Découverte de roman-fleuve de génomique soustractive

Kathryn C. Asalone; Megan M. Nelson; John R. Bracht

doi:10.3791/58877

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Article de méthode

Découverte de roman-fleuve de génomique soustractive

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DOI :

10.3791/58877

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25 janvier 2019

Kathryn C. Asalone¹ , Megan M. Nelson¹ , John R. Bracht¹

¹Biology Department, American University

Dans cet article

Résumé

Le but du présent protocole est d’utiliser une combinaison de calcul et de la recherche de banc pour trouver de nouvelles séquences qui ne peuvent être facilement séparés d’une séquence co purificatrice, qui peut-être n'être que partiellement connue.

Résumé

Soustractive génomique peut être utilisé dans des recherches dont le but est d’identifier la séquence d’un gène, protéine ou une région qui est incorporée dans un contexte plus large de génomique. Soustractive génomique permet à un chercheur d’isoler une séquence cible d’intérêt (T) en séquençage complet et en soustrayant les éléments génétiques connus (référence, R). La méthode peut être utilisée pour identifier de nouvelles séquences comme les mitochondries, chloroplastes, virus, ou cellules germinales restreinte de chromosomes et est particulièrement utile lorsque T ne peut pas être facilement isolé de R. commençant par les données génomiques complètes (R + T), la méthode utilise base locale alignement Search Tool (BLAST) contre une séquence de référence, ou séquences, pour supprimer les séquences connues correspondants (R), laissant derrière lui la cible (T). Pour la soustraction fonctionner au mieux, R doit être un projet relativement complet auquel il manque T. Depuis les séquences restantes après soustraction sont testés à travers quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R n’a pas besoin d’être terminés pour que la méthode fonctionne. Ici nous relions computational étapes avec des étapes expérimentales dans un cycle qui peut être itéré selon les besoins, séquentiellement, supprimant plusieurs séquences de référence et affiner la recherche de T. L’avantage de la génomique soustractive, c’est qu’une séquence complètement nouvelle cible soient reconnaissables même dans les cas où la purification physique est difficile, impossible ou coûteux. L’inconvénient de la méthode est trouver une référence appropriée pour la soustraction et obtenir T-positifs et négatifs des échantillons pour les tests de qPCR. Nous décrivons notre implémentation de la méthode dans l’identification du premier gène du chromosome germline restreints de zebra finch. Dans ce cas de filtrage informatique impliqué trois références (R), retirés dans l’ordre pendant trois cycles : un assemblage génomique incomplète et données génomiques brutes données transcriptomiques.

Introduction

Le but de cette méthode est d’identifier une nouvelle cible (T) séquence génomique, ADN ou ARN, d’un contexte génomique, ou d’une référence (R) (Figure 1). La méthode est plus utile si la cible ne peut pas être physiquement séparée, ou il serait coûteux de le faire. Seuls quelques organismes ont fini parfaitement génomes pour la soustraction, donc une innovation majeure de notre méthode est la combinaison de calcul et les méthodes de banc dans un cycle permettant aux chercheurs d’isoler les séquences cibles lorsque la référence est imparfaite, ou un projet génome d’un organisme non-modèle. À la fin d’un cycle, qPCR test sert à déterminer ....