Method Article

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

DOI:

10.3791/58840

⸱

January 16th, 2019

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השומנים bilayers מספקים פלטפורמה ניסיוני ייחודי ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים, המאפשר הבחינה של הערוץ-הממברנה אינטראקציות תחת קרום שונים יצירות השומנים. ביניהם, bilayer ממשק ' droplet ' צברה פופולריות; עם זאת, גודל ממברנה גדולות מעכבת את ההקלטה של רעש רקע חשמל נמוכה. הקמנו בועה קשר bilayer (CBB) בשיטה המשלבת את היתרונות של מישורי ליפידית ושיטות תיקון-קלאמפ, כגון היכולת להשתנות הרכב השומנים, לתמרן את המכניקה bilayer, בהתאמה. באמצעות הגדרת לניסויים תיקון קונבנציונלי-קלאמפ, מבוסס CBB ניסויים ניתן בקלות לבצע. בקצרה, פתרון אלקטרוליט ב פיפטה מזכוכית הוא התפוצץ לתוך שלב בממיסים אורגניים (hexadecane), הלחץ פיפטה נשמר להשיג מידה קצף יציב. הבועה רצוף באופן ספונטני שומנים חד שכבתי (ליפידים טהור או שומנים מעורבים), אשר מסופק מן ליפוזומים הבועות. בשלב הבא, שני מצופה טפט בועות (~ 50 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטות זכוכית מעוגנות bilayer בשורה. הקדמה של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך הבועה מוביל שילוב של ערוצים bilayer, המאפשר הקלטה הנוכחי ערוץ אחד עם יחס אות לרעש לזו של תיקון-קלאמפ הקלטות. CBBs להרכב השומנים אסימטרי נוצרות בקלות. CBB מתחדש שוב ושוב על ידי לפוצץ את הבועות הקודם ויוצרים חדשים. לפליטת כימיים שונים (למשל, ממברנה זלוף, bilayer המתח) ניתן לגזור על CBBs. שעל זה, אנו מציגים את ההליך הבסיסי לשימוש CBB היווצרות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור יון ערוצי, קרום התא הוא לא פשוט חומר התומך אלא שותף ליצירת יון שטף. מבחינה תפקודית, הקרום מבודד חשמלי ביון אשר מוטבעים ערוצים, כל קרום התא מוקנות עם קרום מנוחתו פוטנציאליים. כמקובל, ממברנה שרירותי פוטנציאל שהוטל מ מעגל חיצוני שבו נמדדה זרם חשמלי דרך הערוצים. זו הערכה כמותית של שטף יון-פוטנציאל ממברנה שונים חשף המאפיינים המולקולריים של ערוצי אלה, כגון יון סלקטיבי הסתננות שלהם פונקציות חסימה1,2. פלטפורמת ממברנה ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים היא קרום התא או קרום bilayer השומנים. מבחינה היסטורית, הקלטות הנוכחי חשמל ערוץ אחד בוצעו לראשונה השומנים bilayers3,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מכינים ליפוזומים

  1. לפזר פוספוליפידים (למשל, 10 מ ג אבקת) ב כלורופורם-ריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"ג/מ"ל).
  2. להתנדף כלורופורם.
    1. המקום הפתרון פוספוליפיד הבקבוק העגול-התחתון, ערכת אותו על המאדה (ראה טבלה של חומרים) מחובר גליל גז2 N. סובב את הבקבוק תחת זרימה2 N בטמפרטורת החדר עד סרט דק פוספוליפיד מופיע (לאחר ~ 30 דקות).
    2. למקם את הבקבוק פתוח desiccator מחובר אליו משאבת ואקום. באמצעות המשאבה ואקום, תשאף הפנימי של desiccator במשך מספר שעות כדי להסיר את הכלורופורם ביסודיות.
  3. להוסיף אמצעי אחסון המתאים של פתרון אלקטרוליט הבקבוק, להשעות את פוספוליפיד להשיג 2 מ"ג/מ"ל פוספ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CBB טיפוסי היה בקוטר של 50 מיקרומטר (איור 56) והיה קיבול הממברנה ספציפי ב hexadecane µF 0.65/cm2. גודל הבועה נשלטה באופן שרירותי על ידי לחץ אינטרה-הבועה. כאשר בועות קטנות נחוצים להקלטות רעש נמוכה, הקוטר טיפ צריך להיות correspondingly קטן. לדוגמה, עבור גודל בועה של 50 מיקרומטר בקוטר, הקוטר טיפ צריך להיות 30 מיקרומטר.

ברגע CBB יצרו, מולקולות ערוץ תמיסה מימית או של ליפוזום ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה CBB של היווצרות ליפיד bilayer מבוסס על העיקרון של טיפונת מים בתוך שמן על ידי חד שכבתי20. טכנית, נהלי ויוצרים CBBs קלים, במיוחד עבור תיקון-קלאמפ חוקרים, שאינם בקיאים לתמרן את micropipettes זכוכית. הגדרת אלקטרופיזיולוגיות עבור המלחציים תיקון משמש ברצון CBB כאשר שני סימולטורי פיפטה עם microinjectors זמינים. מצד שני, מכיוון CBB יורש של PLB קונבנציונאלי, אשר כמות גדולה של ידע physicochemical כבר נצבר8, זה הרקע וכן ידע בכימיה משטח38 הוא מועיל עבור הפ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות מריקו Yamatake, מסקו הטקשימה לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על-ידי KAKENHI גרנט מספרים 16H 00759 ו-17 H 04017 (וכו).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אזולקטין (L-α-פוספטידילכולין, סוג IV-S)Sigma-AldrichP3644
ממיר A/DמולקולרייםDigidata1550A
Ag/AgCl אלקטרודהWarner Instruments64-1317
סוניקטוראמבטיה ברנסוןM1800H-J
מצלמהHamamatsu PhotonicsC11440-10C
זכוכית נימיהרווארד מכשיר30-0062
HepesDojindo342-01375
חור SlideglassMatsunami זכוכיתS339929
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX73
שולחן בידודHerzTDI-86LA(Y)2
מיקרו InjenctorNarishigeIM-11-2
מיקרו מניפולטורNarishigeEMM
MicroforgeNarishigeMF-830
מיקרופיפטה
n-HexadecaneNacalai07819-32
מגבר מהדק תיקוןHEKAEPC800
חולץ פיפטותSutter Instrument Co.P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850457-POPE
(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		Avanti Polar Lipids850757-POPG
(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )Avanti Polar Lipids840457
אשלגן כלוריNacalai28514-75
מאייד סיבוביIwakiREN-1000
חומצה סוקסיניתNacalai32402-05
משאבת ואקוםBuchiV-100
חלקים מחזיק

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Contact Bubble BilayerLipid Bilayer FormationPatch Clamp MethodMembrane Vibration AnalysisGlass Pipette PreparationPhospholipid SuspensionHexadecane InterfaceBubble Size ControlChannel ReconstitutionSignal To Noise Ratio

Related Articles