Summary
Presenteren we een methode voor het analyseren van de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor Alfa ligand-bindend domein dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride assay.
Abstract
Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. De volgorde van ERα eiwit wordt zeer behouden tussen de soorten. Het heeft gedacht dat de functie van de mens en de muis ERαs identiek is. We tonen het effect van de differentiële 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) op de muis en de menselijke ERα ligand-bindend domein (LBD) dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride (M2H) bepaling. De assay M2H kan aantonen dat de efficiëntie van LBD homodimerization activiteit in zoogdiercellen, gebruik makend van de transfectie van twee eiwit expressie plasmiden (GAL4 DNA-bindende domein [DBD] fusie LBD en VP16 transactivation domein [VP16AD]-fusie LBD) en een GAL4-responsief element (GAL4RE) gesmolten luciferase verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion LBD en de VP16AD-fusion LBD een dimeer in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en vervolgens activeert een luciferase genexpressie via de VP16AD afhankelijk transcriptie activiteit. De 4OHT-gemedieerde luciferase activering is hoger in de HepG2 cellen die waren met de muis ERα LBD fusion eiwit expressie plasmiden dan in de menselijke ERα LBD fusion eiwit expressie plasmide transfected cellen transfected. Dit resultaat wijst erop dat de werkzaamheid van de 4OHT-afhankelijke muis ERα LBD homodimerization activiteit hoger dan menselijke ERα LBD. In het algemeen, is het gebruik van de M2H-test niet ideaal voor de evaluatie van nucleaire receptor LBD dimerisatie activiteit, omdat agonistic liganden het basale niveau van de activiteit LBD verbeteren en dat de detectie van LBD dimerisatie activiteit belemmert. We vonden dat 4OHT doet niet verhogen, ERα LBD basale activiteiten. Dat is een belangrijke factor om te kunnen bepalen en op te sporen van de 4OHT-afhankelijke LBD dimerisatie activiteit voor het met succes gebruik van de M2H-bepaling. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (bijvoorbeeld, 4OHT) in verschillende zoogdieren celtypes.
Introduction
Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. Het aminozuur sequenceof ERα is zeer bewaard tussen de soorten. Vanwege de hogere homologie tussen mens en muis ERα, de functie van deze receptoren als identiek is gedacht en de differentiële activiteit van oestrogene stoffen (b.v., tamoxifen) in deze soorten wordt veroorzaakt door de soort verschillen in chemische stofwisseling in plaats van de structurele verschillen van ERα. ERα heeft zeer domeinstructuren die onder de superfamilie van nucleaire receptor (NR gelden), aangewezen van A tot F domeinen behouden. Het E-domein of de ligand-bindend domein (LBD) omvat de ligand-bindende zak en de transcriptionele activering functie 2, AF-2 genoemd. Het domein van F is gelokaliseerd onmiddellijk grenzend aan het domein van E en is het meest variabele domein onder de NRs. Zelfs tussen mens en mouse van ERα, de homologie van het domein van F is aanzienlijk lager dan die van de andere domeinen1. De ligand-gebonden LBD van ERα verbetert de homodimerization van de ERα eiwitten binden van het specifieke element voor het oestrogeen-responsief DNA rechtstreeks voor het reguleren van de ligand-afhankelijke gene transcriptie (klassieke actie van ERα). Kristallografische studies is gebleken de differentiële positionering van helix 12 (AF-2 core domein) met estradiol (E2)- of 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - gebonden LBD Dimeren2,3. Het domein van de ERα F (45 aminozuren) helix 12 direct verbinden. Er is echter geen informatie over de gevolgen van deze uitbreiding van 45 aminozuren (F domein) uit de helix 12 over de dimerisatie ERα LBD. In deze studie tonen we de bijdrage van het F-domein naar de soortspecifieke 4OHT-afhankelijke ERα LBD homodimerization met behulp van een zoogdieren twee-hybride (M2H) test.
De assay M2H is een methode om aan te tonen van eiwit-eiwitinteractie in zoogdiercellen invoering van de drie verschillende plasmide Ani: twee eiwit expressie plasmiden, die GAL4 DNA-bindende domein (DBD) fusion ERα LBD en VP16AD fusion ERα LBD uitdrukken, en een GAL4RE-gesmolten luciferase expressie verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion ERα LBD en de fusie van de VP16AD ERα LBD interactie (Maak een dimeer) in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en, vervolgens, activeert luciferase genexpressie via de VP16AD-afhankelijke transactivation functie. Het niveau van LBD homodimerization kan worden geëvalueerd door de luciferase activiteit.
De bepaling van gist twee-hybride (Y2H) is een alternatieve methode gebaseerd op hetzelfde principe dat gist als de hostomgeving gebruikt. Eerdere rapporten met behulp van het Y2H-systeem aangetoond dat F-domein-afgekapt menselijke ERα LBD E2-afhankelijke coactivator werving verhoogt, sluiting van dat het domein van F E2-gemedieerde transcriptie4voorkomt. Dit resultaat is inconsistent met andere verslagen die hebben aangetoond de verzwakte transcriptionele activiteit van menselijke ERα in de cellen van zoogdieren5,6F-domein-afgekapt. Onlangs, onze studie, via het systeem M2H aangetoond dat de E2-afhankelijke coactivator recruitment activiteiten van menselijke ERα LBD is daalde met F domein truncatie in zoogdiercellen en met de transcriptie activiteit1 strookt. Deze opmerkingen suggereren dat de fysiologische rol van eiwit-eiwit interactie in een cel type-specifieke wijze en context verschilt. De assay M2H kan aantonen eiwit-eiwit interactie activiteit in dezelfde cellulaire context die wordt gebruikt voor het bepalen van de transcriptionele activiteit. Dit biedt een voordeel van de bepaling van de M2H in vergelijking met de Y2H of andere in vitro eiwit-eiwit interactie analyses.
Er blijven vragen over de moleculaire mechanismen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (SERMs) (bijvoorbeeld, 4OHT) voor het regelen van ERα-gemedieerde transcriptie. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van het mechanisme van de gedeeltelijke agonist activiteit van SERMs in verschillende zoogdieren celtypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van plasmiden, de zoogdieren twee-hybride Assay
- Gebruik de volgende plasmiden: pG5-Luc, pBIND-ERαEF en pACT-ERαEF.
Opmerking: De plasmiden zijn beschikbaar vanaf de auteurs op verzoek en worden verzonden op filterpapier. pG5-Luc is de verslaggever plasmide dat bevat vijf herhalingen van GAL4 responsieve elementen gefuseerd met de luciferase expressie eenheid(Figuur 1). pBIND-ERαEF is het eiwit expressie plasmide voor GAL4DBD-gesmolten ERα LBD eiwitten. pBIND-ERαEF bevat een Renilla luciferase expressie eenheid voor het normaliseren van de transfectie efficiëntie (Figuur 1B). pACT-ERαEF is het eiwit expressie plasmide voor de VP16AD-gesmolten ERα LBD eiwitten (Figuur 1C). Het diagram van de geuite eiwitstructuur van de plasmiden is afgebeeld in Figuur 2. - Bereiden de ANI van de plasmide.
- Knip uit het plasmide-geladen gebied van het papier dat gebruikt schone schaar en zet het in een 1,5 mL-buis. Draag handschoenen en gebruik van schone pincet te halen van de plasmide-geladen papier. Voeg 100 µL van Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8.0) en vortex ook.
- Voeg 1 µL van de plasmide DNA oplossing uit stap 1.2.1 aan bevoegde Escherichia coli cellen (Zie Tabel van materialen) en houd de buis op ijs gedurende 15 minuten.
- Warmte-schok het plasmide toegevoegd bevoegde cellen; Incubeer de sproeibuis(-buizen) in 42 ° C waterbad voor 30 s en, vervolgens, houd ze op het ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg 250 µL van super optimale bouillon met omzettingsproducten onderdrukking (SOC) medium (kamertemperatuur) aan de sproeibuis(-buizen) en cultuur met schudden bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Plaat 100 µL van de gekweekte E. coli op een prewarmed Luria Bouillon (LB) bord met 100 µg/mL ampicilline (10 cm-diameter schotel) en cultuur bij 37 ° C's nachts.
- Kies een kolonie van de plaat en het in een tube van de 14 mL met 2 mL geweldig Bouillon (TB) met 100 µg/mL ampicilline toevoegen. Cultuur met schudden bij 37 ° C, totdat het medium is flauw vertroebeld.
- Voeg 1 mL van de gekweekte medium uit stap 1.2.6 aan een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL glas maatkolf met 50 mL TB met 100 µg/mL ampicilline. Cultuur met schudden bij 37 ° C gedurende 20-24 uur.
- De gekweekte E. coli overbrengen in een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 3450 x g bij kamertemperatuur gedurende 30 min met de swing-emmer rotor. Gooi het medium. Opslaan van de pellet E. coli bij-80 ° C.
- Voeg 3 mL cell resuspensie oplossing (Zie Tabel van materialen) aan de E. coli pellet en het volledig op te schorten. Voeg 3 mL van oplossing lysis van de cel (Zie Tabel of Materials), mix de tube zachtjes door het omkeren van het 10 x, en bewaar deze op het ijs gedurende 5 minuten (Houd de tijd stipt). Voeg 6 mL neutralisatie oplossing (Zie Tabel of Materials), mengen van de tube gestaag met te tikken, en dan houd het op het ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de buis bij 3450 x g bij 4 ˚C gedurende 30 min. met behulp van de swing-emmer rotor. Breng de oplossing DNA bevatten over een nieuwe conische tube van 50 mL en voeg toe 10 mL DNA zuivering hars (Zie Tabel van materialen). De hars zachtjes opschorten.
- Centrifugeer de buis bij 625 x g gedurende 1 minuut met de swing-emmer rotor. Negeren van de oplossing en houden de hars onderaan.
- Voeg toe 15 mL kolom wassen oplossing (80 mM Kaliumacetaat, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA, en 55% ethanol) naar de conische 50 mL tube en schud zachtjes op te schorten de hars. Herhaal stap 1.2.11.
Opmerking: De kolom wassen oplossing moet worden bereid met behulp van diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water of nuclease-gratis water. - Voeg 5 mL van kolom wassen oplossing aan de conische buis van 50 mL en de hars met een 5 mL-pipet opschorten. De hars van toepassing op de kolom (Zie Tabel van materialen) die is ingesteld op het vacuüm variëteit. Vacuüm de kolom totdat de hars drogen. Voeg 6 mL kolom wassen oplossing aan de kolom en vacuüm.
- Zodra de hars visueel droogt, los het reservoir uit de kolom. Het onderste gedeelte van de kolom (hars) overbrengen in een 1,5 mL-buis. Centrifugeer de kolom op maximale snelheid gedurende 2 minuten met behulp van een microcentrifuge de hars volledig drogen.
- Het onderste gedeelte van de kolom (hars) overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis. 300 µL van nuclease-vrij water aan de kolom toevoegen en wacht tot de hele hars doorweekt is.
- Centrifugeer de kolom bij maximumsnelheid voor 1 min voor het verzamelen van de plasmide DNA-bevattende oplossing (200-250 µL).
- De DNA-bevattende oplossing met fenol-chloroform (1:1), dan met chloroform als volgt behandelen.
- Toevoegen van hetzelfde volume van fenol-chloroform (1:1) aan de oplossing van DNA-bevattende (200-250 µL), goed schudden en centrifugeren bij maximale snelheid gedurende 2 minuten met behulp van een microcentrifuge. Verzamelen van de bovenste laag (DNA-bevattende oplossing) en toevoegen aan een nieuwe 1,5 mL-buis. Herhaal deze stap 1 x.
- Dezelfde hoeveelheid chloroform toevoegen aan de oplossing van DNA-bevattende (200-250 µL), goed schudden en centrifuge op maximale snelheid voor 1 min. verzamelen van de bovenste laag (DNA-bevattende oplossing) en toe te voegen aan een 1,5 mL-buis.
Opmerking: Endotoxinen (lipopolysaccharide) induceert cellulaire signalering in sommige cellen. Om te voorkomen dat een dergelijk onvoorspelbare effect, wordt stap 1.2.17 aanbevolen, die endotoxine verontreiniging kan verminderen.
- Neerslag het plasmide DNA met behulp van de techniek van de neerslag ethanol als volgt.
- Toevoegen van 1/9 van DNA volume van het mengsel van 3 M Natriumacetaat (pH 5.5) en 20 x van 3M natrium acetaat volume van 100% ethanol tot de DNA-bevattende oplossing. Bijvoorbeeld 27.8 µL van 3 M natriumacetaat en 278 µL van 100% ethanol toevoegen aan 250 µL van de DNA-oplossing (het eindvolume is 555.8 µL).
- Bewaar deze oplossing in ieder geval bij-80 ° C gedurende 20 min. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 20 minuten op 4 ˚C. Negeren van de oplossing en houden de pellet. Voeg 200 µL van 75% ethanol en spoel de binnenkant van de buis. Centrifugeer gedurende 20 min bij 4 ° C, negeren van de oplossing, en houden de pellet. Droog de DNA-pellet met behulp van een vacuüm concentrator.
- Voeg 100-250 µL van TE buffer (pH 8.0) aan de buis. Los van de DNA-pellet en controleren van de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nm. Houd de DNA-concentratie rond 0,5 mg/mL.
2. zoogdieren twee-hybride Assay
- Het handhaven van de cellen.
- Cultuur van menselijke hepatocellulaire carcinoom HepG2 cellen in een 750 mL, 175 cm2 weefselkweek kolf, met de minimale fenol rood-vrije essentiële media (MEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS; warmte-geïnactiveerd), 2 mM L-glutamine, en 1% penicilline-streptomycine oplossing (antibiotica) voor het behoud van de cellen.
- Cultuur van de cellen in een 5% CO2-aangevuld, 37 ° C incubator totdat de cellen ongeveer 90% heuvels zijn.
Opmerking: Verklein oestrogene achtergrond activiteit en fenol red-gratis medium moet worden gebruikt voor alle M2H experimenten. Deze stap moet worden uitgevoerd binnen een schone bankje/biologische veiligheidskast. De cellen dienen te worden gehandhaafd na de algemene zoogdieren cel cultuur protocol7.
- De cellen voorbereiden transfectie.
Opmerking: De volgende procedurele stappen moeten worden uitgevoerd binnen de schone bankje/biologische veiligheidskast. De cellen worden gekweekt/geïncubeerd in een 5% CO2-aangevuld, 37 ° C incubator in deze stap elke keer.- Replate van de 90% confluente cellen aan de 24-Wells-platen; Spoel de cellen 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- 7 mL trypsine-EDTA-oplossing 0,05% toevoegen aan de kolf cultuur en geniet van de cellen gedurende 1-2 minuten terwijl de kolf cultuur in een schone bankje bij kamertemperatuur. Verwijderen van een deel van de trypsine-EDTA-oplossing en laat 1-2 mL van de oplossing in de kolf van cultuur. Incubeer de kolf van de cultuur in de incubator voor 1-2 min.
- Klap de onderkant van de kolf loskoppelen van de cellen en controleer de cellen onder de Microscoop.
Opmerking: Als de cellen worden nog steeds gekoppeld aan de kolf, Incubeer gedurende een ander 1-2 min en herhaal vervolgens stap 2.2.3. - Opschorten van de cellen in de fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10% houtskool-ontdaan FBS (warmte-geïnactiveerd), 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine-oplossing.
Opmerking: Houtskool-ontdaan FBS moeten worden gebruikt ter vermindering van het effect van endogene oestrogeen serum-afgeleide. - Het aantal cellen tellen en zaad van cellen in een 24-well plaat duikt met een dichtheid van 1.2 x 105 cellen/well. Toewijzen van drie putten voor elk gegevenspunt (drievoudige).
- De cellen 's nachts cultuur. 2.4.1 stap blijven.
- Bereiden een mengsel van DNA voor Transfectie.
Opmerking: De volgende plasmide Ani zijn transfected in één goed: 100 van pG5-Luc verslaggever plasmide, 50 ng ng van expressie plasmiden voor GAL4DBD fusion eiwitten (pBIND), en 50 ng van expressie plasmiden voor VP16AD fusion eiwitten (pACT).- Voorbereiden om te analyseren de ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit, de volgende combinaties (Figuur 3). Combinatie (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT, en pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT. Combinatie (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF pACT-hERαEF, en pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF. Combinatie (iii): pG5-Luc + pBIND + pACT-hERαEF, en pG5-Luc + pBIND + pACT-mERαEF.
Opmerking: Combinatie (i) vertegenwoordigt het basale experimentele niveau van menselijke ERα LBD en muis ERα LBD, respectievelijk. Als het resultaat een opvallend hoog niveau met ligand alleen toont, is deze methode niet haalbaar voor gebruik met deze ligand (bijvoorbeelddiethylstilbestrol [DES]). Combinatie (ii) vertegenwoordigt de niveaus van dimerized menselijke ERα LBD en dimerized muis ERα LBD, respectievelijk. Combinatie (iii) vertegenwoordigt de negatieve controles; Gebruik deze set alleen wanneer het experiment wordt uitgevoerd voor de eerste keer naar het achtergrondniveau van de van het systeem te evalueren. - Voor het mengen, het totaal berekenen DNA die nodig is op basis van het aantal putten voor Transfectie. Voor experimenten in triplicates en vijf gegevenspunten, meng de volgende plasmide ANI in twee 1,5 µL buizen voor combinaties (i) en (ii): pG5-Luc, 5 (gegevenspunten) x 3 (wells) x 100 ng = 1.500 ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (gegevenspunten) x 3 (wells) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL); pACT (combinatie i) of pACT-mERαEF (voor combinatie ii), 5 (gegevenspunten) x 3 (wells) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL).
Opmerking: De concentratie van elke plasmide DNA oplossing is 0,1 µg/µL. - Het mengsel van de DNA met behulp van de techniek van ethanol neerslag neerslaan. Toevoegen van 1/9 van DNA volume van het mengsel van 3 M Natriumacetaat (pH 5.5) en 20 x van 3M natrium acetaat volume van 100% ethanol aan het DNA-mengsel. Vervolgens de buis vortex.
Opmerking: bijvoorbeeld, voeg 3.4 µL van 3 M Natriumacetaat, en 34 µL van 100% ethanol tot de 30 µL van plasmide DNA mengsel wordt geïllustreerd in stap 2.3.2. Deze stap helpt te houden een onveranderlijk transfectie voorwaarde, en het is niet nodig voor het uitvoeren van deze stap in een biologische veiligheidskast. - Houd het mengsel 's nachts bij-20 ° C. Centrifugeer het bij maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Gooi de oplossing (de pellet is onzichtbaar). 120 µL van 75% ethanol toevoegen aan de buis; vervolgens spoel de binnenkant van de buis. Centrifugeer gedurende 20 min bij 4 ° C. Negeren van de oplossing en het DNA mengsel met behulp van een vacuüm concentrator gedurende 30 minuten drogen.
- Voorbereiden om te analyseren de ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit, de volgende combinaties (Figuur 3). Combinatie (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT, en pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT. Combinatie (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF pACT-hERαEF, en pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF. Combinatie (iii): pG5-Luc + pBIND + pACT-hERαEF, en pG5-Luc + pBIND + pACT-mERαEF.
- De transfectie uitvoeren
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een schone bankje of een biologische veiligheidskast.- De volgende ochtend, spoel de cellen zaadjes in een 24-well plaat (uit stap 2.2.6) 2 x met 0,5 mL PBS (kamertemperatuur).
- Voeg warm (37 ° C) verse fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10% houtskool-ontdaan FBS (warmte-geïnactiveerd) en 2 mM L-glutamine zonder antibiotica aan elk putje (0,5 mL medium per putje). Houden van de cellen in een 5% CO2-aangevuld, 37 ° C incubator.
- Het mengsel van gedroogde plasmide DNA (uit stap 2.3.4) opschorten in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) (geen serum, fenol rood-vrij, zonder glutamine; 13 µL per putje). Berekening van de bedragen van de DMEM van het aantal putten voor Transfectie.
Opmerking: 15 putten voor combinatie (i) x 13 µL = 195 µL en 15 wells voor combinatie (ii) x 13 µL = 195 µL. - Opschorten van de transfectiereagens (Zie Tabel of Materials; 1.5 µL per putje) in DMEM (12,5 µL per putje) in een ander 1,5 mL-buis. Berekening van de bedragen van transfectiereagens en DMEM van het aantal putten voor Transfectie.
Opmerking: 30 [15 putten voor combinatie] (i) en 15 wells voor combinatie (ii) x 1,5 µL van transfectiereagens + 30 x 12,5 µL van DMEM = 420 µL. - Voeg een gelijke hoeveelheid van het medium van de transfectie-reagens (uit stap 2.4.4) aan elke buis (uit stap 2.4.3). Incubeer de buizen voor 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: 200 µL van transfectie reagens medium + 195 µL van combinatie (i) DNA mengsel = 395 µL, en 200 µL van transfectie reagens medium + 195 µL van combinatie (ii) DNA mengsel = 395 µL. Het is belangrijk een gelijk volume van transfectie reagens medium toevoegen aan de buizen van de combinatie (i) en (ii). Het is niet nodig om het gebruik van het medium in deze stap. - Voeg de gecombineerde mengsel (uit stap 2.4.5) aan elk putje (25 µL per putje) van de 24-well plaat (uit stap 2.4.2) en Incubeer de cellen gedurende 6 uur in de 5% CO2-aangevuld, 37 ° C incubator.
- Verwijder het medium van de transfectie van de 24-well-plaat. Voeg warm (37 ° C) verse fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10% houtskool-ontdaan FBS (warmte-geïnactiveerd), 2 mM L-glutamine, penicilline-streptomycine 1%-oplossing en ligand (onderbroken in ethanol) (0,5 mL medium per putje). Cultuur van de cellen voor 16-18 h in de 5% CO2-aangevuld, 37 ° C incubator.
- Oogst de monsters.
- Spoel de cellen met 1 mL PBS en, vervolgens, voeg 100 µL 1 x passieve lysis-buffermengsel (Zie Tabel van materialen).
- Krachtig schudden de 24-Wells-platen met een vortex-mixer loskoppelen van de cellen.
- Bevriezen van de platen (cel lysates) 1 x door vloeibare stikstof of opslaan bij-80 ° C voor analyse. Onmiddellijk vóór de assay, schud krachtig de platen op een shaker totdat zij bij kamertemperatuur zijn.
Opmerking: Dit proces voorkomt onregelmatig verschijnen abnormale waarden van luciferase activiteit.
- Het uitvoeren van een dual-luciferase assay.
- De reagentia voorbereiden op het dual-luciferase assay-systeem (Zie Tabel van materialen).
- Voor het maken van de buffer luciferase assay substraat (LAS), voeg alle luciferase assay buffer in het luciferase assay substraat dat in een bruine glazen fles. Opslaan van de LAS buffer bij-20 ° C.
Opmerking: De LAS buffer moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur vóór gebruik. - Voor het maken van de Renilla luciferase substraat (RLS) buffer, meng Renilla luciferase substraat en Renilla luciferase buffer in een verhouding van 1:50. Maak frisse RLS buffer voor elke assay en een zwarte buis of een buis beschaduwd door zilverpapier gebruiken. Berekent het bedrag van de RLS buffer waardoor een verse buffer.
Opmerking: De RLS buffer moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Voor het maken van de buffer luciferase assay substraat (LAS), voeg alle luciferase assay buffer in het luciferase assay substraat dat in een bruine glazen fles. Opslaan van de LAS buffer bij-20 ° C.
- De reagentia instellenin de microplate-lezer.
- Wash de injectie lijnen 2 x met 70% ethanol; Daarna, het wassen van de lijnen 2 x met water.
Opmerking: Dit is belangrijk ter voorkoming van verstoring van de resultaten van de test. - Set de LAS buffer naar de P-injector lijn (eerste injectie) en de RLS-buffer ingesteld op de M-injector-regel (tweede injectie). Deze buffers niet mengen. RLS buffer remt luciferase activiteit.
- Wash de injectie lijnen 2 x met 70% ethanol; Daarna, het wassen van de lijnen 2 x met water.
- Breng 10 µL van de geoogste monsters (uit stap 2.5.3) naar de 96-Wells witte kunststof plaat.
- De volgende instellingen toepassen op de microplate-lezer. Voor de P-injector, gebruikmaakt van een volume van 50 µL, een vertraging van 2 s, en met een maximumsnelheid van 50 µL/s. Voor de M-injector, gebruikmaakt van een volume van 50 µL, een vertraging van 2 s, en met een maximumsnelheid van 50 µL/s. een integratie-tijd van 15 s. Set de temperatuur instellen tot 25 ° C.
- Voer de microplate-lezer.
- Noteer de waarden van de luciferase activiteit (IPValue) en de waarden van de Renilla luciferase activiteit (IMValue) met behulp van de data-acquisitie-programma (Zie Tabel van materialen).
- De lijnen van de injectie te wassen na het verzamelen van gegevens (zie stap 2.6.2.1).
- De reagentia voorbereiden op het dual-luciferase assay-systeem (Zie Tabel van materialen).
- Gegevensanalyses uitvoeren.
- De genormaliseerde waarden (IPValue/IMValue) te gebruiken voor data-analyse.
- Stel de genormaliseerde waarde uit combinatie (i) [pBIND-ERαEF, pG5-Luc + pACT] met voertuig (0 nM ligand) als 1 voor de berekening van het basale niveau en de homodimerized ERα LBD niveau. De niveaus worden weergegeven als "Relatieve activiteit".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont de regeling van mogelijke reacties in de combinatie (i) en (ii) plasmide-transfected cellen van de combinatie. De experimentele resultaten worden weergegeven in Figuur 4. De activiteit van de combinatie (i) (pBIND-mERαEF, pG5-Luc + pACT) toont stimulatie door 10 nM E2 (Figuur 4A), omdat de ERα LBD de ligand-afhankelijke transactivation domein met het domeinfunctionaliteitsniveau, AF-2 bevat. Agonist (bijvoorbeeldE2) dat zich aan de ERα LBD bindt werft transcriptie coactivator(s) aan het domein AF-2. Deze gebeurtenis veroorzaakt transcriptionele activering zonder interactie met de VP16AD-fusion LBD en maakt het moeilijk om te evalueren van de LBD homodimerization activiteit wegens de niet-specifieke achtergrond (Figuur 3C). De activiteit van de combinatie (ii) (pBIND-mERαEF, pG5-Luc + pACT-mERαEF) werd waargenomen met 1 nM en 10 nM E2 behandeling (Figuur 4A). Het zou mogelijk zijn om te bepalen van de agonist-afhankelijke ERα LBD homodimerization activiteit als de concentratie van de passende ligand voor het opsporen van de activiteit van de combinatie (ii) zonder de activering van de combinatie (i) kan worden gevonden (bijvoorbeeldde toestand van 1 nM E2 in Figuur 4A). Het is dus moeilijk op te sporen van de agonist-gemedieerde ERα LBD homodimerization activiteit met behulp van de M2H-bepaling. Aan de andere kant, de activiteit van de combinatie (i) met 4OHT was hetzelfde als de controle van het voertuig (0 nM) niveau (Figuur 4B). Deze resultaten suggereren dat de AF-2 functie van ERα wordt niet geactiveerd door 4OHT. Dus, de M2H-bepaling is een haalbare optie voor het analyseren van de activiteit van de homodimerization van ERα LBD met 4OHT (Figuur 3B, 3E).
De activiteit van de combinatie van muis ERα LBD expressie plasmiden (pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF) met 4OHT was aanzienlijk hoger dan de combinatie van menselijke ERα LBD expressie plasmiden (pBIND-hERαEF + pACT-hERαEF) (Figuur 5A, 5B). Dit resultaat geeft aan dat de activiteit van de 4OHT-afhankelijke homodimerization van muis ERα LBD krachtiger dan de menselijke ERα LBD is. Bovendien, we geanalyseerd 4OHT-afhankelijke LBD homodimerization activiteit met behulp van de mens-muis F-domein-verwisseld ERα LBD expressie plasmiden, mERαEhF (muis ERα E domein met menselijke F domein) en hERαEmF (menselijke ERα E domein met muis F domein). De activiteit van de homodimerization van de mERαEhF was beduidend lager dan dat van mERαEF. In tegenstelling, was de activiteit van de homodimerization van de hERαEmF beduidend hoger dan hERαEF (Figuur 5C). Dus, lijkt het alsof het F-domein een invloed op soortspecifieke 4OHT-afhankelijke ERα LBD homodimerization activiteit heeft.
Deze resultaten stellen voor dat de ERα LBD dimerisatie activiteit van 4OHT-achtige liganden, zoals SERMs, kan worden gedetecteerd door de M2H-bepaling. Vervolgens tonen wij een mogelijke manier om de ERα LBD homodimerization activiteit van agonistic chemische stoffen te analyseren. ERα LBD dimerisatie activiteiten van E2 en diethylstilbestrol (DES) kunnen worden gedetecteerd door de M2H assay wanneer met behulp van een single-amino-zuur-gemuteerd ERα LBD (muis ERα-I362D). Deze mutatie verstoort de E2-afhankelijke coactivator werving activiteit van ERα LBD8. Combinatie (i) (pBIND-mERα-I362D, pG5-Luc + pACT) werd niet geactiveerd door E2 noch DES bij elke concentratie we geanalyseerd (Figuur 6B), die verschilde van WT ERα LBD (Figuur 6A). De ERα-I362D LBD dimerisatie activiteit van DES was krachtiger dan E2 (Figuur 6B). Deze mutant kan worden gebruikt voor een vergelijkende studie van de agonist-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit; het vereist echter verdere analyse en de karakterisatie van de biologische functionaliteit van deze mutant ERα.
Figuur 1 : Diagram van plasmiden, gebruikt voor de M2H assay. (A) dit paneel toont pG5-Luc, de verslaggever plasmide dat een GAL4-responsief element (her GAL4) gefuseerd met een luciferase codering gen bevat. (B) dit paneel toont pBIND-mERαEF, het eiwit expressie plasmide voor GAL4DBD fusion mERαEF; Renilla luciferase werkt voor het normaliseren van de transfectie efficiëntie. (C) dit paneel toont pACT-mERαEF, het eiwit expressie plasmide voor het nucleaire localisatie signaal (NLS)-gesmolten VP16AD fusion mERαEF. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Diagram van ERα LBD expressie plasmiden gebruikt in dit experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Schema van de M2H assay. Deze afbeelding laat een vertegenwoordiger van de voorwaarde van de cellen transfected met combinatie (i) plasmiden (links) en de cellen transfected met combinatie (ii) plasmiden (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Ligand-afhankelijke dimerisatie activiteit van muis ERα LBD. (A) dit paneel toont die de luciferase activiteit van de cellen transfected met combinatie (i) plasmiden (pACT, pG5-Luc + pBIND-mERαEF) of de combinatie (ii) plasmiden (pG5-Luc, pACT-mERαEF + pBIND-mERαEF) met of zonder E2. (B) dit paneel toont de luciferase activiteit van de cellen transfected met combinatie (i) plasmiden of combinatie (ii) plasmiden met of zonder 4OHT. De activiteit wordt weergegeven als het gemiddelde ± de standaarddeviatie (SD). De grafiek van paneel A heeft opnieuw zijn gemaakt van eerder gepubliceerde gegevens11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Differentiële dimerisatie activiteit van muis en mens ERα LBD met 4OHT. (A) dit paneel toont de luciferase activiteit van de cellen transfected met de combinatie van muis ERα LBD expressie plasmiden (pACT-mERαEF + pBIND-mERαEF) of de combinatie van menselijke ERα LBD expressie plasmiden (pACT-hERαEF + pBIND-hERαEF) met of zonder 4OHT. (B) de lage activiteit bereik van paneel A wordt vergroot zodat de activiteit van de dimerisatie van menselijke ERα LBD en experimentele basale niveaus (pACT pBIND-mERαEF, pACT + pBIND-hERαEF). (C) dit paneel toont de luciferase activiteit van de cellen transfected met muis-menselijke F-domein-verwisseld LBD expressie plasmiden. mERαEhF duidt muis ERα E domein gefuseerd met menselijke F domein. hERαEmF duidt menselijke ERα E domein gesmolten met muis F domein. De activiteit wordt weergegeven als de gemiddelde ± de SD. De grafieken hebben opnieuw is gemaakt van eerder gepubliceerde gegevens1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Detectie van agonist-gemedieerde ERα LBD dimerisatie activiteiten met behulp van een AF-2 gemuteerd ERα LBD. (A) dit paneel toont die de luciferase activiteit van de cellen transfected met combinatie (i) plasmiden (pACT, pG5-Luc + pBIND-mERαEF) of de combinatie (ii) plasmiden (pG5-Luc, pACT-mERαEF + pBIND-mERαEF) met of zonder liganden; E2 (rood), DES (paars). (B) dit paneel toont de luciferase activiteit van de cellen transfected met combinatie (i) plasmiden (pACT, pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D) of de combinatie (ii) plasmiden (pG5-Luc, pACT-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) met of zonder liganden; E2 (rood), DES (paars). De activiteit wordt weergegeven als de gemiddelde ± de SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin, beschreven we het protocol voor de M2H assay, zich te concentreren op de voorwaarden van de assay voor het opsporen van de activiteit van de homodimerization van ERα LBD als voorbeeld. In het algemeen, is de M2H-test niet populair voor de beoordeling van de ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit. Dit is te wijten aan de ERα LBD bezitten een transcriptionele activering functie; waarvan de activiteit stoort, in sommige gevallen, de resultaten van de M2H-bepaling. Zoals we hier laten zien, kan de M2H bepaling echter worden gebruikt voor het analyseren van de LBD dimerisatie activiteit van bepaalde stoffen die niet in de AF-2 transactivation functie van LBD (bijvoorbeeld, 4OHT, SERMs) werking. Verklein de intrinsieke activiteit van LBD (achtergrond activiteit) en wij de laagste E2-bevattende houtskool-ontdaan FBS geselecteerd uit de productie veel en warmte-geïnactiveerd houtskool-ontdaan FBS gebruikt. Deze factoren zijn belangrijk voor het succes van de M2H-bepaling met behulp van de WT ERα LBD en zwakke kernkracht activiteit worden opgespoord. Daarnaast, toonden we de ERα LBD dimerisatie activiteit van agonisten (E2 en DES) met behulp van de mERα-I362D-mutant, die de agonist-afhankelijke coactivator werving activiteit naar de AF-2 verstoort. Deze resultaten suggereren dat de M2H bepaling zou nuttiger zijn voor de beoordeling van ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit.
Op het gebied van het onderzoek van de NR, is de M2H assay gebruikt voor de beoordeling van ligand-afhankelijke coactivator of corepressor activiteit van de werving van NR LBDs9,10. Het plasmide van pBIND gefuseerd met de regio NR interactie van de cofactor wordt gebruikt voor dit type van experiment in plaats van met behulp van de pBIND-ERαEF. Dit experiment gebruikmaakt van het element van de korte eiwit met de NR interactie motief (LxxLL) in plaats van een grotere structurele domein van de coactivator. Een mogelijkheid is dat het grotere coactivator element transcriptie zonder dat de rekrutering van de VP16AD-fusion LBD activeren kan; dat de resultaten van de M2H bepaling kunnen verstoren. U kunt ook kan dit protocol worden gebruikt voor het analyseren van de bindende activiteit van een aantal stoffen aan de ERα. Bijvoorbeeld, waren de cellen transfected met pG5-Luc, pBIND-gesmolten NR interagerende motief en pACT-ERαEF plasmiden en vervolgens behandeld met diverse chemicaliën, zoals de hormoonhuishouding of potentiële hormonale therapeutics. Indien de activiteit luciferase wordt verhoogd door een chemische stof in deze test, wordt dan er voorspeld dat de chemische interactie moet worden met de ERα LBD te werven de NR interagerende motief8.
De assay M2H toont eiwit-eiwitinteractie in zoogdiercellen. Zoals we vermeld in de Inleiding, afwijken de fysiologische rol van eiwit-eiwitinteractie in een cel-type-specifieke context. M2H testen kunnen de resultaten van de eiwit-eiwit interactie activiteit in dezelfde cellulaire context die wordt gebruikt voor andere experimenten, zoals de analyse van transcriptionele activiteit. Bovendien kan het analyseren van het effect van cel-signalering modulatoren (b.v., remmers of activators van kinases) betrokken met eiwit-eiwitinteractie in de cellen. Dit is een voordeel voor de bepaling van de M2H t.o.v. andere in vitro eiwit-eiwit interactie studies.
Het moet echter worden beschouwd dat het eiwit-eiwitinteractie gedetecteerd via de M2H assay misschien niet vertegenwoordigen een directe interactie tussen twee eiwitten. Met andere woorden, is er de mogelijkheid dat cellulaire factor(en) bestaan dat zijn waardoor een verbinding tussen twee eiwitten. Indien een dergelijke overweging zich voordoet, moet de evaluatie van in vitro eiwit-eiwit interactie studies nodig, zoals de GST-fusion eiwit pulldown assay. Bovendien is het beter om te controleren van het niveau van de expressie van pBIND en pACT-plasmide-afkomstige eiwitten in de cellen om de prestaties van het test systeem te evalueren. Vooral wanneer de interactie activiteit kan niet worden gedetecteerd, wordt de informatie van de expressie eiwitniveaus helpt om te bepalen van de oorzaak van het resultaat. Anti-Gal4DBD antistof en anti-VP16AD antistof kunnen worden gebruikt voor een westelijke vlekkenanalyse.
Als het laboratorium de experimentele opstelling voor luciferase verslaggever testen, die kan worden gebruikt heeft voor het analyseren van de activiteit van de transcriptie van regelgevende elementen of factoren te reguleren, is het heel simpel uit te voeren van de M2H-bepaling. De assay M2H is een voordelige additieve methode voor transcriptionele verordening studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
De auteurs bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript en Tanner Jefferson Drs. Sueyoshi en Wang op het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) voor het uitvoeren van de procedures op de video. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1ZIAES070065 (naar KSK) vanuit de divisie van intramurale onderzoek naar de NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. , Humana Press. (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
