Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.
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Articolo metodologico
Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Arterie cerebrali e loro rispettivi microcircolazione fornire ossigeno e sostanze nutritive per la regolazione del cervello tramite flusso sanguigno. Cellule endoteliali linea del lume dei vasi sanguigni e modifiche dei comandi in diametro vascolare come necessario per soddisfare la richiesta metabolica dei neuroni. Vie di segnalazione endoteliale-dipendente primarie di hyperpolarization di potenziale di membrana (Vm) e ossido nitrico in genere operano in parallelo per mediare la vasodilatazione e quindi aumentare il flusso sanguigno. Anche se parte integrante del coordinamento vasodilatazione sopra parecchi millimetri di lunghezza vascolare, componenti di hyperpolarization endotelio-derivato (EDH) sono stati storicamente difficili da misurare. Questi componenti di EDH comportano intracellulare Ca2 + [Ca2 +]io aumenta e la successiva attivazione dei piccoli e intermedi conduttanza Ca2 +-attivato K+ (SKCa/IKCa) canali.
Qui, presentiamo un'illustrazione semplificata dell'isolamento di endotelio fresco da arterie cerebrali del mouse; misurazioni simultanee di endoteliale [Ca2 +]i e Vm utilizzando Fura-2 fotometria e intracellulare degli elettrodi affilati, rispettivamente; e un continuo superfusione di soluzioni saline e agenti farmacologici in condizioni fisiologiche (pH 7.4, 37 ° C). Arterie cerebrali posteriori dal cerchio di Willis vengono rimossi senza il comunicante posteriore e le arterie basilare. Digestione enzimatica di segmenti arteriosi cerebrali posteriori puliti e successiva triturazione facilita la rimozione del adventitia, nervi perivascolari e cellule di muscolo liscio. Risultanti posteriori cerebrali arteriosi endoteliali "tubi" sono quindi protetti sotto un microscopio ed esaminati usando una macchina fotografica, fotomoltiplicatore, elettrometri e uno o due mentre sotto superfusione continua. Collettivamente, questo metodo può misurare simultaneamente variazioni endoteliali [Ca2 +]i e Vm in luoghi discreti cellulare, oltre alla diffusione di EDH attraverso giunzioni di gap fino a distanze di millimetro lungo l'intatta endotelio. Questo metodo è previsto un analisi di alto-rendimento delle funzioni endoteliali cerebrali sottesi ai meccanismi di regolazione del flusso sanguigno nel cervello normale e malato.
Introduzione
Il flusso sanguigno in tutto il cervello è regolato dal coordinamento di vasodilatazione tra cerebrale arterie ed arteriole in reti vascolari1. Cellule endoteliali che allineano i cambiamenti di comando resistenza cerebrale arterie di diametro vascolare come necessaria a soddisfare la richiesta metabolica di neuroni1,2,3. In particolare, durante il hyperpolarization endotelio-derivato (comunemente noto come EDH), intracellulare di Ca2 + ([Ca2 +]i) e i segnali elettrici in cellule endoteliali vasodilatazione delle coordi....
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Protocollo
Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutte le cure degli animali utilizzare e protocolli sono approvati dalla istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) ed eseguite in accordo con del Consiglio nazionale delle ricerche "guida per la cura e l'uso di Animali da laboratorio "" (8th Edition, 2011) e le linee guida ARRIVE. Il IACUC della Loma Linda University ha approvato tutti i protocolli utilizzati per questo manoscritto per topi C57BL/6 maschi e femmine (fascia d'età: 3-30 mo).
1. attrezzature e materiali
Nota: Dettagli dei materiali necessa....
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Risultati
La dimostrazione schematica del protocollo descritto sopra è illustrata nelle figure allegate. Un cervello isolato da un giovane maschio adulto C57BL/6N topo (5 mesi) è mostrato in Figura 1A. Arterie cerebrali posteriori sono accuratamente isolate dal cerchio di Willis, rimosso senza tessuto connettivo e tagliato in segmenti (Figura 1B-D). Da segmenti arteriosi parzialmente digeriti, il tubo endoteliale intatto è.......
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Discussione
Alla luce dei recenti sviluppi6,15,16,17, ora dimostriamo il metodo per isolare endotelio arterioso cerebrale del mouse in preparazione per la misura simultanea della [Ca2 +] i e Vm sottostante EDH costantemente per ~ 2 h a 37 ° C. Anche se tecnicamente difficile, possiamo misurare la cellula--cellula che accoppiamento pure (Vedi riferimento6
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Charles Hewitt per l'eccellente assistenza tecnica durante la creazione di attrezzature e forniture necessarie per i protocolli attuali. Ringraziamo la d. ssa Sean M. Wilson e Christopher G. Wilson, dal centro per biologia perinatale, LLU per averci fornito un ulteriore microscopio invertito e l'elettrometro, rispettivamente. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) e nuovi fondi di Start-up facoltà di Loma Linda University School of Medicine. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Glucosio | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenasi (Miscela di tipo H) | Sigma | C8051 | |
| Ditioeritritolo | Sigma | D8255 | |
| Papaina | Sigma P4762 | ||
| Elastasi | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Ioduro di propidio | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM colorante | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Refrigeratore a ricircolo (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Superfusione in plexiglas camera | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Vetrino coprioggetto inferiore (2.4 &volte; 5,0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Piattaforma in alluminio anodizzato (diametro: 7,8 cm) | Warner Instruments | PM6 o PH6 | |
| Palco compatto in alluminio | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipolatore | Siskiyou | Stereomicroscopi MX10 | |
| Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | ||
| Schott, Magonza, Germania & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | ||
| Nikon microscopio invertito Nikon | Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Obiettivi a contrasto di fase | Nikon Instruments Inc | ( Ph1 DL; 10 volte e 20X) | |
| Obiettivi fluorescenti | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor) | |
| Microscopio invertito Nikon Nikon | Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Controller per micropompa a microsiringa (Micro4) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Tabella di isolamento dalle vibrazioni | Produzione tecnica, Peabody, MA, USA& | nbsp; Micro-g | |
| Amplificatori Molecular | Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Generatore di funzioni | EZ Digital, Seoul, Corea del Sud | FG-8002 | |
| Sistema di acquisizione dati | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA& | nbsp; Oscilloscopio a memoria digitale BM-A-TM | ||
| Tektronix, Beaverton, Oregon, USA& | nbsp; Interfaccia per sistema a fluorescenza TDS 2024B | ||
| , lampada ARC + alimentatore, hyperswitch, dispositivi | molecolari PMT, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Riscaldatore in linea Warner Instruments | TC-344B o C | ||
| Warner Instruments | SH-27B | ||
| Warner Instruments | VC-6 | ||
| Valvola di controllo del flusso in linea | Warner Instruments | Estrattore elettronico FR-50 | |
| Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 o P-1000 | ||
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, Stati Uniti | Tubi | |
| (triturazione) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| (pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| (elettrodi affilati) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| (0,22 &; m) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Piastra di Petri in vetro + antracite Sylgard | Living Systems Strumentazione, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Forbici stile Vannas (3 mm e 9,5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Forbici lame da 3 e 7 mm | Fine Science Tools (o FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 e 15000-00 | |
| Pinze affilate a punta fine | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
Riferimenti
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M.
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Ristampe e permessi
