Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Résumé

Ici, nous présentons un protocole visant à préparer les cellules individuelles de thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate afin d’étudier ces cellules à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce protocole a été utilisé pour la détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs utilisant l’écoulement cytometry.

Résumé

Notre système immunitaire se compose d’un nombre et une variété de cellules immunitaires, dont les lymphocytes T régulateurs de cellules (Treg). Les cellules Treg peuvent être divisés en deux sous-ensembles, les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus et accessoirement induite par les cellules Treg (pTreg). Elles sont présentes dans les différents organes de notre corps et se distingués par des marqueurs spécifiques, tels que Hélios et Neuropiline 1. Il a été signalé que les cellules tTreg sont fonctionnellement plus répressive que les cellules pTreg. Par conséquent, il est important de déterminer la proportion des cellules tTreg et pTreg dans les enquêtes sur les populations de cellules hétérogènes. Ici, nous avons recueilli glandes du thymus, ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques et rate de normoglycémiques souris diabétiques non obèses pour distinguer les cellules de tTreg de pTreg des cellules à l’aide de cytométrie en flux. Nous avons préparé manuellement des suspensions de cellules simples de ces organes. Fluorochrome conjuguées de surface CD4, CD8, CD25 et Neuropiline 1 anticorps ont été utilisés pour colorer les cellules. Ils étaient conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été colorées avec les anticorps de Foxp3 et Helios intracellulaires fluorochrome conjugué. Ces marqueurs ont été utilisées pour caractériser les deux sous-ensembles de cellules Treg. Ce protocole montre un moyen simple mais pratique pour préparer des cellules individuelles de thymus murin, drainage des ganglions lymphatiques et la rate pancréas et utilisez-les pour cytométrie ultérieures.

Introduction

Les lymphocytes T (Treg) régulateurs sont critiques pour l’homéostasie du système immunitaire. Les cellules Treg sont définies par l’expression des antigènes de surface CD4 et CD25 et le facteur de transcription forkhead boîte P3 (Foxp3)^1,2,3. Tout d’abord, Sakaguchi et coll. ont montré que CD25 est constitutivement exprimé sur les cellules T suppresseur souris⁴, qui prévoit une observation pionnier pour l’identification des cellules Treg humaines. Les cellules Treg jouent un rôle central dans la tolérance immunitaire, en exerçant une capacité suppress....

Protocole

Le comité local d’éthique animale à l’Université d’Uppsala a approuvé l’expérimentation animale.

1. récolte d’organes d’animaux

1. Sacrifier les souris par dislocation cervicale.
2. Placez du thymus glandes et rate en flacons de 20 mL à scintillation ou tubes coniques 15 mL contenant 5 mL de Hanks´ équilibré de solution saline (HBSS). PDLNs lieu de micro-tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu RPMI 1640. Utilisez le thymus entier et rate et tous les PDLNs.
   Remarque : Organes devraient être gardés sur glace tout au long de la procédure et l’enquêteur doit essayer d’être rapide lors de la préparation des sus....

Résultats

Pour étudier l’expression des Nrp1 et Helios sur les cellules tTreg et pTreg, nous avons préparé des cellules individuelles de glandes thymiques, PDLNs et la rate des souris NOD normoglycémiques et eux colorées avec les marqueurs de cellules Treg CD4, CD25 et Foxp3, Helios Nrp1 pour la cytométrie en flux analyse. Les résultats ont été analysés comme le montre le représentant gating stratégies (Figure 1). Nous avons constaté que la proportion de cellules Helio.......

Discussion

Dans cette étude, nous avons isolé des cellules individuelles de glandes thymiques, des PDLNs et des rates de souris NOD et examiné l’expression d’Hélios et Nrp1 CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg cellules à l’aide de cytométrie en flux. Dans la présente étude, des souris NOD ont été utilisés, qui est un modèle murin de diabète de type 1. Dans une étude précédente, nous avons utilisé le type sauvage souches de souris CD-1 et les souris C57BL/6 pour étudier si Helios ou Nrp1 est un meille.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NOD souris Panure			maison
HBSS	Statens veterinä ; rmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contient un concentré de fixation/perméabilisation, un diluant de fixation/perméabilisation et un tampon de perméabilisation (10x)
eBioscience Tampon de coloration par cytométrie en flux	ThermoFisher	00-4222-26
Anticorps monoclonal CD4 (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
Anticorps monoclonal CD25 (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen  ; APC-H7 Rat anti-souris CD8a	BD Biosciences	560182
Souris Neuropiline-1 APC-conjugué Anticorps	R& D Systems	FAB5994A
FOXP3 Anticorps monoclonal (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Bleu Pacifique Anticorps Helios BioLegend		137220
Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre cellulaire Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µ ; m maille de nylon est incorporée dans le capuchon à pression à double position
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Microtube 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Flacons à scintillation jetables	WHEATON
Cytométrie en flux	BD
Logiciel d’analyse par cytométrie en flux	Inivai Technologies	Flowlogic