

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Discussion

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Descrevemos um método que faz uso de immunoblotting quantitativa (IB) para demonstrar a utilidade da imunofluorescência (IF) para determinar a abundância relativa de uma proteína do alvo em amostras de tecido FFPE. Métodos de quantificação da proteína atual são limitados pela sua natureza categórica, como cromogênico IHC32,, ou pela necessidade de homogeneizar as amostras, impedindo a investigação sobre as populações de estrutura e célula de amostra, tais como co.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi parcialmente financiado pela Fredrick Banting e Charles Best Canadá Graduate Scholarship (A.M.).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
697DSMZACC 42Linha celular
JeKo-1ATCCCRL-3006Linha celular
JurkatATCCTIB-152Linha celular
RCH-ACVDSMZACC 548Linha celular
Granta-519DSMZACC 342Linha celular
REHDSMZACC 22Linha celular
RajiLinha celular ATCCCCL-86
HeLaLinha celular ATCCCCL-2
Solução de tripsina / EDTAInvitrogenR001100Para separar células adesivas
Soro bovino fetal (FBS)Wisent Inc.81150Para neutralizar a tripsina
Neutro TamponadoFormalina Protocolo245-684Para fixação de pellets de células
UltraPure baixo ponto de fusão agaroseInvitrogen15517-022Para pellets de células de fundição
Anticorpo monoclonal de camundongo Bcl-2 anti-humano, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429Para detectar Bcl-2 por imunofluorescência e immunoblot (lote#:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-Paraautomação da coloração de imunofluorescência
Sistema EnVision+ - Polímero marcado com HRP (anti-mouse)Dako (Agilent)K4000Para amplificação de sinal de imunofluorescência
Sistema EnVision+ - Polímero marcado com HRP (anti-coelho)Dako (Agilent)K4002Para amplificação de sinal de imunofluorescência
Cianina 5 reagente de tiramidaPerkin ElmerNEL745001KTPara amplificação de sinal de imunofluorescência
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Paravisualizar lâminas digitalizadas
Software de análise de imagem HALOIndica Labs-Paraquantificação de inibidores de protease de imunofluorescência
(coquetel de inibidores de protease Halt, 100X)Thermo Scientific1862209Para adicionar a Tampão RIPA
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)BioShopEDT001Para tampão RIPA
NP-40BDH Limited56009Para tampão RIPA
Desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750Para tampão RIPA
GlicerolFisherBiotechBP229Para tampão Laemlli
Azul de bromofenolBioShopBRO777Para tampão Laemlli
Ditiotreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Para tampão Laemlli
Albumina de soro bovino (BSA)BioShopALB001Para lavagens de immunoblot
Escada de proteína (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Para gel de proteína em execução
Papel de filtro (papel de borrão extra grosso)Bio-Rad1703969Para blotting transferência
Membrana de nitroceluloseBio-Rad162-0115Para transferência de transferência
Trans-blot SD célula de transferência semi-secaBio-Rad1703940Para transferência semi-seca
Leite em pó desnatado (leite em pó desnatado)Tecnologia de sinalização celular9999SPara bloqueio
de tampão Tween 20BioShopTWN510Para tampão de lavagem
GAPDH coelho anticorpo monoclonalEpitomics2251-1Anticorpo primário da proteína de controle (lote#: YE101901C)
Anticorpo anti-camundongo IgG de cabra (conjugado com HRP)abcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Anticorpo secundário para imunotransferência
Anticorpo IgG de cabra anti-coelho (conjugado com HRP)abcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Anticorpo secundário para immunoblot (lote#: GR3192725-5)
Clarity Western Substratos ECLBio-Rad1705060Para detecção de sinal de immunoblot
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Para detecção de sinal de immunoblot
SoftwareImageJ Freeware, NIH-Paraanálise de densitometria

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A.

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Quantitative ImmunoblottingImmunofluorescence AssayCell Line ValidationProtein Biomarker QuantificationFFPE Tissue AnalysisImage Analysis SoftwareWestern Blot ProtocolFluorescence Intensity MeasurementLinear Dynamic RangePearson Correlation Test

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