Summary
עבודה זו מתארת את שכפול של זן סוס טרויאני פחמון זקן התירס למסירה באתרו של חלבונים תירס מופרשים לתוך שלושה סוגים שונים של רקמות תירס.
Abstract
בהשראת המיתוס סוס טרויאני Homer´s, מתוכנן לנו את הפתוגן תירס פחמון זקן התירס כדי לספק חלבונים מופרשים לתוך אפופלסט תירס יאפשר ניתוח פנוטיפי ויוו. בשיטה זו אין להסתמך על טרנספורמציה תירס, אבל מנצלת גנטיקה של חיידקים ויכולות הפרשה של פתוגנים. במסמך זה, היא מאפשרת בדיקה של ויוו נמסר חלבונים מופרשים עם רזולוציה גבוהה ייתכן-סוגים שונים של אתרים זיהום ורקמות. האסטרטגיה סוס טרויאני יכול להיות מנוצל כדי להשלים transiently תירס פנוטיפים אובדן-של-פונקציה, לאפיין באופן פונקציונלי חלבון תחומים, כדי לנתח את המטרה חלבון אפקטים, או ללמוד כמויות חלבון onside יתר, מה שהופך אותו כלי רב עוצמה עבור מחקרים חלבון במערכת חיתוך תירס. עבודה זו מכיל פרוטוקול מדויק על איך ליצור זן סוס טרויאני ואחריו זיהום מתוקננת פרוטוקולים ליישם שיטה זו שלושה סוגי רקמות תירס שונים.
Introduction
המחלה biotrophic פחמון זקן התירס הוא סוכן סיבתי של המחלה הזימה תירס1. הוא מדביק כל החלקים אווירי של תירס וכתוצאה מכך גידולים גדולים שמכילים נבגים melanized, שחור. ברמה הגלובלית, זקן התירס בארצות הברית מעריכים כי לגרום אובדן שנתי של 2% תשואה תירס, בעוד גידולים מוערכים כמו למעדן גסטרונומי במקסיקו. צמח זיהום הוא שיזם appressorium מפריש אנזימים lysing דופן התא לחדור את השכבה הראשונה של תאים אפידרמיס תירס. מאתר זיהום ראשי, U. זקן התירס גדל intracellularly, intercellularly, פולשים תא אחד או שניים שכבות כל יום1,2. התוצאות זיהום מוצלחת בהיפרטרופיה צמח זה הופך גלוי גידולים על חמישה ימים פוסט זיהום-1,-3,-4. לאורך כל שלבי הזיהום, הפטריה invaginate קרום הציטופלסמה הצמח ללא מגע ישיר ל-1,הציטופלסמה מארח2. הרווח apoplasmic הדוקה בין hyphae המזהם את קרום פלזמה הצמח נחשב האתר המארח/פתוגן אינטראקטיבי, נקרא האזור האינטראקציה biotrophic. כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת צמח, זקן התירס בארצות הברית מפריש מערך של חלבונים אפקטור לתוך אזור האינטראקציה biotrophic1. כמה effectors נתפסות על ידי תאי צמחים, ואילו אחרים נשארים biotrophic אינטראקציה אזור5,6,7,8. אפקטור apoplastic אחד הוא UmPit2, אשר מקיים אינטראקציה עם apoplastic תירס פרוטאזות למניעת המהדורה של ה-פפטיד ZmZIP1 מ- ZmPROZIP על ידי apoplastic פרוטאז פעילות9,איתות10.
בעשורים האחרונים, זקן התירס בארצות הברית נעשו לא רק למודל גנטיקה פטרייתי באינטראקציה צמח-פתוגן, אלא גם כלי חשוב בתחום הביוטכנולוגיה עקב מחזור חיים מובנות, נגישות קלה גנטית והוא מופרש heterologous ביטוי חלבונים11,12,13. אותות עבור שניהם הפרשת חלבון קונבנציונאלי ובלתי קונבנציונאלי שנקבע המאפשר השליטה של שינויים posttranslational14. לאחרונה, זקן התירס בארצות הברית היה מועסק כלי סוס טרויאני ללמוד קטן, מופרש חלבונים תירס באתרו15. הגישה סוס טרויאני שימש בהצלחה כדי לנתח את תפקוד החלבון קטן, המופרש ZmMAC1 המעורב בפיתוח בצרכן. ZmMAC1 גורם חלוקת תאים pluripotent מפרט הגורל התא של תאי שהוקם15periclinal. באותה שיטה, תפקוד ביולוגי תירס נזק-הקשורים פפטיד ZmZIP1 נחשף. זקן התירס בארצות הברית מפריש את תירס ש-zmzip1, גרמו נפגעת היווצרות הגידול10. לפיכך, מייצג גישה סוס טרויאני מסלול חלופי בעל ערך חלבון במחקרים באתרו עם רזולוציה גבוהה ייתכן שעושה גם דורשים דור של קווים טרנספורמציה תירס יציב ולא חדירה לרקמות עם heterologously ביטוי וטיהר חלבונים. בפרט, האסטרטגיה סוס טרויאני מאפשר ההפרשה של כל חלבון heterologous לתוך אפופלסט תירס השוואה ישירה של נגועים לעומת צמח לבריא תאים בתוך הרקמה זהה.
פרוטוקול זה ממחיש את השלבים העיקריים ליצירת זן סוס טרויאני זקן התירס בארצות הברית ללמוד חלבון עניין. כוללת מידע מדויק על נוהלי זיהום של שלושה סוגים של רקמות תירס שונים (עלים בוגרים, גדילים, האוזניים) עם זקן התירס בארצות הברית, אשר הינה תנאי לימוד הפונקציה התקדמות, חלבון ייתכן זיהום ברקמות המטרה אלה. לא מפרטים נוספים הינם נתון על תירס גנטי הגברה מיקרוסקופיים הדמיה טכניקות, מאז השלבים במטרה הינם תלויי-כלי נגינה. לפיכך, פרוטוקול זה מיועד למשתמשים מנוסים של ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי טכניקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית סוס טרויאני זקן התירס U.
הערה: ראה איור 1.
- להגביר את הגן ריבית cDNA תירס באמצעות תחל גנים ספציפיים של פולימראז DNA ההגהה. לשכפל את מוצר ה-PCR ראשי ולשנות צורה הבונה של e. coli הספק פלסמיד ההוראות. ודא את הגן הנכון של עניין רצף מאת סנגר רצף לפני השימוש על שיבוט השלבים הבאים.
הערה: מפרט PCR צריך להיות מותאם בשל פריימר רצף specificities ואת תנאי ריאקציה אופטימליים DNA פולימראז. - עיצוב תחל כדי להגביר את הגן תירס עניין ללא רצף קידוד האות פפטיד (SP).
- להאריך בסוף 5´ הראשיים הפוך. עם מוטיב RSIATA, של המפקדיםאני חותכת האתר (טבלה 1).
- להגביר את הגן תירס עניין עם פולימראז DNA ההגהה באמצעות PCR הבונה המופקים 1.1 כתבנית PCR.
- זוגיות-תקציר המוצר PCR ואת פלסמיד טרנספורמציה זקן התירס בארצות הברית , p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, עם Xba, ואני המש אני לטהר את מוצר ה-PCR מתעכל ואת פלסמיד.
- מאתרים ומפסיקים את המוצר PCR מתעכל לתבנית p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha באמצעות T4 DNA ליגאז ההוראות manufacturer´s. להפוך את המוצר מצדו e. coli ולאמת את הגן הנכון של עניין רצף מאת סנגר רצף.
- Linearize את p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmגנים של עניין-mCherry-Ha עם האנזים הגבלת Sspאני והמרה DNA לתוך ארה ב solopathogenic זקן התירס זן SG20016. לבודד transformants זקן התירס בארצות הברית לפי בחירה carboxin ואשר transformants מבודדים על ידי הדרומי כתם ניתוח16.
הערה: כל החלבונים של עניין, עצמאית לפחות שלושה זקן התירס U. transformants צריך להיות מבודד וניתח להעריך כל תופעות פנוטיפ של מוטציות אקראי הרקע.
2. תרבות המדיה
- להכין YEPSlight נוזלי בינוני16: תמצית שמרים 1.0% (w/v), 0.4% (w/v) מה נשארתי-Peptone ו- 0.4% (w/v) סוכרוז. להמיס כל הרכיבים ב- ddH2O והחיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; autoclaving בטמפרטורה גבוהה, לתקופה ארוכה יותר של זמן או שוב ושוב יפחית את האיכות של המדיום.
- להכין תפוחי אדמה-dextrose-אגר (PD-אגר)20: אגר דקסטרוז 3.9% (w/v) תפוחי אדמה ו- 1.0% (w/v) M טריס-HCl 1 pH 8.0 (פ. צ. ז 0.01). לערבב את כל הרכיבים ישירות בתוך בקבוק autoclaving ולהוסיף ddH2O ובנוסף בר מערבבים מגנטי. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; autoclaving בטמפרטורה גבוהה, לתקופה ארוכה יותר של זמן או שוב ושוב יפחית את האיכות של המדיום.
- להכין PD-פחם אגר20: 3.9% (w/v) תפוחי אדמה דקסטרוז אגר, פחם 1% (w/v) ו- 1.0% (v/v) M טריס-HCl 1 pH 8.0 (פ. צ. ז 0.01). לערבב את כל הרכיבים ישירות בתוך בקבוק autoclaving ולהוסיף ddH2O ובנוסף בר מערבבים מגנטי. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; autoclaving בטמפרטורה גבוהה, לתקופה ארוכה יותר של זמן או שוב ושוב יפחית את האיכות של המדיום.
3. הצמח זיהום
- בצע ניתוח של חלוקת התא תירס בתגובה סוס טרויאני נמסר חלבון (למשל, תא מבוסס מיקרוסקופיה לספור) מראש. זקן התירס בארצות הברית -induced התפשטות תאים תירס ומתחילה היווצרות הגידול הבאים סביב 4-5 ימים שלאחר זיהום. מחלת כמותיים הערכות תלויי-רקמות, יש לבצע 6 לזיהום פוסט 14 ימים.
הערה: הזנים תירס ברורים מראים רמות שונות של רגישות לזיהום זקן התירס בארצות הברית . תירס cלעומת W23, A188, Gaspe פלינט, בנטם הזהב מוקדם או Va35 להראות רגישות לכיוון הפתוגן הזה, ולכן הם הזנים מתאימים ללימודי הסוס הטרויאני. - הכנת inoculum זקן התירס U.
- כוללות המתח קדמון SG200 פקד שלילי בניסויים כל סוס טרויאני כדי לאמוד את תופעות לוואי על הזיהום על ידי המתח מהונדס. . הנה, תשתמש זן U. זקן התירס לבטא גרסה שאינו מופרש החלבון עניין כפקד שלילי. עם זאת, מטעמים של practicability (למשל, הקרנות גדול יותר), המתח קדמון עשוי להיות בחירה קלה יותר של שליטה.
- לפני תחילת הניסוי, להעריך איזה כמויות של זיהום תרבות נדרשים. זכור כי זיהום של כל צמח דורש 1-1.5 מ"ל של ההשעיה זקן התירס U. תלוי בסוג הרקמה תירס.
הערה: כ- 1 מ של תרבות לילה מספיקה לדילול כדי OD600 0.2 ב 20 מ של YEPSאור בינוני, 25 מ של תרבות זקן התירס בארצות הברית עם יתר600 של 0.8-1.0 מספיקים. זיהום של הצמחים 13-16. - גירוד U. זקן התירס של אגר PD צלחת באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר, לחסן ב 5 מ של YEPSאור בינוני ותנו התרבות לצמוח ב 28 ° C עם טלטול מתמיד ב- rpm 200 עבור 16 h.
- לפני ההדבקה, לבחון את התרבות חיסון זקן התירס בארצות הברית על ידי מיקרוסקופ אור רגיל עבור צמיחה נכונה וזיהום חיידקי בהגדלה X 400.
הערה: בתרבות מתאימים, רק ופטריות בצורת סיגר הוא גלוי (איור 2). - לערבב µL 900 של טרי YEPSאור עם 100 µL של התרבות לילה, למדוד את יתר600 באמצעות YEPSאור בינוני ריקים בניתוח ספקטרופוטומטרים.
- לדלל את התרבות לילה עם בינונייםאור YEPS טריים יתר600 של 0.2 ולתת את התרבות לצמוח ב 28 ° C עם טלטול מתמיד ב 200 סל ד עד שהגיע שלב הצמיחה באמצע יומן שמציין OD600 nm של 0.8-1.0.
הערה: U. זקן התירס תאים כפול כל 2 h בתנאים אלה, ובכך מתמלאת ה OD הרצוי600 לאחר 4-5 שעות של טיפוח-תרגול. - לקצור את התאים על יתר600 של 0.8-1.0 מאת ספינינג ב x 3000 g 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
- שטיפת בגדר תא פעם אחת עם ddH2O. למטרה זו, תרבות אחת, נפח ddH2O, ספין עם 3000 x g 10 דקות להוסיף ולמחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא בקפידה ddH2O בעזרת פיפטה של 20-מ ל זכוכית, ובכך התאמת ה OD סופית600 ל 3.0 (עבור וזמינותו סוס טרויאני) או 1.0 (עבור דירוג המחלה).
- אימות של הסוס הטרויאני: ב הפיסקו הפרשת החלבון פיוז'ן תירס
- להדביק שתילי תירס עם זן סוס טרויאני17.
- לבצע הדמיה מיקרוסקופיים של שתילי נגועים ב- 2-3 ימים שלאחר זיהום באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. לשם כך, בלו חתיכה מלבנית של 1 ס מ מתחת לנקודה של הזרקת העלה, למקם את הדגימה לשקופית מיקרוסקופ, להוסיף טיפה של ddH2O. כדי להמחיש חלבון כימרי mCherry, לרגש הדגימה-λ = 561 nm ו הפקת הרשומה בλ = 580-630 ננומטר.
- זיהום של עלים תירס למבוגרים
- לטפח צמחי תירס לשלב של עלים בוגרים (כאשר לפחות העלה 7 גדל בתוך הקנה).
הערה: בשלב זה ניתן להגיע לאחר ארבעה שבועות בעת הזריעה בתנאים החממה של 14 h. h יום/10 28 ° C, 22 ° C בלילה קצב באמצעות cv. W23. משך הזמן עשוי להשתנות עם התנאים לדבורי ו החממה תירס. - העברת התרבות זקן התירס בארצות הברית (ראה 3.2.9) לתוך מזרק 3-mL עם מחט תת-עורית 20G x 1.
- לחץ על הקנה בקפידה כדי להתאים לשפה הרקמה meristem בתוך הקנה. הבסיס של meristem ניתן לזיהוי על-ידי מעבר גבעול קשה יותר לרקמות רך יותר.
- סמן את meristem על הקנה באמצעות עט.
- להזריק 1.5 מ ל U. זקן התירס תרבות 1 ס מ מעל meristem לירות או meristem תפרחת.
- שיעור תסמיני המחלה ב 6 ו 12 ימים שלאחר זיהום.
- לטפח צמחי תירס לשלב של עלים בוגרים (כאשר לפחות העלה 7 גדל בתוך הקנה).
- זיהום של גדילים
- לגדל צמחים תירס עד שהגיע השלב ציצית.
הערה: לוח זמנים מפורט לפיתוח בצרכן, ציצית תירס cv. W23 היה שתואר לעיל1819. הגדילים המכיל פורים מראש meiotic מאוד רגישים לזיהומים זקן התירס בארצות הברית ; cv. תירס W23 גדילים הם בגודל של 4-7 ס מ. - לחץ על הקנה בקפידה כדי להתאים לשפה של ציצית בגזע.
- סמן את הטיפ ובסיס ציצית על הגזע באמצעות עט.
- העברת התרבות זקן התירס בארצות הברית (ראה 3.2.9) לתוך מזרק 3-mL עם מחט תת-עורית 20G x 1.
- להזריק 1.5 מיליליטר inoculum מסביב ציצית. כדי להבטיח חלוקה שוויונית של inoculum, לאט במקום 0.5 מ ל כל אחד הטיפ, החלק האמצעי, ועל בסיס ציצית מסומן באמצעות העט.
- שיעור תסמיני המחלה ב 10 ימים שלאחר זיהום.
- לגדל צמחים תירס עד שהגיע השלב ציצית.
- דלקת אוזניים
הערה: התפתחות רקמת האוזן שונה ברורים תירס הזנים ותנאי החממה, יש להקפיד בקפידה לפני חיסון. האוזניים החל מתגברים על בדי משי הם רגישים מאוד לזיהומים זקן התירס בארצות הברית .- העברת התרבות זקן התירס בארצות הברית (ראה 3.2.9) לתוך מזרק 3 מ עם מחט תת-עורית 20 G x 1.
- להחדיר את המחט חיסון לתוך הרווח בין העלים קליפה עמוק ככל האפשר מבלי לפצוע את האוזן.
- שחרור 1.5 מיליליטר inoculum סביב האוזן.
- הסר את המזרק בתוספת המחט ועיסוי בקפידה קלח להפיץ את הפתרון זקן התירס בארצות הברית באותה מידה.
- שיעור תסמיני המחלה ב 14 ימים שלאחר זיהום.
- לאשר את הכדאיות של זקן התירס בארצות הברית inoculum
- ירידה µL 10 של inoculum על צלחת אגר פחם PD, דגירה בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
הערה: אם בהתאמה זקן התירס U. תרבות היא היכולת טופס חוטים, תפטיר רך, לבן הופך גלוי (איור 5)
- ירידה µL 10 של inoculum על צלחת אגר פחם PD, דגירה בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בונה לניסויים סוס טרויאני זקן התירס בארצות הברית הם משובטים לתוך פלסמיד p123-PUmpit2-SpUmpit2-גנים של עניין-mCherry-Ha. הגן תירס עניין מותך כתב זריחה mCherry , של epitope HA-תג. הביטוי של החלבון היתוך הוא תחת שליטה של האמרגןpit2 זקן התירס בארצות הברית Um אשר מופעל באופן ספציפי במהלך זיהום21. כדי הפרשת ישירה של החלבון של עניין פפטיד לאזור האינטראקציה biotrophic, האזור קידוד מותך רצף פפטיד האות U. זקן התירס Umpit221 (איור 1). אחרי הטרנספורמציה זקן התירס בארצות הברית , transgene מוכנס לתוך SG200 ip-לוקוס ע י רקומבינציה הומולוגית, החדרת גנום יישוב ניתנת לאימות כמקורית על-ידי ניתוח תספיג דנ א. הפרשת החלבון פיוז'ן אושר על ידי סריקת לייזר קונפוקלי מיקרוסקופיים הדמיה ב שתיל עלים נגועים עם זן סוס טרויאני (איור 3). לדוגמה, שתילים נגוע או זקן התירס U. סוס טרויאני המתח SG200Zmmac1 מפריש ZmMAC1-mCHERRY או פקד סוס טרויאני זן לביטוי noSP-Zmmac1-mCHERRY חסר Umpit2- SP, ובעקבות זה לא הסוד ZmMAC1-mCHERRY-HA חלבון, מוצגים באיור 315. Hyphae הפרשת ZmMAC1 מוקפים mCherry ניאון האות (איור 3 א). לעומת זאת, hyphae שאינו מפריש תציג רק אות פלורסצנטיות בציטופלסמה פטרייתיים (איור 3B).
בפרט, ציצית זיהום עם זקן התירס ארה ב מסתמכת על חיסון הרקמה הנכונה, כפי שמתואר בשלב 3.5. לוקליזציה ציצית פסולים או חלוקה לא שווה של inoculum יכול לגרום לבריא ציצית (איור 4A) או רק חלקית לזיהום ציצית (איור 4B). כדי להבטיח הפצה אפילו, inoculum צריך לאט לאט אנו משחררים את המחט חיסון לרכוש זיהום רקמות כולו (איור 4C). אפשרות לאמת את הכדאיות של inoculum ידי הצבת droplet על אגר PD-פחם. זנים זיהומיות בצורת חוטים המופיעים כותב מוך בצלחת כפי שמוצג עבור solopathogenic הסוס הטרויאני קדמון זן SG200 (איור 5A) תוך המתח זקן התירס U. FB1 דורש ההזדווגות לפני היווצרות פילמנט זיהומיות ( איור 5B).
| שם | תוספת פריימר | רצף (5´→3´) |
| קדימה | XbaI-תירס גנטי | GCTCTAGA... |
| הפוך | NcoI-RSIATA-תירס גנטי | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG... |
טבלה 1: רצפים של פריימר תוספות להוסיף הגבלת הצדדים ואת המוטיב RSIATA קידוד רצף הגן תירס עניין.
איור 1 : סקירה סכמטי של זקן התירס U. סוס טרויאני פלסמיד שיבוט אסטרטגיה. Zmmac1 (אפור בהיר) הוא שוחרר על ידי digest כפול מ-Ump123-Ppit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha. במקביל, הגן עניין (צהוב) מוגבר על-ידי ה-PCR. לקראת שיבוט מטרה, תחל ואחורה מעוצבים הכוללים Xba, ואני המשאני שיבוט אתרים, מקשר (linker) RSIATA (סגול). המוצר PCR מתעכלת עם Xba, ואני המשאני. לאחר מצדו, פלסמיד סוס טרויאני מכילה את הרכיבים הבאים: מונע על ידי מקדםpit2 Um, Umpit2-SP (כחול) היא דבוקה N-סופני גן תירס עניין ORF (צהוב). את קצה קרבוקסילי, מקשר RSIATA, גן כתב mCHERRY (אדום) ו הא epitope תג (ירוק) הם התמזגו ואחריו stop codon. לפני השינוי זקן התירס בארצות הברית , פלסמיד סוס טרויאני מתעכלת עם Ssp. אני כדי לאפשר הומולוגי השתלבותם U. maydisip-לוקוס (אפור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אור-מיקרוסקופי של זקן התירס בארצות הברית חיסון תרבות. כמה סיגרים בצורת U. זקן התירס sporidia גלויים, שחלקם עוברים ניצני (מסומן על ידי כוכביות). אין תאים נוספים נמצאים מה שיצביע על הכישלון של התרבות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ב הפיסקו סריקת הדמיה מיקרוסקופיים של לייזר קונפוקלי פחמון סוס טרויאני זן. הדמיה של החלבון תירס התמזגו mCherry ZmMAC1 לאחר ההדבקה שתיל תירס באמצעות סוס טרויאני המתח SG200Zmmac1 (A) או זן סוס טרויאניmac1SG200Zm - חסר Umpit2-SP (B) noSP. המופרש ZmMAC1-mCHERRY-HA חלבון כימרי ממוקם על פני זקן התירס U. hyphae (א)15, המצוין על-ידי ראשי חץ. SG200Zmmac1- noSP רק cytoplasmic לוקליזציה של ZmMAC1 הוא גלוי (B), המצוין על-ידי ה-asterisk 15. גודל ברים = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ציצית זיהום עם זקן התירס U.. זיהום לא מוצלח של ציצית עם זקן התירס בארצות הברית (A), זיהום ציצית חלקית (B), ציצית מלא זיהום (C) 12 ימים לאחר ההדבקה מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Inoculum assay הכדאיות על אגר, פחם PD- המתח solopathogenic SG2001 שימש לדור סוס טרויאני. SG200 גרייה-עצמית, יוצר חוטים זיהומיות על צלחת אגר PD-פחם (A). הפלואידי U. זקן התירס זן FB1 דורש הזדווגות עם זן תואם לפני צמיחה filamentous (B)22. גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיתוך מודרני מחקר דורשת פרוטוקולים עבור ניתוח מולקולרית על גנטי ורמות החלבון. נגישות גנטי באמצעות טרנספורמציה אינה זמינה או לא יעיל ולגזול עבור רוב היבול מינים כגון תירס. יתר על כן, כלי אמין גנטיות כגון מערכות כתב יזם הם נדירים, מה שהופך את זה קשה ללמוד באתרו וחלבון לתפקד עם רזולוציה גבוהה ייתכן באתרים רקמות שונות. Apoplastic חלבונים יכולים להילמד על-ידי הסתננות של חלבונים heterologously ביטוי וטיהר לתוך הרקמות. עם זאת, למרות ההתקדמות בביטוי חלבונים heterologous, יישוב חדירה לרקמות חיתוך נשאר קשה ולא לעתים קרובות יעיל עבור אנליזה פונקציונלית חלבון. האסטרטגיה סוס טרויאני היא גישה חלופית שאינה דורשת שינוי או חדירת חלבונים. על-ידי הפעלת מנגנון הפרשת לנגיף תירס זקן התירס בארצות הברית, מסירת תיאורטית כל חלבון עניין לתוך אפופלסט הצמח רקמת נגוע יכולה להיות מושגת. בנוגע לגודל של חלבון של עניין, הגבולות של טכניקה זו טרם להבטיח את הזמנתכם. מבחני לשעבר, היה אפקטור U. זקן התירס חומצות אמינו 290 ש-cmu1 דבוקה mCherry בהצלחה על ידי7. עם זאת, תחולתה של השיטה סוס טרויאני חלבונים גדולים נשאר להיבדק. אם תוספות של שינויים posttranslational החלבון עניין בלתי רצויות, הפרשת קונבנציונאלי עשוי לשמש דרך חלופית הפרשת קלאסית באמצעות SP14.
זקן התירס בארצות הברית הוא מועסק בתור כלי סטנדרטי בביוטכנולוגיה חלבון בשל קיפול חלבונים אמין, שינוי posttranslational, הפרשת היעילות11,12,13. למרות זאת, הפרשת חלבון עבור כל זן סוס טרויאני חדש צריך להיות מנותח בקפידה כפי שמתואר בשלב 3. מומלץ לבצע על בדיקה ראשונית של כל זן סוס טרויאני החדש שנוצר ע י הדבקה שתילים קלים כדי להדביק וכדי לבדוק על ידי הדמיה מיקרוסקופיים.
SG200 הוא זן solopathogenic אשר לא דורשת ההזדווגות לפני הניסויים סוס טרויאני, ולכן הוא הרבה יותר קל לטפל. למרות היעילות זיהום של זנים תואם כמו FB1 ו- FB2 הוא גבוה יותר23, היעילות של SG200 מספיקה לניסויים סוס טרויאני. כמה חלבונים אפקטור U. זקן התירס נתפסות על ידי התאים המארחים, ואילו אחרים נשארים ב אפופלסט. הבידול בין שתי הקבוצות נראה תהליך מבוקר ספציפי; עם זאת, המנגנון הבסיסי נשארים חמקמקים8 , לא יכול להילקח בחשבון בעת תכנון ניסוי. לכן, חלבונים עניין זה חייב להיות משולב לתוך קיר התא או שיש לפעול intracellularly הן אין מועמדים מתאימים עבור הגישה סוס טרויאני.
מאז U. זקן התירס הוא כל יכול, מדביק ברקמות שונות תירס אוויר, השיטה סוס טרויאני יכול להיות מיושם עבור חלבונים מרובים, ברקמות שונות, בשלבים התפתחותיים צמחים שונים, כגון שתיל עלים, עלים בוגרים, גדילים, ו האוזניים. כדי שם רק כמה יישומים שימושיים, הסוס הטרויאני מאפשר בדיקת כמויות יתר מקומית, חלבון נבדל אפקטים או אפיון פונקציונלי של תחומים ברורים חלבון.
שמירה על מזוהמת U. זקן התירס תרבות חיוני עבור כל הניסויים המתוארים כיוון ושיתוף הידבקות עם כמות גדולה של חיידקים מעורר תגובה חיסונית של הצמח ומשנה שלה התגובה כלפי החלבון של עניין, ובכך טיוח בכל תוצאות חד משמעיות. משאיר סוס טרויאני לימודי למבוגרים, הגדילים והאוזניים חייב להתבצע עם מקסימאלי 1.5 mL זיהום תרבות כמו אחסון גבוה עלול לגרום נזק לרקמות. אפשר לאמן ציצית דלקות האוזן באמצעות מזון שהוכתמו צבע מים במקום פחמון inoculum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות דרסלהאוס תומאס, מרטין Parniske, אופיר לא משנה Djella וארמין הילדברנד למתן שטח מעבדה וחומר צמח. היצירה המקורית על שיטת סוס טרויאני נתמכה על-ידי מלגת פוסט דוקטורט Leopoldina אכ מ פרויקט IOS13-39229. העבודה שהוצגו במאמר זה נתמך על ידי SFB924 (פרויקטים A14 ו B14) של DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
